黃瓜棒孢葉斑病菌實時熒光定量PCR方法的建立與應(yīng)用

張艷菊，劉齊月，張 笛，陶 磊，王春龍，劉行風(fēng)，李雪蓮，馬 天，劉 東

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

黃瓜棒孢葉斑病又稱褐斑病、靶斑病。1906年首次在歐洲發(fā)現(xiàn)[1]，目前中國[2]、美國[3]、日本[4]、韓國[5]等地均有發(fā)生和報道。近年來黃瓜棒孢葉斑病在我國黃瓜種植區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，成為黃瓜生產(chǎn)主要病害之一[6]。黃瓜棒孢葉斑病一般在田間葉片發(fā)病率為10%～25%，嚴(yán)重時可達(dá)70%甚至100%[7]。黃瓜棒孢葉斑病菌侵染破壞力強、極易變異，防治難度超過黃瓜霜霉病，已由次要病害上升至世界主要病害[8]。當(dāng)前黃瓜棒孢葉斑病在黑龍江地區(qū)黃瓜保護(hù)地生產(chǎn)中十分常見，危害較重。

引起黃瓜棒孢葉斑病病原菌為多主棒孢[Corynesporacassiicola（Berk &Curt）Wei]，屬于絲孢綱（Hyphomycetes）暗色菌科（Dematiaceae）棒孢屬（Corynespora）真菌，1950 年統(tǒng)一定名為Corynespora cassiicola[9]。該病以危害葉片為主，根據(jù)不同溫濕度條件，葉部病斑分為3 種類型：小型斑、大型斑、多角型斑[10]。由于易于流行、發(fā)病范圍廣、危害重且該病癥狀易與黃瓜霜霉病、黃瓜細(xì)菌性角斑病及黃瓜炭疽病混淆，因此建立準(zhǔn)確、快速、靈敏、實用的黃瓜棒孢葉斑病菌檢測方法及早期監(jiān)測非常必要。

實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物病原真菌、細(xì)菌、病毒等多方面檢測。在黃瓜棒孢葉斑病菌應(yīng)用方面，孫炳學(xué)等建立一種快速、高效、定量檢測黃瓜多主棒孢（Corynespora cassiicola）琥珀酸脫氫酶B 亞基（SdhB）H278R 突變的實時熒光定量PCR（AS-real-time PCR）檢測方法[11]。高葦?shù)仍O(shè)計一種檢測土壤中黃瓜棒孢葉斑病菌的實時熒光定量PCR方法[12]，但其試驗?zāi)０鍨橥寥?，操作繁雜，難度大、成本高，且黃瓜棒孢葉斑病為氣傳病害[13]，建立葉片病菌檢測方法更適用于生產(chǎn)中病害的檢測與預(yù)測。

本試驗旨在設(shè)計一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的實時熒光定量PCR 方法，在侵染黃瓜葉片早期檢測黃瓜棒孢葉斑病菌，為黃瓜棒孢葉斑病預(yù)測預(yù)報和監(jiān)測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及菌株DNA提取

供試菌株：來自黑龍江省不同地區(qū)的5個黃瓜棒孢葉斑病菌株及7個黃瓜其他病害致病菌。黃瓜棒孢葉斑病菌（Corynespora cassiicola）為采集于黑龍江省并已鑒定的菌株，黃瓜霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）及黃瓜白粉病菌（Sphaerothecacu curbitae）采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實驗站。黃瓜角斑病菌（Pseudomonas syringae）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、黃瓜黑斑病菌（Alternaria cucumerina）、黃瓜黑星病菌（Cladosporium cucumerinum）及黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理研究室提供（見表1）。

供試作物品種：黃瓜（Cucumis sativusL.）感病品系D0401由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與園林學(xué)院黃瓜課題組提供。

表1 供試菌株名稱和來源Table 1 Codes and origin of the isolates used in this study

黃瓜棒孢葉斑病菌（C.cassiicola）、黃瓜黑斑病菌（A.cucumerina）、黃瓜黑星病菌（C.cucumerinum）、黃瓜炭疽病菌（C.orbiculare）培養(yǎng)于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板；黃瓜枯萎病菌（F.oxysporum）培養(yǎng)于馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）平板；黃瓜霜霉病菌（P.cubensis）、黃瓜白粉病菌（S.cucurbitae）收集于新鮮黃瓜葉片；黃瓜角斑病菌（P.syringae）置于28 ℃King B培養(yǎng)基中120 r·min-1搖動生長。收集培養(yǎng)后菌株，利用CTAB 法提取供試真菌及卵菌基因組DNA[14]，細(xì)菌基因組DNA采用改良CTAB法提取[15]。

1.2 特異性引物設(shè)計與驗證

參考Wu等列舉黃瓜棒孢葉斑病菌保守肌動蛋白序列actin[16]，選定黃瓜棒孢葉斑病菌actin 參考序列（GenBank:MH511656.1）及其他供試病原菌actin 序 列（GenBank： HM148567； KF178566；JQ965663；JQ671742.1），利用DNAMAN 軟件比對，Primier 6.0軟件設(shè)計10對特異性引物，引物序列見表2，由吉林省庫美生物科技有限公司合成，使用時將引物用ddH2O稀釋至10 μmol·L-1。

將上述引物分別以供試菌株基因組DNA（10 ng·μL-1）為模板作普通PCR擴增，檢測該引物對黃瓜棒孢葉斑病菌是否存在特異性。普通PCR反應(yīng)體系為（25 μL）：Premix Taq?12.5 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL、模板DNA（10 ng·μL-1）1 μL 和ddH2O 10.5 μL。陰性對照無DNA。擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用EPS-600 型電泳儀，Jel Doc 2001型凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD，美國），1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品制備

標(biāo)準(zhǔn)品為提純的目的基因片段，用于制作實時熒光定量PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線。普通PCR 反應(yīng)體系為（50 μL）：Premix Taq ?25 μL、上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL、黃瓜棒孢葉斑病菌基因組DNA（10 ng·μL-1）2 μL 和ddH2O 21μL；擴增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。制備1%含EB 瓊脂糖凝膠，取4 μL PCR產(chǎn)物，各加入2 μL 溴酚蘭溶液，用DL2000 DNA Marker作對照，恒壓電泳30 min，全自動凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。將PCR擴增產(chǎn)物膠回收（南京維諾贊生物技術(shù)有限公司），回收產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測是否存在目的基因條帶，若條帶存在則將膠回收產(chǎn)物送吉林庫美生物有限責(zé)任公司測序。

1.4 黃瓜棒孢葉斑菌實時熒光定量PCR體系建立與優(yōu)化

1.4.1 實時熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

本文將層次分析的方法應(yīng)用在礦井設(shè)計方案中，初步嘗試決策方法，應(yīng)用的結(jié)果證明，層次分析的方法非常簡單實用，具有系統(tǒng)性、邏輯性和靈活性，在采礦領(lǐng)域里，除了選擇礦井設(shè)計方案之外，還可以進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化、采礦方案優(yōu)化等，各類資源的設(shè)計、分配都可以實用層次分析法進(jìn)行判斷和處理。

為建立適合黃瓜棒孢葉斑病菌實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系，優(yōu)化退火溫度、模板濃度及引物濃度。

①退火溫度：將退火溫度設(shè)置為57、58、60、62 ℃4個退火溫度。

②模板濃度：根據(jù)不同濃度模板DNA 對產(chǎn)物擴增效率及反應(yīng)熒光吸收強度的影響，設(shè)置模板含量為1、2、3 μL（10 ng·μL-1），確定合適體系DNA模板濃度。

③引物濃度：根據(jù)反應(yīng)熔解曲線和產(chǎn)物擴增效率，將引物含量設(shè)置為0.2、0.3、0.4 μL（10 μmol·L-1)。

實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系為（20 μL）：10 μL Taq SYBR?Green qPCR Premix，0.2～0.4 μL 上下游混合引物（10 μmol·L-1），1～3 μL（10 ng·μL-1）模板DNA，ddH2O 補齊至20 μL。擴增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性10 s，52～58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.4.2 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

將標(biāo)準(zhǔn)品10 倍梯度稀釋，得到濃度梯度依次為1.36×101～1.36×10-7ng·μL-1模板DNA。每個濃度3 次重復(fù)，空白對照為滅菌ddH2O。利用已篩選反應(yīng)程序及反應(yīng)體系作實時熒光定量PCR，以起始濃度對數(shù)值為X 軸，以Cq 值為Y 軸構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線由實時熒光定量PCR軟件自動生成。

1.4.3 靈敏度與重復(fù)性試驗

將10 倍梯度稀釋的黃瓜棒孢葉斑病菌標(biāo)準(zhǔn)品作為模板作實時熒光定量PCR，確定該體系檢測黃瓜棒孢葉斑病菌最小濃度。

將3個稀釋濃度標(biāo)準(zhǔn)品作批次內(nèi)和批次間重復(fù)性試驗，驗證該檢測方法穩(wěn)定性。批內(nèi)重復(fù)試驗可對同一樣品同時測定3次重復(fù)，批間重復(fù)可在不同時間對同一樣品模板測定3次重復(fù)。SPSS 16.0統(tǒng)計軟件計算Cq值，得到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)差SD及變異系數(shù)CV，變異系數(shù)CV 小于2%時，認(rèn)為該反應(yīng)體系重復(fù)性與穩(wěn)定性良好。

1.5 實時熒光定量PCR 定量檢測黃瓜葉片棒孢葉斑病菌潛伏侵染量動態(tài)變化

1.5.1 供試菌株及作物

供試菌株：黃瓜棒孢葉斑病菌（Corynespora cassiicola），采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實驗站。供試作物品種：黃瓜高抗品種D9320（HR）、抗病品種美國小黃瓜（R）、中抗品種北京301（MR）、感病品種D805（S）、高感品種D0401（HS），由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黃瓜課題組提供。

1.5.2 育苗及接種

將5 個不同品種黃瓜種子播種于育苗穴盤中，7 d 后子葉展平時將幼苗移入營養(yǎng)缽內(nèi)，每缽留1株。白天25 ℃，夜晚15 ℃正常管理。待黃瓜第1片真葉展平時取下，將真葉打成直徑20 mm 葉盤。配制濃度為1×105個·mL-1黃瓜棒孢葉斑病菌孢子懸浮液，每個葉盤接種3滴濃度1×105個孢子·mL-1菌懸液，每滴10 μL，每個處理15 個葉盤，3 次重復(fù)，接種ddH2O設(shè)為對照，接菌后注意保濕避光。

1.5.3 采集樣品并調(diào)查病情指數(shù)

接種2、4、8、12、24、36、48、96 和120 h后各取樣1次，每次不同品種各采集3個葉盤，3次重復(fù)。清水反復(fù)沖洗后置于離心管中備用。同時調(diào)查發(fā)病情況。病情分級標(biāo)準(zhǔn)為[17]：0級：無病癥；1級：病斑面積占葉面積5%以下；2級：病斑面積占葉盤面積5%～25%；3 級：病斑面積占葉盤面積25%～50%；4級：病斑面積占葉盤面積50%以上。

1.5.4 提取樣品DNA并檢測侵染量

將收集的葉盤剪碎，混勻，稱取0.1 g，利用CTAB法提取黃瓜葉片基因組DNA。以得到的基因組DNA 為模板，應(yīng)用已優(yōu)化的實時熒光定量PCR體系檢測黃瓜棒孢葉斑病菌侵染黃瓜葉片侵染量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算每個時段黃瓜葉片內(nèi)棒孢葉斑病菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜棒孢葉斑病菌引物特異性檢測

提取供試菌株基因組DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1 所示。病原菌DNA 條帶清晰明亮，提取的DNA 具有較高濃度和純度，可用作底物模板以滿足下一步試驗要求。

表2為10對引物特異性檢測結(jié)果，“+”表示瓊脂糖凝膠電泳檢測有條帶，“-”表示瓊脂糖凝膠電泳檢測無條帶，結(jié)果顯示引物CAF2/CAR2 對黃瓜棒孢葉斑病菌具有良好特異性。

引 物CAF2（5'GCCTCGAGCTGTTTTCCGTAAG T3'）/CAR2（5'CCGATCATGATACTGGCAGT GGTC3'）擴增的來自不同地區(qū)黃瓜棒孢葉斑病菌和其他黃瓜病原菌瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖2?？梢妰H黃瓜棒孢葉斑病菌擴增出186 bp 特異性條帶，而其他黃瓜病害病原菌無條帶，表明引物CAF2/CAR2 可用作黃瓜棒孢葉斑病菌特異性引物。

圖1 病原菌DNA檢測電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of pathogen DNA

表2 引物特異性檢測結(jié)果Table 2 Primer pairs used in this study and the specific test result

圖2 引物CAF2/CAR2對黃瓜棒孢葉斑病菌特異性檢測結(jié)果Fig.2 Specific detection results of cucumber target leaf spot by primer CAF2/CAR2

2.2 目的基因鑒定

將膠回收純化后（見圖3）目的基因產(chǎn)物送至吉林庫美生物有限責(zé)任公司測序。結(jié)果表明，CAF2/CAR2 擴增出的黃瓜棒孢葉斑病菌目的基因為186 bp。

圖3 膠回收電泳結(jié)果Fig.3 Gel recovery product detection electropherogram

其序列如下：CTTAACCGTAAACTATGCCGA CTAGGGATCGGGCGATGTTTCTATCTTGACTCGCT CGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCT GGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAG AAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCC TGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAA。

2.3 黃瓜棒孢葉斑病菌實時熒光定量PCR 體系建立與優(yōu)化

2.3.1 退火溫度

3 種濃度模板在退火溫度為57、58、60 和62 ℃下平均Cq 值和熒光信號強度見表3?？梢?，模板濃度相同時，退火溫度60 ℃，Cq 值最小，對應(yīng)熒光信號強度最強，表明該反應(yīng)在60 ℃時具有較高擴增效率。而在其他退火溫度下，反應(yīng)擴增效率低、不穩(wěn)定。因此，當(dāng)退火溫度為60 ℃時，實時熒光定量PCR反應(yīng)最穩(wěn)定。

2.3.2 模板濃度

將黃瓜棒孢葉斑病菌DNA 模板分別以1、2 和3 μL（10 μmol·L-1）添加至反應(yīng)體系，根據(jù)熔解曲線穩(wěn)定性確定合適的DNA 模板濃度，如圖4 所示。當(dāng)模板加入量為3 μL 時，曲線總體穩(wěn)定，加入量為1或2 μL時，熔解曲線與3μL濃度相比，表達(dá)不穩(wěn)定。因此，當(dāng)檢測系統(tǒng)中DNA 模板量為3μL時，更有利于樣品基因表達(dá)。

表3 不同退火溫度下實時熒光定量PCR Cq值和熒光強度Table 3 Cq value and intensity of fluorescence signal in different annealing temperature

圖4 不同DNA濃度熔解曲線Fig.4 Melting curves of different DNA concentrations

2.3.3 引物濃度

引物以0.2、0.3 和0.4 μL（10 μmol·L-1）添加到反應(yīng)系統(tǒng)中時，可根據(jù)熔解曲線確定適合引物量（見圖5）。

由圖5 可知，當(dāng)體系中引物量為0.2 μL（10 μmol·L-1）時，熔解曲線表達(dá)最穩(wěn)定。當(dāng)引物添加量為0.3 或0.4 μL 時，反應(yīng)熔解曲線明顯不一致，且曲線導(dǎo)數(shù)不同。當(dāng)引物添加0.2 μL 時，熔解曲線顯示相同趨勢，反應(yīng)過程更穩(wěn)定。因此，體系中引物最適添加量為0.2 μL（10 μmol·L-1）。

圖5 不同引物濃度熔解曲線Fig.5 Melting curves of different primer concentrations

2.4 黃瓜棒孢葉斑病菌實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

應(yīng)用上述優(yōu)化實時熒光定量PCR 體系，對濃度梯度為1.36×101～1.36×10-7ng·μL-1標(biāo)準(zhǔn)品作實時熒光定量PCR 處理，獲得各自Cq 值（見表4），標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6。由于1.36×101～1.36×10-7ng·μL-1間濃度拷貝數(shù)與其對應(yīng)Cq值具有良好線性關(guān)系，因此選擇此濃度梯度為模板。標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.995（>0.95），斜率為-3.54（-3.58～-3.10），擴增效率為108.23%（90%～110%）。標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y=28.06-3.54x。

表4 濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)Cq值Table 4 Cq value of concentration gradient standard DNA

圖6 黃瓜棒孢葉斑病菌實時熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of Corynespora cassiicola using real-timefluorescence quantitativePCR

2.5 黃瓜棒孢葉斑病菌實時熒光定量PCR 靈敏度、穩(wěn)定性和可重復(fù)性檢驗

選擇1.36×10-1～1.36×10-7ng·μL-110 倍濃度梯度的7 個標(biāo)準(zhǔn)品作實時熒光定量PCR 反應(yīng)（如圖7 所示），檢測到標(biāo)準(zhǔn)品DNA 最小濃度為1.36×10-6ng·μL-1。

為驗證該體系可重復(fù)性和穩(wěn)定性，測試3個濃度標(biāo)準(zhǔn)品批次內(nèi)和批次間重復(fù)性。表5所示為反應(yīng)Cq 值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，其中組內(nèi)和組間重復(fù)變異系數(shù)均小于2%，說明該體系具有良好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。

圖7 實時熒光定量PCR靈敏感度檢測Fig.7 Sensitivity detection of primers by real-time fluorescence quantitative PCR

表5 黃瓜棒孢葉斑病菌實時熒光定量PCR體系穩(wěn)定性檢測Table 5 Stability detection of real-time fluorescence quantitative PCR system for Corynespora cassiicola

2.6 應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測黃瓜葉片中棒孢葉斑病菌潛伏侵染量動態(tài)變化

2.6.1 黃瓜接種后發(fā)病情況

黃瓜棒孢葉斑病菌點滴接種黃瓜真葉葉盤后，將溫度控制在17～25 ℃，相對濕度80%以上，參考黃瓜棒孢葉斑病菌病情分級標(biāo)準(zhǔn)[17]，發(fā)病癥狀及病情級別如圖8 所示，其中A 表示0 級發(fā)病植株葉片癥狀；B表示1級發(fā)病植株葉片癥狀；C表示2級發(fā)病植株葉片癥狀；D表示3級發(fā)病植株葉片癥狀；E表示4級發(fā)病植株葉片癥狀。

圖8 黃瓜棒孢葉斑病不同級別發(fā)病癥狀Fig.8 Symptoms of cucumber target leaf spot with different disease level

2.6.2 接種后不同時間黃瓜葉片病情級別及葉片帶菌量

表6為黃瓜棒孢葉斑病菌接種5種不同抗性黃瓜真葉葉盤后病情級別及病菌在植物組織內(nèi)潛伏侵染量Cq值變化及病菌濃度。Cq值大于30表示病菌未侵染黃瓜葉片，可將此部分忽略不計。病情級別調(diào)查結(jié)果說明不同抗性黃瓜品種潛伏期表現(xiàn)不同，對于高抗品種，黃瓜棒孢葉斑病菌潛伏期最長，為96 h；抗性品種與中抗品種病菌潛伏期為48 h；感病品種與高感品種病菌潛伏期為24 與12 h。而Cq 值反映黃瓜棒孢葉斑病菌真正開始侵染黃瓜葉片時間：對于高抗品種、抗性品種、中抗品種，黃瓜棒孢葉斑病菌侵染時間為接種后8 h，對于感病品種與高感品種，接種后4 h 即可檢出。由此可見，實時熒光定量PCR 檢測可在黃瓜葉片外觀無任何癥狀時即檢測到黃瓜棒孢葉斑病菌存在，證明其快速靈敏的特點，也為不同抗性黃瓜品種防治時間選擇提供理論依據(jù)。表6 還可看出，未接種黃瓜葉片CK 無Cq 值，說明寄主DNA 不影響病菌檢測。

表6 接種后不同時間黃瓜葉片病情級別及葉片帶菌量Table 6 Disease level and amount of Corynespora cassiicola in cucumber leaves at different times after inoculation

3 討論與結(jié)論

黃瓜棒孢葉斑病是主要侵染黃瓜葉片、通過氣流傳播的病害。該病流行迅速且難以防治，癥狀又易與其他黃瓜病害混淆，特別是在早期階段，難以通過癥狀直接區(qū)分。而實時熒光定量PCR 技術(shù)可靈敏、特異地識別并量化空氣和植物中病原菌，因此本試驗篩選出一對黃瓜棒孢葉斑病菌特異性引物CAF2/CAR2，該引物可區(qū)分黃瓜棒孢葉斑病菌與其他幾種在癥狀上易混淆的黃瓜致病菌。同時優(yōu)化實時熒光定量PCR 反應(yīng)條件，建立黃瓜棒孢葉斑病菌實時熒光定量PCR 檢測方法?？稍诓【秩驹缙诳焖佟?zhǔn)確鑒定黃瓜棒孢葉斑病，還可用于監(jiān)測黃瓜棒孢葉斑病菌動態(tài)變化，指導(dǎo)病害科學(xué)防治，防止病害爆發(fā)流行。

在實時熒光定量PCR 方法選擇上，本研究選用熒光染料SYBR GreenⅠ法，與Taq Man 探針法相比，該方法可監(jiān)測任何dsDNA 序列擴增，檢測方法較為簡單，成本較低[18]。實時熒光定量PCR有相對定量和絕對定量兩種，相對定量是在一定樣本中靶序列相對于另一參照樣本量的變化，即比較處理樣本和未處理樣本相對基因的表達(dá)差異[19]，而絕對定量是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣本拷貝數(shù)進(jìn)而對未知樣本定量。本研究并未涉及與另一參照樣本比較，因此明確葉片中黃瓜棒孢葉斑病菌侵染量及動態(tài)變化，選擇絕對定量法更簡潔快速，成本更低。

與已報道檢測土壤中黃瓜棒孢葉斑病菌實時熒光定量PCR體系相比[12]，本體系更適用于黃瓜葉片中病菌檢測。以此檢測方法為基礎(chǔ)，可開展田間黃瓜棒孢葉斑病監(jiān)測與預(yù)測預(yù)報工作，在田間僅需采集黃瓜葉片并作熒光定量PCR 檢測，即可明確黃瓜棒孢葉斑病菌有無及侵染量，為病害流行監(jiān)測提供依據(jù)。

黃瓜棒孢葉斑病菌人工接種通常采用葉片噴霧接種法[20]，難以控制接菌量，本研究需對葉片中病菌精確定量，因此選擇點滴接種法。與噴霧接種法相比，該方法保證每個葉盤接種菌量相同，保證后續(xù)定量檢測結(jié)果準(zhǔn)確性。截止目前，葉盤發(fā)病病情分級尚無通用標(biāo)準(zhǔn)，本研究參考棒孢葉斑病通用分級標(biāo)準(zhǔn)[17]，將黃瓜葉片等比例縮放后判斷葉盤病情級別，黃瓜感病品種接種棒孢葉斑病菌至肉眼可觀察到病斑為24 h 左右，與Sharma[21]與Liu 等[22]研究結(jié)果相同。本研究建立實施熒光定量PCR 方法應(yīng)用于黃瓜葉片中棒孢葉斑病菌潛伏侵染量檢測，明確黃瓜棒孢葉斑病在5種不同抗性黃瓜品種上的侵染時間，結(jié)合栽培品種抗病性，在生產(chǎn)實踐中可為黃瓜棒孢葉斑病防治提供參考。