油茶蒲多糖的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

李佳佳，羅思源，丁春邦，陳 濤，周莉君

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安 625014)

油茶(Camelliaoleifera)屬山茶科山茶屬植物，是我國(guó)特有的油料樹(shù)種，具有悠久的種植歷史，也是世界四大木本食用油料作物之一，主要利用其茶籽榨取茶油[1].茶油中含有豐富的不飽和脂肪酸和多種酚類化合物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富[2-3].由于其具有良好的抗氧化、防紫外輻射、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等多種活性，被譽(yù)為“東方橄欖油”[4-5].

近年來(lái)，國(guó)家大力推進(jìn)油茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，經(jīng)國(guó)務(wù)院批準(zhǔn)頒布了全國(guó)茶油產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃，規(guī)劃提出，到2020年，全國(guó)油茶產(chǎn)量將達(dá)到250萬(wàn)t[6].但提取油脂后的副產(chǎn)物也隨之增多，油茶蒲便是其主要的一個(gè)副產(chǎn)物.油茶蒲即油茶果殼，占油茶果濕重的60%以上，在油茶產(chǎn)業(yè)中常作為燃料或直接作為廢棄物處理，未被有效利用.研究表明，油茶蒲中含有酚類、萜類、黃酮以及多糖等多種物質(zhì)[7-9]，其提取物已被證實(shí)具有抗氧化、抗腫瘤、降血脂以及減肥等功效[10-12].據(jù)報(bào)道，油茶蒲多酚對(duì)人體細(xì)胞DNA損傷有顯著的保護(hù)作用[13]，其黃酮及皂苷類物質(zhì)具有較好的抑菌作用[14-15]，但關(guān)于其多糖的活性卻鮮有報(bào)道.目前關(guān)于油茶蒲多糖的研究主要集中在提取方面，且提取率相對(duì)較低[16].為了提高資源綜合利用率，對(duì)油茶蒲多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化并探究其活性顯得十分必要.

因此本實(shí)驗(yàn)以油茶果蒲為材料，對(duì)熱水提取法提取油茶蒲多糖的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并探討其體外抗氧化活性，旨在為保護(hù)環(huán)境、進(jìn)一步提高油茶資源利用率提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶蒲：四川省榮縣油茶基地提供，經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院丁春邦教授鑒定.

無(wú)水乙醇、石油醚、苯酚、硫酸、葡萄糖、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、PBS(磷酸緩沖液)、鐵氰化鉀、TCA(三氯乙酸)、三氯化鐵、H2O2、水楊酸、硫酸亞鐵、抗壞血酸均購(gòu)自成都科龍?jiān)噭S，所有試劑均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平(BT-124S)：德國(guó)Sartorius公司；實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(RM-220)：四川沃特爾科技發(fā)展有限公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Allegra X-15R)：貝克曼庫(kù)爾特有限公司；高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)Thermo Fisher公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-2000B)：上海亞榮生化儀器廠；酶標(biāo)儀(Specra Max M2)：美國(guó)Molecular Devices公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 材料預(yù)處理 將油茶蒲放于60 ℃恒溫烘箱干燥4 d后，用粉碎機(jī)粉碎并過(guò)40目篩.將油茶蒲粉末放于索式提取儀中經(jīng)石油醚(60～90 ℃)回流8 h脫脂后干燥備用.

1.3.2 油茶蒲多糖的提取與測(cè)定 稱取預(yù)處理后油茶蒲粉末，按一定液料比加入蒸餾水，在相應(yīng)溫度下提取一定時(shí)間后6 000 r·min-1下離心10 min.采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定上清液多糖含量[17]，計(jì)算提取率.合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，加入3 倍體積無(wú)水乙醇過(guò)夜沉淀，后離心取沉淀，冷凍干燥得粗多糖.計(jì)算公式為：

(1)

式中，C為樣品多糖濃度μgmL-1；N為稀釋倍數(shù)；V為樣品體積，單位為mL；m為油茶蒲粉末質(zhì)量(g).

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1) 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

2) 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響

3) 液料比對(duì)多糖提取率的影響

1.3.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選取提取過(guò)程中對(duì)得率影響較大的變量因素最佳范圍，采用中心組合試驗(yàn)法，設(shè)計(jì)液料比A(mLg-1)、提取溫度B(℃)、提取時(shí)間C(min)為3個(gè)變量因素3水平的試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)4次，以茶蒲多糖提取率為響應(yīng)值(Y)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1.應(yīng)用Box-Behnken軟件對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析.

表1 響應(yīng)面分析因素與水平Tab.1 Response surface analysis factors and levels

1.3.5 油茶蒲多糖體外抗氧化活性測(cè)定

1) DPPH自由基清除率測(cè)定

根據(jù)徐洲[18]等人的方法，略作修改測(cè)定油茶蒲多糖的DPPH自由基清除能力.取一定量的油茶蒲粗多糖用蒸餾水溶解為2.0 mgmL-1的母液，并稀釋為0～2.0 mgmL-1相應(yīng)濃度.取30 μL油茶蒲多糖溶液加入170 μL DPPH(0.4 mmol·L-1)乙醇溶液于96孔板中，黑暗處反應(yīng)10 min，測(cè)定517 nm吸光值，計(jì)算DPPH自由基清除率，公式如下(陽(yáng)性對(duì)照為Vc)：

DPPH自由基清除率(%)=(1-A1/A0)×100,

(2)

式中,A1為樣品吸光值，A0為蒸餾水代替樣品的吸光值.

2) 總還原能力測(cè)定

根據(jù)李粉玲[19]等人的方法，略作修改測(cè)定油茶蒲多糖的總還原能力.取0.2 mL多糖溶液，加入0.5 mL PBS(0.2 mmol·L-1)和0.5 mL鐵氰化鉀(1%，m/V)，混勻，于50 ℃水浴鍋中孵化20 min.加入0.5 mL TCA (10%，m/V)后迅速冷卻5 min，取0.5 mL 上層清夜加入0.5 mL蒸餾水和0.1 mL FeCl3(0.1%，m/V)混勻，在700 nm處測(cè)定吸光值，以多糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制總還原能力圖.以Vc做陽(yáng)性對(duì)照.

1.3.6 數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)組均重復(fù)4次，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示(Mean±SD)，采用Graphpad Prism 6.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并作圖.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)由苯酚—硫酸法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，其回歸方程為：y=0.008477x+0.1027；R2=0.991.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響 由圖2可以看出，多糖提取率在60 min到120 min內(nèi)呈逐漸上升趨勢(shì)，并在提取時(shí)間為120 min時(shí)達(dá)到最高值，之后略有下降后趨于平緩.表明在一定范圍內(nèi)增加提取時(shí)間可以提高多糖的提取率，但提取時(shí)間達(dá)到150 min后，多糖提取率相對(duì)降低，可能是由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，多糖結(jié)構(gòu)被破壞而影響提取率[20].因此，結(jié)合多糖提取率以及省時(shí)的考慮，選擇提取時(shí)間120 min為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化.

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharides

2.2.2 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響 由圖3可知，在提取溫度為60 ℃到80 ℃之間時(shí)，多糖提取率逐漸增加，在80 ℃以后多糖提取率略有下降.表明適當(dāng)?shù)臒崽幚韺?duì)提取效率起著正面的作用，較高的溫度可以提高多糖的產(chǎn)量，但過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致多糖水解[21].結(jié)合該提取結(jié)果以及節(jié)能的考慮，確定80 ℃為響應(yīng)面中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化.

圖3 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

2.2.3 液料比對(duì)多糖提取率的影響 由圖4可知，在液料比10 mL·g-1到30 mL·g-1條件下，多糖提取率沒(méi)有明顯變化，但當(dāng)液料比大于30 mL·g-1后多糖提取率顯著下降.可見(jiàn)當(dāng)液料比低于30 mL·g-1時(shí)，多糖的提取率受影響較小.當(dāng)液料比大于30 mL·g-1時(shí)提取率降低，有可能是因?yàn)槿軇┻^(guò)多，在一定的加熱時(shí)間內(nèi)，溶劑溫度上升速度減慢，多糖未被充分浸出[22].因此，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，確定30 mL·g-1作為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化.

圖4 液料比對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of polysaccharides

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化多糖提取

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示.

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Box-Behnken test design and results

2.3.2 回歸模型建立及方差分析 利用 Design-Expert 10軟件對(duì)表2的結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到擬合全變量二次回歸方程：Y=10.39+0.66A+0.63B+0.12C+0.10AB+0.37AC-0.38BC-0.76A2-0.68B2-0.69C2.

2.3.3 響應(yīng)面分析 采用Design Expert 10軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析，并作出三維圖和等高線圖.利用三維響應(yīng)面圖形直觀地展示回歸方程，可以更深入地理解每個(gè)被測(cè)變量與響應(yīng)之間的關(guān)系，以及任意兩個(gè)變量之間的相互作用.二維等高線圖可顯示變量間的相互作用是否顯著.橢圓等高線圖表示變量之間的相互作用是顯著的.相反，圓形等高線圖表示變量間相互作用可以忽略不計(jì).如圖5與圖7中等高線變化較為稀疏，而圖6中等高線變化相對(duì)密集，說(shuō)明提取時(shí)間與液料比的交互作用對(duì)多糖的提取率影響較大.

通過(guò)分析確定出最佳提取工藝條件為：提取時(shí)間150 min，提取溫度為84.83 ℃，液料比為32.2 mLg-1，此時(shí)油茶蒲多糖得率理論值10.52%.為方便試驗(yàn)的實(shí)際操作，將最佳提取條件調(diào)整為液料比為32 mLg-1，提取時(shí)間150 min，提取溫度為85 ℃，進(jìn)行4次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，在此條件下油茶蒲多糖的得率平均值為10.49 ± 0.21%.結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)響應(yīng)面回歸方程擬合出的理論值與實(shí)際值相差不大，與理論值符合，驗(yàn)證了方程的可靠性.且提取率相較于陳景斯[23]等人的乙醇提取工藝，增加了近一倍.

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Analysis of variance results

2.4 體外抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 從圖8中可見(jiàn)，油茶蒲多糖對(duì)DPPH自由基清除率最高為90 %，與Vc陽(yáng)性對(duì)照相比，在0.5 mgmL-1濃度下，Vc對(duì)DPPH的清除率強(qiáng)于油茶蒲多糖，但當(dāng)油茶蒲多糖濃度大于0.5 mgmL-1時(shí)，對(duì)DPPH自由基的清除率接近Vc對(duì)DPPH自由基的清除率.本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明油茶蒲多糖也具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力.

圖5 提取時(shí)間和溫度對(duì)多糖得率交互作用的3D響應(yīng)面(a)和等高線(b)Fig.5 3D response surface (a) and contour line (b) of interaction between extraction time and temperature to polysaccharide yield

圖6 提取時(shí)間和料液比對(duì)多糖得率交互作用的3D響應(yīng)面(a)和等高線(b)Fig.6 3D response surface (a) and contour line (b) of interaction between extraction time and ratio of liquid-feed to polysaccharide yield

圖7 提取溫度和料液比對(duì)多糖得率交互作用的3D響應(yīng)面(a)和等高線(b)Fig.7 3D response surface (a) and contour line (b) of interaction between extraction temperature and ratio of liquid-feed to polysaccharide yield

圖8 多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.8 The scavenging effect of polysaccharide from Camellia oleifera fruit shells on DPPH radical

2.4.2 總還原能力 從圖中可以看出，隨著油茶蒲多糖濃度的增加，其吸光值也隨之增加.研究表明還原能力與抗氧化活性之間有密切關(guān)系[24].當(dāng)濃度達(dá)到1.4 mg·mL-1時(shí)，在700 nm處吸光值高于1.3，與同濃度的Vc吸光值相近.顯示出油茶蒲多糖通過(guò)自身的還原作用給出電子的能力(即還原力)較大，具有較強(qiáng)的抗氧化活性.并且隨著多糖濃度的增加，其還原能力增強(qiáng)，符合濃度劑量效應(yīng).

圖9 多糖的總還原能力Fig.9 The total reductive ability of polysaccharide from Camellia oleifera fruit shells

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用熱水浸提法提取油茶蒲多糖，采用苯酚-硫酸法來(lái)測(cè)定多糖含量，具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn).采用響應(yīng)面法對(duì)油茶蒲多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以油茶蒲多糖含量為響應(yīng)值，料液比、提取溫度和提取時(shí)間為考察因素，建立二次回歸模型，并采用Design-Expert軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析.最終得出油茶蒲多糖的最優(yōu)提取條件為液料比為32 mL·g-1，提取時(shí)間150 min，提取溫度為85 ℃，油茶蒲多糖最高提取率可達(dá)到10.49±0.21%.經(jīng)四次重復(fù)驗(yàn)證，該工藝合理，穩(wěn)定可靠.體外抗氧化結(jié)果表明油茶蒲多糖能夠較好的清除DPPH自由基，具有較強(qiáng)的總還原能力.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為油茶蒲多糖的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ).