MicroRNA-182和microRNA-152在早期子宮內(nèi)膜癌組織中的差異性表達

曹雙雙 陳世超 解丹 梁義娟

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的腫瘤之一[1]，是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的上皮源性惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢，且發(fā)病年齡也逐漸呈現(xiàn)年輕化。有研究表明，某些microRNA(miRNA)與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展具有一定相關(guān)性。如研究發(fā)現(xiàn)miRNA-139-5p在子宮內(nèi)膜癌中的表達下調(diào)，過表達的miRNA-139-5p通過靶向基因HOXA10抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的生長和遷移能力[2]。還有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-34a，miRNA-424和miRNA-513直接調(diào)控基因MMSET來削弱子宮內(nèi)膜癌細胞的侵襲和球形形成能力進而抑制子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和疾病進展過程，并證明miRNA-34a，miRNA-424和miRNA-513的表達降低與子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后較差密切相關(guān)[3]。本研究通過檢測miRNA-182 和miRNA-152在早期子宮內(nèi)膜癌組織中的表達情況，探究二者在子宮內(nèi)膜癌進展過程中扮演的角色，以期對其早期篩查、診斷和臨床治療提供新方向，為實現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌的分子靶向治療奠定基礎(chǔ)。

對象與方法

1.研究對象：選取2018年3月至2018年8月在河北大學(xué)附屬醫(yī)院進行手術(shù)治療的早期子宮內(nèi)膜癌患者和因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)的患者各40例。納入標準：(1)所有患者均由本院首次診治；(2)早期子宮內(nèi)膜癌患者均經(jīng)病理確診；(3)子宮肌瘤患者均經(jīng)病理除外子宮內(nèi)膜病變；(4)術(shù)前未經(jīng)放療、化療、激素及生物治療；(5)患者無嚴重肝腎功能損害或多器官功能損害，無自身免疫性疾病及血液系統(tǒng)疾病，未合并其他類型惡性腫瘤，并能耐受手術(shù)者；(6)所有患者均有本院明確的病理結(jié)果；(7)臨床資料完整，術(shù)中收集組織標本；(8)經(jīng)告知同意，并愿意配合、簽署知情同意書。

2.方法：分別于術(shù)中切取子宮內(nèi)膜癌腫瘤組織和正常子宮內(nèi)膜組織。所有組織均在子宮離體30分鐘內(nèi)切取并迅速放入液氮中，立即轉(zhuǎn)移至實驗室-80℃冰箱中儲存?zhèn)溆?。所有實驗組標本均經(jīng)本院病理科同一醫(yī)師術(shù)后病理結(jié)果確診為早期子宮內(nèi)膜癌，對照組術(shù)后病理提示子宮肌瘤，并均除外子宮內(nèi)膜病變。

3.實時聚合酶鏈反應(yīng)(real-time PCR)：用Lysis/Binding buffer試劑盒(Invitrogen公司)提取早期子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織的總RNA，每一步均嚴格參照說明書的詳細步驟進行。酶標儀測定所提取的總RNA的濃度以及純度，并使用移液槍取1ug·ml-1RNA，進行加尾及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。利用miDETECT A TrackTM miRNA qRT-PCR Kit試劑盒(With ROXI)(廣州銳博生物科技有限公司)以cDNA作為模板，使用miRNA-182、miRNA-152和對照S5引物配制PCR反應(yīng)體系:2×qPCR Mix 17.5 μl；2.0 μmol·L-1引物0.5 μl； cDNA 2.0 μl；輕輕混勻后離心，放入熒光定量PCR儀(Life Technologies公司的7300 Real-Time PCR System)中。設(shè)置反應(yīng)條件為:95℃ 預(yù)變性10 min; 95℃ 變性2 s，60℃ 30 s退火/延伸，循環(huán)40次；最后運行溶解曲線程序。miRNA-152和miRNA-182所有引物及內(nèi)參S5均由廣州銳博生物科技有限公司合成。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT進行分析，其中，ΔCT = CT目的基因-CT對照基因；ΔΔCT=ΔCT實驗樣本-ΔCT對照樣本。

結(jié)果

1.研究對象一般特征

研究對象為2018年3月—2018年8月河北省保定市及周邊地區(qū)的經(jīng)病理確診的早期子宮內(nèi)膜癌患者，年齡49～58歲，平均(52.5±2.18)歲。經(jīng)病理除外子宮內(nèi)膜病變的子宮肌瘤患者，年齡49～55歲，平均(51.65±1.73)歲。兩組患者年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.real-time PCR檢測結(jié)果顯示：

(1)miRNA-182在早期子宮內(nèi)膜癌組織中和正常子宮內(nèi)膜組織中的相對表達量分別為(1.5499±0.4808)和(0.7767±0.4072)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1。

(2)miRNA-152在早期子宮內(nèi)膜癌組織和正常子宮內(nèi)膜組織的相對表達量分別為(0.5010±0.2363)和(0.9037±0.2304)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖2。

A:正常子宮內(nèi)膜組織 B:早期子宮內(nèi)膜癌組織圖1 子宮內(nèi)膜組織中miRNA-182相對表達情況

A:正常子宮內(nèi)膜組織 B:早期子宮內(nèi)膜癌組織圖2 子宮內(nèi)膜組織中miRNA-152相對表達情況

討論

子宮內(nèi)膜癌作為最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，嚴重危害著廣大女性的生命健康，其疾病的發(fā)展是一個累積遺傳和表觀遺傳學(xué)改變的多步驟的過程。其發(fā)病率逐年升高，有統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明子宮內(nèi)膜癌發(fā)病率在北美及歐洲等發(fā)達國家排名第4[4]，在中國僅落后于宮頸癌居第2位。其居高不下的發(fā)病率及發(fā)病人群逐漸年輕化的特點還同時帶來了一系列的社會問題，如許多年輕患者以及她們的家庭有強烈的生育愿望，那么傳統(tǒng)的治療手段即手術(shù)治療對于這部分患者將不能作為首選治療方案。因此探尋子宮內(nèi)膜癌新的診療手段成為了當(dāng)下亟需解決的問題。近年來，分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究不斷深入并取得了一定的進展，miRNA重要的生物學(xué)功能逐漸被研究和證實，miRNA與惡性腫瘤千絲萬縷的聯(lián)系也逐漸被認知和重視。miRNA是在進化過程中能夠達到高度保守的非編碼的微小RNA，其長度約為19～22個核苷酸，基因的表達包括轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后的加工這幾個過程，而miRNA可實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平后的基因表達的調(diào)控，因此相較于某些蛋白，它們更能夠從根本上調(diào)控基因的表達，進而影響一系列的生命活動。miRNA的種子序列以堿基互補配對的方式結(jié)合其對應(yīng)靶基因信使RNA(mRNA)的3′端非翻譯區(qū)，干擾靶基因mRNA翻譯過程的正常進行，甚至可以使靶基因mRNA降解，從而激活或沉默靶基因[5]。miRNA可以通過影響細胞增殖、細胞分化及細胞凋亡等生物學(xué)行為進而調(diào)控機體的各種生理功能，其表達異?，F(xiàn)已證實與多種人類疾病相關(guān)，其與惡性腫瘤的演變過程關(guān)系密切[6-8]，這也已經(jīng)成為學(xué)者們關(guān)注和研究的熱點。miRNA-182和miRNA-152是近來較受關(guān)注的miRNA，研究證明與多種腫瘤關(guān)系密切。

miRNA-182定位于人7號染色體[9]。研究證實miRNA-182參與肝癌[10-11]、肺癌[12]、前列腺癌[13]、宮頸癌[14]、腎癌[15]等多種惡性腫瘤的疾病演變過程。miRNA-182在子宮內(nèi)膜癌中的研究較少，有研究認為miRNA-182是子宮內(nèi)膜癌的促癌基因。梁靜等[16]的miRNA基因芯片篩選結(jié)果顯示miRNA-182在子宮內(nèi)膜樣腺癌中表達明顯上調(diào)。還有研究進一步發(fā)現(xiàn)，miRNA-182可干擾子宮內(nèi)膜癌腫瘤細胞的凋亡過程，并同時可提高其增殖活性，并證明對子宮內(nèi)膜癌腫瘤細胞的調(diào)控是通過靶向基因Foxo1實現(xiàn)的[17]。盡管已經(jīng)有一定的研究基礎(chǔ)，但這一結(jié)論還目前還缺乏大量的臨床組織學(xué)驗證。

miRNA-152是miRNA-148/152家族的成員之一，它位于人類的第17號染色體和小鼠的第11號染色體上[18]。miRNA-152目前已經(jīng)被證實在許多種惡性腫瘤如肝癌[19]、乳腺癌[20]、結(jié)直腸癌[21]、宮頸癌[22]、卵巢癌[23]及膀胱癌[24]中充當(dāng)抑癌因子，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近年來，逐漸開始有國內(nèi)外的學(xué)者對miRNA-152與子宮內(nèi)膜癌疾病發(fā)生和演變的相關(guān)性密切關(guān)注并展開研究。這些主要研究集中在細胞水平，證明了miRNA-152通過不同調(diào)控通路影響子宮內(nèi)膜癌腫瘤細胞的生長、增殖及分化等生物學(xué)功能。如有研究認為，miRNA-152靶向基因WNT-1[25]和c-MET[26]調(diào)控子宮內(nèi)膜腫瘤細胞增殖水平。還有學(xué)者認為miRNA-152-3p的表達受激素的調(diào)控，如孕酮可使miRNA-152-3p表達水平提高，進而降低子宮內(nèi)膜癌上皮細胞的增殖活性，并進一步提出CDC14A可能是miRNA-152-3p的靶蛋白[27]。Tsuruta等[28]研究表明miRNA-152的抑癌作用與DNA高甲基化有關(guān)，miRNA-152靶向DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNA methyltransferasel,DNMT1)，miRNA-152的表達活性被DNA高甲基化抑制，進一步使子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖能力降低。還有學(xué)者在此基礎(chǔ)上研究發(fā)現(xiàn)組蛋白乙?；虳NA甲基化通過誘導(dǎo)miRNA-152高表達進一步抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的生長、增殖及分化等生物學(xué)行為，發(fā)揮其抑癌因子的作用[29]。我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)miRNA-152可以使子宮內(nèi)膜癌細胞的G2/M期阻滯，干擾其正常的細胞增殖進程，這一功能是通過靶向CDC25B實現(xiàn)的[30]。

在此基礎(chǔ)之上，本課題在組織學(xué)水平開展研究，研究結(jié)果顯示miRNA-182子宮內(nèi)膜癌組織標本中的相對表達量明顯高于正常內(nèi)膜組，提示在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生和疾病進展過程中扮演促癌因子的角色。miRNA-152在早期子宮內(nèi)膜癌組織中的表達水平相較于對照組正常子宮內(nèi)膜組織明顯降低，證明了miRNA-152是子宮內(nèi)膜癌的腫瘤抑癌因子，在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生和疾病進展過程中發(fā)揮不可或缺的關(guān)鍵作用。

子宮內(nèi)膜癌發(fā)病原因至今并沒有完全明確，發(fā)病率也存在著較為明顯的種族差異和地域差異。目前普遍認為遺傳、吸煙、肥胖、高血壓、糖尿病及激素治療等是其發(fā)病的高危因素，但其導(dǎo)致癌癥發(fā)生和進展的具體分子機制未明。近來有國外學(xué)者研究證明增加適當(dāng)?shù)捏w育鍛煉活動可以提高子宮內(nèi)膜癌患者的生活質(zhì)量[31]。本研究結(jié)果顯示，在觀察組早期子宮內(nèi)膜癌組織中，相較于對照組子宮內(nèi)膜組織miRNA-182和miRNA-152呈現(xiàn)出不同的表達水平，前者呈現(xiàn)高表達的狀態(tài)，而后者則表達降低。推測子宮內(nèi)膜癌的疾病發(fā)生和演變過程與miRNA-182和miRNA-152的表達失常有直接關(guān)系，二者可能通過某些或簡單或復(fù)雜的調(diào)控通路對子宮內(nèi)膜癌腫瘤細胞的生物學(xué)功能造成一定的影響，進而促進或抑制子宮內(nèi)膜癌疾病的發(fā)生和演變過程。其有望成為子宮內(nèi)膜癌篩查、診斷、判斷預(yù)后以及治療后隨訪的分子生物標志物，并為子宮內(nèi)膜癌的分子靶向治療提供理論基礎(chǔ)。但目前二者的研究主要集中在分子水平，缺乏大量的臨床組織學(xué)驗證，且本研究時間較短、樣本量較小，并僅僅取材于早期腫瘤組織，故其是否與子宮內(nèi)膜癌的疾病進展、腫瘤分型、病理分級以及其他臨床病理參數(shù)相關(guān)仍不清楚，是否影響子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后也并不能確定，需要我們進一步加大樣本量繼續(xù)深入研究和隨訪。