微擬球藻脂質(zhì)的亞臨界提取工藝優(yōu)化及其成分分析

賀 瑤，曹 健，何東平,2，鄭竟成,2

(1.武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430023； 2.大宗糧油精深加工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430023)

微擬球藻，原屬于綠藻門(mén)，后被劃歸為真眼點(diǎn)藻綱，是一種分布廣泛的海水藻，也是公認(rèn)的最有希望用于工業(yè)化的高產(chǎn)油藻類。微擬球藻富含各種不飽和脂肪酸，其中二十碳五烯酸(EPA)含量可達(dá)總脂肪酸的30%左右，因此被稱為最有潛力的EPA研究藻種之一[1]。作為一種單細(xì)胞藻類，微擬球藻除了脂質(zhì)含量高，還具有環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、個(gè)體小、繁殖速度快等特點(diǎn)。因此，微擬球藻及其脂質(zhì)的開(kāi)發(fā)與利用近年來(lái)受到廣泛的研究。

EPA屬于ω-3系列多不飽和脂肪酸，可降低甘油三酯和膽固醇的含量，促進(jìn)飽和脂肪酸在體內(nèi)的代謝[1-4]。在現(xiàn)代人的日常飲食中，膽固醇和油脂的攝入量大幅上升，導(dǎo)致心血管疾病成為了主要的健康問(wèn)題之一。而EPA已被證實(shí)對(duì)治療動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓和炎癥有效[4-5]。因此，研究開(kāi)發(fā)富含EPA的產(chǎn)品具有廣闊的應(yīng)用前景及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。微藻中脂肪酸組成穩(wěn)定、培養(yǎng)繁殖簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期短，因此微藻作為EPA等不飽和脂肪酸的來(lái)源之一具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

亞臨界流體提取技術(shù)具有很多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如提取效率高、提取壓力低、提取溫度低等，已被廣泛應(yīng)用于植物脂質(zhì)[6-7]和動(dòng)物脂質(zhì)[8-10]的提取，但將該技術(shù)應(yīng)用于微擬球藻脂質(zhì)的提取鮮有報(bào)道。亞臨界流體提取技術(shù)應(yīng)用于微擬球藻脂質(zhì)的提取可以保護(hù)多不飽和脂肪酸等生物活性物質(zhì)，最大程度地減少氧化的發(fā)生。本文以微擬球藻膨化料為原料，采用亞臨界流體丁烷提取技術(shù)對(duì)微擬球藻脂質(zhì)進(jìn)行提取，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上利用正交試驗(yàn)對(duì)影響微擬球藻脂質(zhì)提取率的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳工藝條件，并檢測(cè)其基本物性指標(biāo)，為微擬球藻脂質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

微擬球藻膨化料，煙臺(tái)海融微藻養(yǎng)殖有限公司；脂肪酸、磷脂標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司；乙醇、硫代硫酸鈉、氫氧化鉀、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀等均為市售分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

馬弗爐；1100高效液相色譜儀、8860氣相色譜儀，美國(guó)安捷倫科技公司；CBE-5L亞臨界丁烷提取裝置，河南亞臨界生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質(zhì)

稱取500 g微擬球藻膨化料，以丁烷為提取溶劑，在一定條件下進(jìn)行亞臨界動(dòng)態(tài)提取，提取完畢后，減壓蒸發(fā)，收集微擬球藻脂質(zhì)，計(jì)算微擬球藻脂質(zhì)提取率[8]。每個(gè)樣品做3次平行試驗(yàn)，取平均值。微擬球藻脂質(zhì)提取率按下式計(jì)算。

微擬球藻脂質(zhì)提取率=亞臨界提取脂質(zhì)提取量/索氏抽提脂質(zhì)提取量×100%

1.2.2 微擬球藻脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)分析

酸價(jià)，GB 5009.229—2016第二法；過(guò)氧化值，GB 5009.227—2016第二法；碘值，GB/T 5532—2008；脂肪和脂肪酸組成，GB 5009.168—2016第一法；磷脂含量，GB/T 5537—2008。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

在提取溫度45℃、單次提取時(shí)間40 min、料液比1∶8的條件下，按提取次數(shù)分別為1、2、3、4、5、6 次進(jìn)行亞臨界丁烷提取，考察提取次數(shù)對(duì)微擬球藻脂質(zhì)提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 提取次數(shù)對(duì)微擬球藻脂質(zhì)提取率的影響

由圖1可知，隨著提取次數(shù)的增加，提取率不斷增加。從第1次到第4次，提取率迅速增加，達(dá)到41.01%；從第4次增至第6次，提取率趨于平緩，繼續(xù)增加提取次數(shù)意義不大。為了適當(dāng)簡(jiǎn)化操作的流程，減少能量的損耗，提高效率，將提取次數(shù)確定為4次。

2.1.2 單次提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

在提取溫度45℃、料液比1∶8、提取4次的條件下，按單次提取時(shí)間分別為10、20、30、40、50、60 min進(jìn)行亞臨界丁烷提取，考察單次提取時(shí)間對(duì)微擬球藻脂質(zhì)提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 單次提取時(shí)間對(duì)微擬球藻脂質(zhì)提取率的影響

由圖2可知，隨著單次提取時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率逐漸上升。單次提取時(shí)間從10 min延長(zhǎng)至40 min時(shí)，提取率增至41.13%。隨后單次提取時(shí)間逐漸延長(zhǎng)至60 min，提取率增加變緩。10～20 min時(shí)提取剛開(kāi)始，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)部油脂還未向外部溶劑擴(kuò)散[11]，因此提取率較低；隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，在20～40 min時(shí)細(xì)胞內(nèi)部油脂向外部溶劑擴(kuò)散，提取率快速升高，40 min時(shí)基本達(dá)到最高值；40 min 之后提取逐漸達(dá)到平穩(wěn)階段以及慢速傳質(zhì)階段，細(xì)胞內(nèi)部油脂向外部溶解擴(kuò)散達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡之后，提取率增加不明顯。綜上，選擇單次提取時(shí)間40 min為宜。

2.1.3 提取溫度對(duì)提取率的影響

在料液比1∶8、單次提取時(shí)間40 min、提取4次的條件下，按提取溫度分別為30、35、40、45、50、55℃進(jìn)行亞臨界丁烷提取，考察提取溫度對(duì)微擬球藻脂質(zhì)提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取溫度對(duì)微擬球藻脂質(zhì)提取率的影響

由圖3可知：當(dāng)提取溫度在45℃以下時(shí)，隨著提取溫度的升高，微擬球藻脂質(zhì)提取率隨之增加，當(dāng)提取溫度達(dá)到45℃時(shí)，提取率達(dá)到最大；但提取溫度超過(guò)45℃后，隨著丁烷分子運(yùn)動(dòng)加速導(dǎo)致其密度有所降低，汽化程度增加，與物料接觸面積減少，使提取速率逐漸下降[12]。此外，提取溫度升高還會(huì)加速脂質(zhì)中不飽和脂肪酸的分解，故最佳提取溫度選擇45℃。

2.1.4 料液比對(duì)提取率的影響

在提取溫度45℃、單次提取時(shí)間40 min、提取4次的條件下，按料液比分別為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12進(jìn)行亞臨界丁烷提取，考察料液比對(duì)微擬球藻脂質(zhì)提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)微擬球藻脂質(zhì)提取率的影響

由圖4可知，隨著料液比的增加，提取率逐漸升高，但在料液比超過(guò)1∶8后，提取率增加不明顯，說(shuō)明此時(shí)微擬球藻中的脂溶性成分幾乎提取完全，因此提取率基本穩(wěn)定，上升緩慢。若繼續(xù)增加丁烷的用量，會(huì)降低總體提取效率，也會(huì)增加能耗。綜合考慮，選擇料液比1∶8。

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用四因素三水平正交試驗(yàn)表L9(34)，優(yōu)化亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質(zhì)的工藝條件。選取提取次數(shù)、單次提取時(shí)間、提取溫度、料液比作為優(yōu)化因素，正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表2可知，各因素對(duì)微擬球藻脂質(zhì)提取率影響的主次排序?yàn)锳>B>C>D，即提取次數(shù)>單次提取時(shí)間>提取溫度>料液比。工藝參數(shù)最佳組合為A2B2C2D2，即提取次數(shù)4次，單次提取時(shí)間40 min，提取溫度45℃，料液比1∶8。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

取同一批次微擬球藻膨化料3份，每份500 g，在提取次數(shù)4次、單次提取時(shí)間40 min、提取溫度45℃、料液比1∶8的條件下進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，微擬球藻脂質(zhì)的平均提取率為41.55%，說(shuō)明工藝穩(wěn)定可行。在最佳條件下提取的微擬球藻脂質(zhì)呈深綠色油性糊狀，其酸價(jià)(KOH)20.4 mg/g，過(guò)氧化值0.001 g/100 g，碘值(I)86.0 g/100 g，磷脂含量107.28 mg/g。

與其他油脂提取相比，微擬球藻脂質(zhì)提取率整體偏低，可能是因?yàn)殡m然經(jīng)過(guò)了膨化處理，但是微擬球藻的破壁率并不高，導(dǎo)致了在提取過(guò)程中，有機(jī)溶劑不能很好地滲透到微藻細(xì)胞內(nèi)，從而造成整體提取率偏低。

2.4 亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質(zhì)的脂肪分析

亞臨界丁烷提取的微擬球藻脂質(zhì)中含有豐富的脂肪，通過(guò)內(nèi)標(biāo)法對(duì)脂肪的組成和含量進(jìn)行了分析，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質(zhì)中脂肪組成及含量

由表3可知，亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質(zhì)總脂肪含量40.22%，其中飽和脂肪含量14.51%，不飽和脂肪含量25.71%。ω-3脂肪含量7.24%，ω-6脂肪含量3.30%，ω-9脂肪含量4.39%。對(duì)亞臨界丁烷提取的微擬球藻脂質(zhì)成分進(jìn)行進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)其中還含有甘露醇、葉綠素、類胡蘿卜素、植物甾醇等其他成分。

為進(jìn)一步了解微擬球藻脂質(zhì)的脂肪酸組成，利用GC對(duì)微擬球藻脂質(zhì)中的脂肪酸組成進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質(zhì)中主要脂肪酸組成及含量

由表4可知，微擬球藻脂質(zhì)中脂肪酸主要以不飽和脂肪酸為主，其中EPA含量為7.21%。本次測(cè)定的微擬球藻脂質(zhì)中的EPA含量，相較于一些報(bào)道[13]偏低，推測(cè)與藻粉批次和藻粉的膨化工藝有關(guān)，但不影響對(duì)亞臨界丁烷提取工藝的研究。

3 結(jié) 論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了亞臨界丁烷提取微擬球藻脂質(zhì)的最佳工藝條件為：提取次數(shù)4次，單次提取時(shí)間40 min，提取溫度45℃，料液比1∶8。在最佳工藝條件下，微擬球藻脂質(zhì)提取率為41.55%。提取的微擬球藻脂質(zhì)呈深綠色油性糊狀，其酸價(jià)(KOH)20.4 mg/g，碘值(I)86.0 g/100 g，過(guò)氧化值0.001 g/100 g，磷脂含量107.28 mg/g。亞臨界丁烷提取的微擬球藻脂質(zhì)中總脂肪含量為40.22%，不飽和脂肪酸含量較高，其中EPA含量為7.21%。