產(chǎn)脂肪酶深海細(xì)菌的篩選鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究

王 凱, 劉洪國(guó), 姜 昆, 閆培生

哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 威海 264209

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產(chǎn)脂肪酶深海細(xì)菌的篩選鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究

王 凱, 劉洪國(guó), 姜 昆, 閆培生*

哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 威海 264209

從分離自南大西洋深海沉積物的細(xì)菌中篩選出一株產(chǎn)脂肪酶菌株FE10，通過(guò)16S rRNA序列分析，對(duì)FE10進(jìn)行分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，初步確定其為海桿菌屬(Marinobacter)。對(duì)菌株FE10所產(chǎn)脂肪酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)初步研究表明：在實(shí)驗(yàn)溫度條件下所產(chǎn)脂肪酶40℃、pH 7時(shí)酶活最高，pH 9時(shí)酶活幾乎消失。

深海；微生物；脂肪酶；16S rRNA；酶學(xué)性質(zhì)

脂肪酶(lipase)，全稱三?；视退饷?，隸屬于羧基酯水解酶類，能夠?qū)⒏视腿ニ獬筛视秃椭舅幔瑥V泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中[1]。但除豬胰脂肪酶外，動(dòng)物體內(nèi)的脂肪酶含量較少且活性很低；植物脂肪酶普遍存在，但主要存在于種子中，導(dǎo)致使用受限制[2]；微生物脂肪酶的種類多、來(lái)源廣，具有比動(dòng)植物脂肪酶更廣的pH、溫度作用范圍和底物的專一性類型，以及較高的催化活性和穩(wěn)定性，是重要的工業(yè)酶[3]，在飼料工業(yè)、醫(yī)藥、洗滌工業(yè)、生物柴油、化學(xué)合成、皮革生產(chǎn)和造紙等領(lǐng)域都有應(yīng)用[4]。

海洋儲(chǔ)存著豐富的微生物資源，無(wú)論從數(shù)量還是多樣性方面都是巨大的。目前研究和鑒定的海洋微生物還不到5%，海洋微生物作為產(chǎn)酶資源正在成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。從海洋中可以獲取到脂肪酶產(chǎn)生菌[5]，而海洋中的低溫微生物在長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中，形成了獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征和生理生化特性[6]。低溫脂肪酶比中溫酶的催化溫度低0～30℃，在較低溫度下(低于40℃)有較好的催化效果，升高較少溫度就可以使酶失活、終止反應(yīng)，能有效降低經(jīng)濟(jì)成本，有很好的研究應(yīng)用前景[7]。

本文從南大西洋深海沉積物中篩選到一株產(chǎn)脂肪酶的菌株FE10，通過(guò)16S rRNA序列測(cè)定和比對(duì)分析對(duì)該菌株的種屬及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果豐富了深海微生物的脂肪酶資源，并期望為其應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與溶液配方

2216E培養(yǎng)基：蛋白胨 5 g/L，酵母膏 1 g/L，檸檬酸鐵 0.1 g/L，氯化鈉 19.45 g/L，氯化鎂5.9 g/L，硫酸鎂 3.24 g/L，氯化鈣 1.8 g/L，氯化鉀 0.55 g/L，碳酸氫鈉 0.16 g/L，溴化鉀 0.08 g/L，氯化鍶 34 mg/L，硼酸 22 mg/L，硅酸鈉 4 mg/L，氟化鈉 2.4 mg/L，硝酸銨 1.6 mg/L，磷酸二鈉 8 mg/L，瓊脂 15 g/L，pH 自然，121℃滅菌 20 min。

篩選培養(yǎng)基：酵母粉5g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，葡萄糖3 g/L，橄欖油乳化劑40 g/L，羅丹明B 0.5 g/L，瓊脂15 g/L，過(guò)濾沉海水1 L，pH 7.5～8。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，葡萄糖3 g/L，橄欖油乳化劑40 g/L，過(guò)濾沉海水1 L，pH 7.5～8.0。

2%聚乙烯醇溶液：稱取聚乙烯醇(PVA)2 g 溶于80 mL 水中，加熱攪拌，直至全部溶解，定容至100 mL。

橄欖油乳化劑：2%聚乙烯醇∶橄欖油=3∶1混勻后，在10 000 r/min 乳化3 min后，靜止5 min，再乳化3 min，制成乳白色的乳化劑。

0.05 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液：按GB/T 601-2002配制，使用時(shí)準(zhǔn)確稀釋10倍。

磷酸緩沖液(pH 7.5)：稱取磷酸二氫鉀1.96 g和十二水合磷酸氫二鈉39.62 g，溶于水并定容至500 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離 沉積物樣品為“大洋一號(hào)”船DY26 航次 2012年7～8月期間于南大西洋站位采集。將充分混勻后的沉積物樣品懸液100 μL按照10-3～10-6濃度梯度，采用稀釋涂布平板法于2216E 培養(yǎng)基涂布分離，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察，及時(shí)挑取菌落培養(yǎng)。

1.2.2 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選 將分離獲得的深海微生物采用油脂平板篩選，28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。以羅丹明B作為指示劑。由于脂肪酶可降解平板中的油脂，產(chǎn)生的脂肪酸與羅丹明B的陽(yáng)離子發(fā)生作用，在350 nm紫外燈照射下出現(xiàn)橙黃色的熒光物質(zhì)。根據(jù)菌落周圍產(chǎn)生的熒光圈篩選產(chǎn)脂肪酶菌株。

1.2.3 酶活的測(cè)定 菌株于試管中培養(yǎng)12 h后按2%的接種量接種至錐形瓶中，于28℃、180 r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)48 h。8 000 r/min、4℃條件下離心20 min后獲得上清液，采用氫氧化鈉指示劑滴定法測(cè)定酶活。在反應(yīng)溫度為35℃，反應(yīng)時(shí)間為30 min的條件下，每分鐘水解脂肪產(chǎn)生1 μmoL脂肪酸所需的酶量定義為一個(gè)脂肪酶活單位(U)。

1.2.4 菌株的分子鑒定 采用16S rDNA序列分析等手段對(duì)篩選獲得的脂肪酶產(chǎn)生菌株進(jìn)行分類鑒定。將分離純化獲得的菌株使用DNA 提取試劑盒提取菌株的基因組DNA。16S rDNA PCR擴(kuò)增的引物序列為：16SF ：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，16SR：5′-ACGGCTACCTTGTTACGA-CT-3′。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃ 5 min；94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保存。

測(cè)序后利用EzBiocloud數(shù)據(jù)庫(kù)中的EZTaxon方法與模式菌株進(jìn)行比較，并利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)Blast功能進(jìn)行同源性分析的輔助比對(duì)。比對(duì)后下載相似模式菌株的16S rDNA基因序列，采用Mega 5軟件(clustalw multiple alignment)進(jìn)行多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析(neighbor-joining method)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹確定其分類地位。

1.2.5 脂肪酶部分酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定 測(cè)定30℃、40℃、50℃、60℃和70℃條件下的酶活，考察溫度對(duì)脂肪酶活的影響；保持反應(yīng)溫度為40℃不變，測(cè)定 pH為5、6、7、8、9(精確到0.01)條件下的酶活，考察pH對(duì)脂肪酶活的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選結(jié)果

從南大西洋采集的深海沉積物中共分離純化獲得深海細(xì)菌235株。將分離獲得的深海微生物采用油脂平板篩選其產(chǎn)脂肪酶能力，羅丹明B可與酶解產(chǎn)生的脂肪酸發(fā)生作用，350 nm紫外燈照射下在菌落周圍產(chǎn)生橙黃色的熒光物質(zhì)。其中FE10菌株48 h后即可觀察到完整的熒光圈，采用氫氧化鈉指示劑滴定法測(cè)定脂肪酶活達(dá)到2 U/mL將其用于后續(xù)研究。

2.2 FE10的分子鑒定

將FE10菌株的16S rDNA序列與EZTaxon上的已知模式菌株序列進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)FE10的序列與模式菌株Marinobacterhydrocarbonoclas-ticusATCC 49840T(FO203363) 的序列相似，同源性達(dá)到98.30%。GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)Blast功能進(jìn)行輔助比對(duì)，結(jié)果顯示同源性最高的菌株亦為海桿菌屬(Marinobacter)菌株，同源性達(dá)到98%。采用Mega5軟件的鄰接法(neighbor-joining method)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出FE10菌株與海桿菌屬的菌株最為接近。初步確定FE10菌株屬于交替單胞菌目(Alteromonadales)，交替單胞菌科(Alteromonadaceae)，海桿菌屬(Marinobacter)。目前發(fā)現(xiàn)的海桿菌多為低溫菌，其中有些菌種對(duì)芳烴和烷烴的降解有較好的效果[8～10]，期望其可應(yīng)用于石油烴的降解。

圖1 基于16S rDNA序列鄰接法構(gòu)建的FE10菌株和相關(guān)模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbor-joining tree based on the 16S rRNA sequences of strain FE10 and other related representative strains.

2.3 部分酶學(xué)特性研究

2.3.1 脂肪酶的催化活性隨溫度的變化結(jié)果 在30～70℃溫度范圍內(nèi)測(cè)定脂肪酶的催化活性隨溫度的變化情況，結(jié)果如圖2所示。

圖2 溫度對(duì)酶活的影響Fig.2 The effect of temperature on lipase activity.

結(jié)果表明，菌株FE10所產(chǎn)脂肪酶在現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)溫度條件下40℃時(shí)酶活最高，在60℃仍有40%的酶活。菌株FE10所產(chǎn)脂肪酶最適溫度應(yīng)為40℃左右，符合低溫酶的定義，對(duì)于酶反應(yīng)的最適溫度，還有待進(jìn)一步研究。

2.3.2 脂肪酶的催化活性隨pH的變化結(jié)果 在5～9的pH范圍內(nèi)測(cè)定脂肪酶的催化活性隨pH的變化情況，結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH對(duì)酶活的影響Fig.3 The effect of pH on lipase activity.

結(jié)果表明，菌株FE10所產(chǎn)脂肪酶在pH 7時(shí)酶活最高，隨著酸性或堿性的增強(qiáng)酶活降低。pH 9時(shí)酶活幾乎為零，可能是堿性環(huán)境對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了破壞，影響了酶分子的結(jié)合能力，從而降低了催化活性。

3 討論

海洋的高鹽、高壓、寡營(yíng)養(yǎng)和無(wú)光照等特殊生態(tài)環(huán)境決定了海洋微生物種類的多樣性和特殊性，因而造成了具有獨(dú)特的代謝途徑和遺傳背景并且能夠產(chǎn)生具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和功能的酶類物質(zhì)。脂肪酶在陸地分離的報(bào)道較多，如顧美英等[11]從新疆低溫環(huán)境土樣中篩選到的茁芽絲苞酵母菌GL-1所產(chǎn)低溫脂肪酶在30℃時(shí)活性最強(qiáng)，45℃以上迅速失活；張海榮等[12]研究的Fusariumsp.菌株的低溫脂肪酶25℃時(shí)活性最高，60℃時(shí)活性基本消失。有研究表明不同來(lái)源的脂肪酶最適pH不同，如陳貴元[13]從昆明一屠宰場(chǎng)冷庫(kù)樣品得到的Serratiasp.KM1所產(chǎn)低溫脂肪酶的最適pH為9.0；周晶[14]研究的AspergillusoryzaeCJLU-31所產(chǎn)的低溫脂肪酶的最適pH為4.0，pH為6時(shí)嚴(yán)重失活；李珍等[15]從富含油脂的土壤中篩選到的Penicilliumchrysogenum-J23所產(chǎn)低溫脂肪酶的最適pH則是7.5，接近中性，與菌株FE10所產(chǎn)脂肪酶的最適pH一致。但國(guó)內(nèi)外關(guān)于海洋來(lái)源脂肪酶的報(bào)道還不是很多[16～18]，而且其中部分研究是針對(duì)不可培養(yǎng)微生物的脂肪酶基因開展的研究[19,20]，不利于菌種產(chǎn)酶的實(shí)際應(yīng)用。這些研究結(jié)果豐富了深海微生物的脂肪酶資源，為其后續(xù)在環(huán)境、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論參考。

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日本在最深海溝發(fā)現(xiàn)罕見細(xì)菌

海床的平均深度是4 000米，而位于西太平洋的馬里亞納海溝的挑戰(zhàn)者深淵谷底深度接近11 km。日本研究人員借助一臺(tái)遠(yuǎn)程操控機(jī)器人，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)細(xì)菌群落正在茁壯成長(zhǎng)，這種被稱為“異養(yǎng)微生物”的細(xì)菌并不能自己產(chǎn)生食物，必須“獵食”水中的其他微生物細(xì)菌才能得以生存。

論文鏈接:Nunoura T,Takaki Y,Hirai M,etal..Hadal biosphere: Insight into the microbial ecosystem in the deepest ocean on Earth.

Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America,2015,112(11): E1230-E1236.Doi: 10.1073/pnas.1421816112

Abstract: Hadal oceans at water depths below 6,000 m are the least-explored aquatic biosphere.The Challenger Deep,located in the western equatorial Pacific,with a water depth of ～11 km,is the deepest ocean on Earth.Microbial communities associated with waters from the sea surface to the trench bottom (0～10 257 m) in the Challenger Deep were analyzed,and unprecedented trench microbial communities were identified in the hadal waters (6 000～10 257 m) that were distinct from the abyssal microbial communities.The potentially chemolithotrophic populations were less abundant in the hadal water than those in the upper abyssal waters.The emerging members of chemolithotrophic nitrifiers in the hadal water that likely adapt to the higher flux of electron donors were also different from those in the abyssal waters that adapt to the lower flux of electron donors.Species-level niche separation in most of the dominant taxa was also found between the hadal and abyssal microbial communities.Considering the geomorphology and the isolated hydrotopographical nature of the Mariana Trench,we hypothesized that the distinct hadal microbial ecosystem was driven by the endogenous recycling of organic matter in the hadal waters associated with the trench geomorphology.

單病毒粒子示蹤技術(shù)揭示海水魚類病毒侵染機(jī)制

中國(guó)科學(xué)家首次將單病毒粒子示蹤技術(shù)應(yīng)用于水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物大分子DNA病毒研究，從時(shí)間、空間尺度多層次揭示了石斑魚虹彩病毒(singapore grouper iridovirus,SGIV)侵染宿主活細(xì)胞的機(jī)制，研究結(jié)果有助于深入理解SGIV的致病機(jī)理和提供理想的病毒-細(xì)胞模型。

論文鏈接:Wang S W,Huang X H,Huang Y H,etal..Entry of a novel marine DNA virus,singapore grouper iridovirus,into host cells occurs via clathrin-mediated endocytosis and macropinocytosis in a pH-dependent manner.

Journal of Virology,2014,88(22): 13047-13063.Doi: 10.1128/JVI.01744-14.

Abstract: Iridoviruses are nucleocytoplasmic DNA viruses which cause great economic losses in the aquaculture industry but also show significant threat to global biodiversity.However,a lack of host cells has resulted in poor progress in clarifying iridovirus behavior.We investigated the crucial events during virus entry using a combination of single-virus tracking and biochemical assays,based on the established virus-cell infection model for Singapore grouper iridovirus (SGIV).SGIV infection in host cells was strongly inhibited when cells were pretreated with drugs blocking clathrin-mediated endocytosis,including sucrose and chlorpromazine.Inhibition of key regulators of macropinocytosis,including Na+/H+exchanger,Rac1 GTPase,p21-activated kinase 1 (PAK1),protein kinase C (PKC),and myosin II,significantly reduced SGIV uptake.Cy5-labeled SGIV particles were observed to colocalize with clathrin and macropinosomes.In contrast,disruption of cellular cholesterol by methyl-β-cyclodextrin and nystatin had no effect on virus infection,suggesting that SGIV entered grouper cells via the clathrin-mediated endocytic pathway and macropinocytosis but not via caveola-dependent endocytosis.Furthermore,inhibitors of endosome acidification such as chloroquine and bafilomycin A1 blocked virus infection,indicating that SGIV entered cells in a pH-dependent manner.In addition,SGIV particles were observed to be transported along both microtubules and actin filaments,and intracellular SGIV motility was remarkably impaired by depolymerization of microtubules or actin filaments.The results of this study for the first time demonstrate that not only the clathrin-dependent pathway but also macropinocytosis are involved in fish DNA enveloped virus entry,thus providing a convenient tactic for exploring the life cycle of DNA viruses.

海洋生物多糖材料研究中取得進(jìn)展

以海藻酸鈉為代表的海洋生物多糖材料來(lái)源廣泛、生物安全性高、可降解，并且具有抗病毒、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等多種生物活性，在生物醫(yī)用材料及藥物傳遞系統(tǒng)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用研究。科研人員在對(duì)海洋多糖材料深入研究的基礎(chǔ)上，首次發(fā)現(xiàn)了海藻酸鈉形成的聚合物具有抑制胰蛋白酶酶解這一新的生物學(xué)特性。該聚合物通過(guò)纏繞包裹作用束縛蛋白酶，阻止其與底物的接觸，從而實(shí)現(xiàn)抑制酶解作用。該工作以活性蛋白藥物胰島素為模型，以海藻酸鈉為蛋白酶抑制劑，體外酶解實(shí)驗(yàn)表明該抑制劑可有效阻止胰蛋白酶對(duì)口服藥物的酶解，其抑酶效率約為現(xiàn)有同類商品的400倍，是理想的蛋白及多肽類活性藥物的功能性載體，為解決蛋白與多肽類藥物口服提供了新的策略，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

論文鏈接:Lv Y,Zhang J B,Song Y Z.Natural anionic polymer acts as highly efficient trypsin inhibitor based on an electrostatic interaction mechanism.

Macromolecular Rapid Communications,2014,18,1606-1610.Doi: 10.1002/marc.201400267.

Abstract: Sodium alginate (SA),acting as a trypsin inhibitor by means of electrostatic interaction,is studied.The half-maximal inhibitory concentration (IC50=0.05 μg mL-1) of this natural anionic polymer is about 400 times lower than that of commercial soybean trypsin inhibitor (STI).Unlike the Ca2+-deprivation mechanisms,its inhibition may be attributed to preventing the trypsin active site (TAS) from accessing the macromolecular substrates instead of denaturing it.SA is an efficient,innocuous,and cost-effective inhibitory excipient that can be conveniently used in many peptide and protein dosage formulations.

Study on Classification and Enzymatic Propertis of Deep-sea Bacteria Producing Lipase

WANG Kai,LIU Hong-guo,JIANG Kun,YAN Pei-sheng*

SchoolofMarineScienceandTechnology,HarbinInstituteofTechnologyatWeihai,ShandongWeihai264209,China

The bacterial strain FE10 producing lipase was screened from deep sea bacteria,which isolated from deep-sea sediment of South Atlantic.The molecular identification of 16S rRNA gene sequencing and phylogenetic analysis showed that FE10 belonged to the genusMarinobacter.The results of preliminary study on the lipase characterization showed that optimal temperature of the lipase activity was 40℃ under laboratory conditions.The lipase activity was high at pH 7,and almost disappeared at pH 9.

deep sea; microbes; lipase; 16S rRNA; enzymatic characteristics

2015-04-01; 接受日期：2015-04-24

中國(guó)大洋協(xié)會(huì)國(guó)際海域資源調(diào)查與開發(fā)“十二五”重大項(xiàng)目(DY125-15-R-01)；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金(BS2014NY012)；哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)科建設(shè)引導(dǎo)基金(WH20140202)資助。

王凱，講師，博士,研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物防治有害真菌的方法及機(jī)理、海洋功能細(xì)菌的多樣性及應(yīng)用。E-mail：ywkhit@hotmail.com。*通信作者：閆培生，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑸镔Y源與利用、海洋生物質(zhì)及其加工廢物的高值資源化、有害微生物的生物防治與生物農(nóng)藥、微生物發(fā)酵工程與生物制藥等。E-mail：yps6@163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.03.16