人星狀病毒核酸檢測方法的建立及應(yīng)用

桑筱筱，操燕明，楊艾玲，王敬，杜松云

（武漢華夏理工學(xué)院，湖北武漢 430223）

人星狀病毒（human astrovirus，HAstV）是導(dǎo)致嬰幼兒、老年人以及免疫功能缺陷者腹瀉的重要病原體之一[1-2]。Madeley等人在1975年首次從腹瀉嬰兒糞便中分離得到球形、直徑為28～35 nm、無包膜、電鏡下表面結(jié)構(gòu)呈星形且表面有5～6個(gè)星狀突起的病毒顆粒，因此命名為星狀病毒[3]。HAstV感染率僅次于輪狀病毒和諾如病毒，檢出率在2%～10%[4]。HAstV是無包膜單股正鏈RNA病毒，基因組全長約 7 kb，包含 3個(gè)開放讀碼框（ORFla、ORFlb、ORF2），其中ORFla和ORFlb編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2編碼衣殼蛋白。根據(jù)ORF2的348 bp核苷酸片段差異可將人星狀病毒劃分HAstV 1～8基因型，與其血清型的劃分是一致的[5-6]。人星狀病毒起初在實(shí)驗(yàn)室的診斷主要利用電鏡鑒定以及免疫學(xué)方法，但準(zhǔn)確度不夠，這些檢測方法在一定程度上限制了為腹瀉患者提供最佳的初始診斷和后續(xù)的治療。因此，需要一種可靠、快速的診斷工具。實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）已經(jīng)取代了病毒培養(yǎng)和血清學(xué)等不敏感和耗時(shí)的技術(shù)，用于診斷病毒性胃腸道疾病。目前，HAstV的診斷依賴于分子診斷，用RT-PCR方法檢測病毒RNA。因此，開發(fā)一種經(jīng)濟(jì)有效的RT-qPCR方法，用于檢測臨床標(biāo)本中的HAstV，這對優(yōu)化臨床管理至關(guān)重要，可以減少不必要的抗生素使用，并允許在適當(dāng)情況下使用抗病毒藥物。

1 材料和方法

1.1 臨床標(biāo)本

研究采用的高溫滅活人星狀病毒上清液來源于武漢大學(xué)病毒國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，共計(jì)12份；對象為2018年12月—2019年6月就診的腹瀉感染患兒195例，均為急性腸胃炎感染患者。

1.2 病毒核酸的提取

提取試劑為德國Qiagen公司的QIAamp min Elute virus spin kit，根據(jù)試劑盒的說明書操作，用200 μL臨床標(biāo)本提取病毒核酸，用100 μL洗脫液洗脫，如24 h內(nèi)未檢測，放-80 ℃保存。

1.3 引物及探針設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank上公布的HAstV全基因組序列，選取基因組中比較保守的ORF2基因保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，上游引物為5’-TCAACGTGTCCGTAA MATTGTCA-3’，下游引物為5’-TGCWGGTTTTGGTCC TGTG A-3’；探針為FAM-CAACTCAGGAAACARGMGB-BHQ-1。引物和探針合成由上海生工生物技術(shù)有限公司完成。

1.4 構(gòu)建陽性質(zhì)控品

PCR擴(kuò)增HAstV ORF2基因，反應(yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件為42 ℃，30 min；95 ℃，5 min，95 ℃，3 min，60 ℃，1 min，共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物為88 bp。PCR產(chǎn)物回收后與pGEM-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，藍(lán)白篩選后，獲得重組陽性質(zhì)粒pGEMT-ORF2。

1.5 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

計(jì)算出重組質(zhì)粒pGEMT-ORF2初始拷貝數(shù)，10倍倍比稀釋，分別稀釋為1×106copies/L、1×105copies/L、1×104copies/L 以及1×103copies/L，實(shí)時(shí)RT-qPCR，獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而確定線性范圍。

1.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

對12份人星狀病毒上清液進(jìn)行準(zhǔn)確度試驗(yàn)，測試擴(kuò)增反應(yīng)準(zhǔn)確性。

1.7 特異性試驗(yàn)

分別取臨床上可見的消化道病毒，如輪狀病毒、諾如病毒、腸腺病毒、札如病毒、腸道病毒和致病性大腸桿菌，測試擴(kuò)增反應(yīng)特異性。

1.8 RT-qPCR擴(kuò)增

利用RT-qPCR方法對收集到的195份臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測。反應(yīng)體系：10×Buffer（含Mg2＋）5.0 μL，dNTP Mix（每管 2.5 mmol）4.0 μL，上下游引物終濃度均為0.4 μmol/L，TaqMan探針0.2 μmol/L，Taq DNA聚合酶4.0 μL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL，RNA酶抑制劑0.5 μL，模板10 μL，加純水至終體積50 μL。RT-qPCR反應(yīng)條件為：42 ℃，30 min；95 ℃ ，3 min，95 ℃，10 s；60℃，3 min，共 40 個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 pGEMT-Easy-ORF2目的基因普通PCR檢測結(jié)果

對pGEMT-Easy-ORF2進(jìn)行擴(kuò)增，凝膠電泳檢測為單一條帶，大小在130 bp左右，與對照條帶127 bp相符（見圖1），表明重組質(zhì)粒pGEMT-Easy-ORF2構(gòu)建成功。

圖1 pGEMT-Easy-ORF2目的基因普通PCR檢測結(jié)果

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

圖2為人星狀病毒靈敏度試驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1×106～1×103copies/L時(shí)，拷貝數(shù)與其對應(yīng)的CT值之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.999，線性關(guān)系為y=-4.166x+39.37，可對未知濃度的HAstV進(jìn)行定量。

2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果

如圖3所示，對來源于武漢大學(xué)病毒國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的高溫滅活的人星狀病毒上清液，共計(jì)12份進(jìn)行準(zhǔn)確度試驗(yàn)，準(zhǔn)確度達(dá)100%。

圖2 人星狀病毒靈敏度試驗(yàn)

圖3 人星狀病毒上清液準(zhǔn)確性試驗(yàn)

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果

如圖4所示，對HAstV和消化道病毒如輪狀病毒、諾如病毒、腸腺病毒、札如病毒、腸道病毒、致病性大腸桿菌進(jìn)行特異性檢測，檢驗(yàn)結(jié)果無交叉反應(yīng)。

圖4 特異性試驗(yàn)

2.5 RT-qPCR檢測結(jié)果

如圖5所示，應(yīng)用RT-qPCR方法對195份臨床樣本進(jìn)行檢測，檢測陽性標(biāo)本15份，陽性率為7.7%。

3 討論與結(jié)論

目前，研究HAstV的主要方法是傳統(tǒng)PCR等技術(shù)[7-8]。上述方法存在操作復(fù)雜繁瑣，特異性較差、靈敏度不高等缺點(diǎn)，大大限制了對人星狀病毒檢測的臨床研究。為了實(shí)現(xiàn)對人星狀病毒操作簡易、時(shí)間快速、特異性高的檢測，本論文建立了人星狀病毒進(jìn)RT-qPCR檢測研究方法。選取人星狀病毒ORF2基因保守片段設(shè)計(jì)引物和探針，對常見消化道病原體如輪狀病毒、諾如病毒、腸腺病毒、札如病毒、腸道病毒、致病性大腸桿菌等進(jìn)行特異性檢測；對195份樣本進(jìn)行檢測，15份樣本陽性，陽性率占比7.7%，由于樣本量較少，靈敏度還需進(jìn)一步加以研究和證實(shí)。

圖5 臨床應(yīng)用檢測

綜上所述，本研究成功建立了人星狀病毒RT-qPCR檢測技術(shù)手段，實(shí)現(xiàn)了對臨床樣本中人星狀病毒的檢測，具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，為人星狀病毒感染的臨床診斷提供了一個(gè)輔助方法。