一個(gè)來(lái)源于稻平臍蠕孢的α-阿拉伯呋喃糖苷酶

邢亞欣 黃火清 蘇小運(yùn)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所 農(nóng)業(yè)部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，北京 100081）

木聚糖是植物細(xì)胞壁的重要組成成分。作為最常見的半纖維素，它連接細(xì)胞壁中的木質(zhì)素和纖維素，是人類谷物來(lái)源食物的常見成分。木聚糖是自然界中除纖維素外第二豐富的可再生生物質(zhì)多糖，并廣泛存在于硬木（15%-30%）、軟木（7%-10%）和草本類植物中（低于30%）［1］。木聚糖的主鏈由木糖單元經(jīng) β-1，4-糖苷鍵連接而成，而其支鏈結(jié)構(gòu)由于來(lái)源的不同而有所差異。異質(zhì)性木聚糖側(cè)鏈的存在限制了β-1，4-內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶與木聚糖的結(jié)合，從而降低了木聚糖的可降解性。側(cè)鏈的組成成分主要包括阿拉伯糖、乙酸、阿魏酸和4-甲基葡萄糖醛酸等。因此，對(duì)于異質(zhì)性木聚糖、尤其是如玉米糠類側(cè)鏈結(jié)構(gòu)極為復(fù)雜的異質(zhì)性木聚糖，側(cè)鏈必須首先被相應(yīng)的阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰酯酶、阿魏酸酯酶和α-葡萄糖醛酸酶降解，才能使木聚糖主鏈發(fā)生有效的降解。木聚糖完全降解成單糖組分，需要不同酶混合使用，這包括內(nèi)切-1，4-β-木聚糖酶（EC3.2.1.8）、β-D-木糖苷酶（EC3.2.1.37）、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（EC 3.2.1.55）、α-葡糖醛酸糖苷酶（EC 3.2.1.139）、乙酰木聚糖酯酶（EC 3.1.1.72）和阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73）［2］。

阿拉伯呋喃糖苷酶在木聚糖酶法解聚中的功能是從異質(zhì)性阿拉伯葡萄糖醛酸木聚糖的木糖主鏈去除阿拉伯糖側(cè)鏈。阿拉伯呋喃糖苷酶主要存在于4個(gè)不同的家族（GH43、GH51、GH54 和GH62）［3］，它們使用反轉(zhuǎn)（GH 43）或保留（GH 51、GH54）的機(jī)制來(lái)水解阿拉伯呋喃糖苷鍵。其中GH43 家族的阿拉伯呋喃糖苷酶最為常見；此家族的成員具有不同的底物特異性。根據(jù)底物特異性，阿拉伯呋喃糖苷酶可分為3 大類：（1）A 型酶：僅對(duì)短鏈寡糖和pNP-α-L-阿拉伯呋喃糖苷有活性［4］；（2）B 型酶：底物特異性更廣，能降解短寡糖和長(zhǎng)多糖（如阿拉伯木聚糖和阿拉伯聚糖）［5］；（3）C 型酶：主要對(duì)阿拉伯木聚糖有活性［6-8］。

由于阿拉伯糖側(cè)鏈和木聚糖主鏈連接方式的不同，即使對(duì)于降解阿拉伯木聚糖寡糖的阿拉伯呋喃糖苷酶，還可以進(jìn)一步依據(jù)它們是否僅從單取代的木糖殘基（Ara-m）［9-11］或僅從雙取代的木糖殘基（Ara-d）中釋放α-L-阿拉伯糖［12-15］來(lái)區(qū)分。例如，Ara-m 是最常見的阿拉伯呋喃糖苷酶，它們只降解單取代的阿拉伯呋喃糖苷鍵，在所有GH 家族中均能找到；而從雙取代的木糖主鏈切割α-（1 →3）-連接的阿拉伯呋喃糖的酶則可被命名為Ara-d3，表明該酶可對(duì)于雙取代底物切割的特異性。同Ara-m阿拉伯呋喃糖苷酶相比，Ara-d 型阿拉伯呋喃糖苷酶發(fā)現(xiàn)的非常少［16］。玉米糠富含異質(zhì)性木聚糖，其上有豐富的2，3-雙取代阿拉伯糖側(cè)鏈，一般的阿拉伯呋喃糖苷酶均不能將其降解，因而阻礙了將其進(jìn)行資源化利用。為了找到適于降解此類異質(zhì)性木聚糖的新阿拉伯呋喃糖苷酶，本研究從稻平臍蠕孢（Bipolaris oryzae）中克隆得到一個(gè)序列新穎的GH43 家族酶基因BoAra43A，將其進(jìn)行重組表達(dá)和并進(jìn)行了生化性質(zhì)表征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 稻平臍蠕孢（B. oryzae）由中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保存，編號(hào)CGMCC 3.13730。大腸桿菌（Escherichia coli）Trans1-T1 用于質(zhì)粒的構(gòu)建和擴(kuò)增、Transetta（DE3）用于重組蛋白的表達(dá)，均購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。pET-28a（+）質(zhì)粒用于在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRI、NotI 和BglII購(gòu) 于Thermo Scientific公司；2× Phanta Max Master Mix，2× ClonExpress Mix 購(gòu)于諾唯贊公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自北京索萊寶公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)于天根生物技術(shù)有限公司；真菌基因組提取試劑盒和DNA 純化試劑盒購(gòu)于Omega Bio-Tek 公司；BSA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific 公司。對(duì)硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷（pNPA）購(gòu)自Sigma 公司。水溶性小麥阿拉伯木聚糖及32-α-L-arabinofuranosyl-（1，5）-α-Larabinotriose、23，33-di-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose（A2，3XX）、23，33-di-α-L-arabinofuranosyl-xylotetraose（XA2，3XX）、32-α-L-Arabinofuranosyl-xylobiose（A3X）、33-α-L- plus 23-α-L-arabinofuranosyl-xylotetraose（XA3XX/XA2XX）mixture、33-α-L-arabinofuranosyl-xylotetraose（XA3XX）、23-α-L-arabinofuranosyl-xylotriose（A2XX）和arabinopentaose、22，32-di-α-L-arabinofuranosyl-（1，5）-α-L-arabinotriose plus 32-α-L-arabinofuranosyl-（1，5）-α-L-arabinotetraose 等寡糖均購(gòu)于Megazyme 公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 馬鈴薯培養(yǎng)基PD（Potato dextrose）用于活化稻平臍蠕孢的菌株，購(gòu)自VWR 公司，固體中加入2%瓊脂。LB 培養(yǎng)基用于大腸桿菌的培養(yǎng)，其成分為：酵母浸粉0.5%，蛋白胨 1%，氯化鈉 1%。

1.2 方法

1.2.1 α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶基因BoAra43A 的克隆 將稻平臍蠕孢CGMCC 3.13730 于28℃在PDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7 d，過(guò)濾收集菌絲壓干，加入液氮速凍，反復(fù)研磨破碎菌體，參考說(shuō)明方法使用真菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA。通過(guò)BLAST 分析，從稻平臍蠕孢的基因組中分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)GH43家族的酶，經(jīng)預(yù)測(cè)其可能有一個(gè)內(nèi)含子，因此設(shè)計(jì)引物（F1/R1 和F2/R2，表1），通過(guò)PCR 擴(kuò)增獲得目的基因。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃1min 30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。將擴(kuò)增得到的目的基因片段再經(jīng)overlap PCR擴(kuò)增得到全長(zhǎng)基因，純化后連接pET-28a（+）載體，進(jìn)行測(cè)序。

表1 本研究中用到的引物

1.2.2BoAra43A 基因的重組表達(dá) 將BoAra43A 目的片段（已去除內(nèi)含子和編碼信號(hào)肽的部分）與pET-28a（+）載體連接，轉(zhuǎn)化Trans1-T1，通過(guò)PCR和測(cè)序篩選獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-BoAra43A。將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Transetta（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有卡那霉素和氯霉素的LB 固體平板，37℃培養(yǎng)12 h。挑取單克隆到50 mL LB 培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)；按2%接種量接入300 mL LB 培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)至菌濃OD600達(dá)到0.6-0.8 左右，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，16℃搖床繼續(xù)培養(yǎng)16 h。菌液于12 000×g離心2 min 收集菌體。用NTA20磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，50 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑）重懸細(xì)胞，超聲破碎菌體，離心收集上清。用鎳親和層析柱純化重組蛋白BoAra43A：用含不同濃度梯度咪唑（NTA20、40、60、80、100、200、400 和500）的緩沖液（20 mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4，50 mmol/L NaCl，20 mmol/L-500 mmol/L 咪唑）洗脫目的蛋白，收集不同濃度梯度的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白電泳檢測(cè)純度。合并純化蛋白，使用超濾管離心法將純化后蛋白的緩沖液置換為20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 7.4。

1.2.3 底物特異性 將0.5 μmol/L 的酶和10 mg/mL的小麥阿拉伯木聚糖（WAX）、玉米糠（CX）、玉米糠堿提物（CX-NaOH）和200 μg/mL 寡糖（9 種），2 mmol/LpNPA 分別混合，在50℃，pH 5.0 的條件下孵育4 h，對(duì)前3 種多糖底物，使用DNS 法測(cè)定還原糖的釋放；對(duì)寡糖，采用HPAEC-PAD 的方法來(lái)測(cè)定酶活性；對(duì)pNPA，使用1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，在OD405處測(cè)定吸光度值。

1.2.4BoAra43A 的最適溫度、最適pH、熱穩(wěn)定性和pH 穩(wěn)定性測(cè)定 最適溫度：在pH5.0 的條件下，將0.5 μmol/L 的酶和10 mg/mL 的WAX 底物混合，于不同溫度下（30-80℃）孵育20 min，以DNS 法測(cè)定釋放的還原糖。最適pH：將0.5 μmol/L 的酶和10 mg/mL 的WAX 底物在pH 2.0-12.0 的不同緩沖液中混合，于50℃反應(yīng)20 min，測(cè)定還原糖。所用緩沖液如下：0.2 mol/L 甘氨酸-鹽酸pH 2.0-3.0；0.2 mol/L 磷酸氫二鈉-檸檬酸pH 4.0-7.0；0.2 mol/L Tris-HCl 緩沖液pH 8.0-9.0；0.2 mol/L 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液pH 10.0-12.0。熱穩(wěn)定性：將0.5 μmol/L的重組酶于pH 5.0 分別在40℃、50℃和60℃處理1 h，在不同時(shí)間點(diǎn)取樣（0、10、30、45、60 和120 min），在50℃和pH 5.0 條件下測(cè)定剩余酶活。pH 穩(wěn)定性：將酶首先在不同pH 值的緩沖液中37℃處理1 h，再在50℃和pH 5.0 條件下測(cè)定剩余酶活。

1.2.5 比活力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定1個(gè)酶活性單位（U）定義為在最適反應(yīng)條件（pH 5.0，50℃）下，每分鐘分解底物WAX 生成1 μmoL 阿拉伯糖所需的酶量；酶的活性相對(duì)于酶量的比值即為酶的比活力（每毫克蛋白所含的酶活力單位）。對(duì)于動(dòng)力學(xué)參數(shù)，在50℃和pH 5.0 條件下測(cè)定酶在不同濃度底物WAX（1-10 mg/mL）下的酶活，利用米氏方程雙倒數(shù)法（Lineweaver-Burk）作圖并繪制曲線，求出Km值和Vmax。

1.2.6 離子色譜分析水解產(chǎn)物 對(duì)于小麥阿拉伯木聚糖，將0.5 μmol/L 的酶和10 mg/mL 的底物混合，在50℃、pH 5.0 條件下反應(yīng)4 h。對(duì)于寡糖類底物，則將0.5 μmol/L 的酶和200 μg/mL 的底物混合，同樣條件下反應(yīng)4 h。水解產(chǎn)物做適當(dāng)稀釋后進(jìn)行離子色譜分析。具體為：底物為WAX 的反應(yīng)產(chǎn)物稀釋100倍，其他底物均稀釋10 倍。離子色譜儀器為賽默飛Chromeleon 高效液相色譜分析系統(tǒng)，色譜分離柱為CarboPacTMPA100（4.0×250 mm，8.5 μm），流動(dòng)相A（超純水），流動(dòng)相D（1 mol/L 的NaOH）；梯度洗脫條件100%A洗脫4 min，0-100%D洗脫16 min，100%D洗脫6 min。

1.2.7BoAra43A 和PsAra43A 的協(xié)同作用 將0.5 μmol/L 的BoAra43A 和0.5 μmol/L 的PsAra43A，加入至450 μL 的10 mg/mL 玉米糠堿提物（CX-NaOH）中。協(xié)同作用測(cè)定了3 種酶的添加方式，即（1）同時(shí)加入兩種酶，在pH 5.0、50℃條件下一共反應(yīng)4 h；（2）首先加入BoAra43A，在pH 5.0、50℃條件下反應(yīng)4 h，之后置于100℃沸水中煮沸10 min 終止反應(yīng)，再加入PsAra43A 繼續(xù)反應(yīng)4 h；（3）首先加入PsAra43A，在pH 5.0、50℃條件下反應(yīng)4 h，之后置于100℃沸水中煮沸10 min 終止反應(yīng)，再加入BoAra43A 繼續(xù)反應(yīng)4 h。通過(guò)DNS 法測(cè)定所釋放的還原糖并計(jì)算協(xié)同效應(yīng)（Degree of synergy，DoS）。DoS 定義為加入兩種酶的反應(yīng)中，所產(chǎn)生的總還原糖與各單酶反應(yīng)產(chǎn)生還原糖簡(jiǎn)單相加總和的比值。

1.2.8 堿提玉米糠木聚糖的制備 制備步驟如下：（1）玉米淀粉加工副產(chǎn)物玉米麩皮100 g，1∶6（W/V）比例加入去離子水，加熱至90℃，按（30 U/g）比例加入淀粉酶消化；（2）紗布過(guò)濾，水洗3 遍濾渣，固形物置于恒溫干燥箱50℃干燥；（3）粉碎機(jī)粉碎，過(guò)50 目篩；（4）按1∶10（W/V）的比例加入1 mol/L 的NaOH，60℃恒溫?cái)嚢? h；（5）自然冷卻至室溫，1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH 至6-7；（6）12 000×g離心20 min，取上清液；（7）上清液與無(wú)水乙醇按照1∶4 的比例加入無(wú)水乙醇，靜置2 h，獲得沉淀物；（8）沉淀物在40℃條件下恒溫干燥，粉碎即得粗提玉米糠木聚糖。粗提玉米糠木聚糖得率為原料玉米糠質(zhì)量的23%。

2 結(jié)果

2.1 BoAra43A基因的克隆與序列分析

通過(guò)PCR 從稻平臍蠕孢的基因組中擴(kuò)增得到一條長(zhǎng)1 593 bp 的基因。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼長(zhǎng)度為531 個(gè)氨基酸的多肽且無(wú)信號(hào)肽。所編碼的蛋白預(yù)測(cè)有3 個(gè)N 糖基化位點(diǎn)，分別為Thr81、Thr138 和Thr207；計(jì)算的蛋白分子量為57.85 kD，等電點(diǎn)為8.69。BlastP 比對(duì)結(jié)果顯示BoAra43A 屬于GH43 家族，與來(lái)源于特異腐質(zhì)霉的、已知能降解玉米糠側(cè)鏈的阿拉伯呋喃糖苷酶HiAXHd3 的一致性為63%（圖1）。通過(guò)序列比對(duì)分析，結(jié)合對(duì)已報(bào)道的GH43 家族阿拉伯呋喃糖苷酶的晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，GH43 家族中3 個(gè)保守的催化殘基在BoAra43A 也存在，分別為Asp46、Asp170和Glu218（圖1）。和阿拉伯木聚糖結(jié)合相關(guān)的殘基在HiAXHd3 中為His272、Asp291 和Arg297，在BoAra43A 中，相對(duì)應(yīng)的殘基也為His272、Asp291和Arg297（圖1）。這些保守氨基酸殘基說(shuō)明BoAra43A 可能存在阿拉伯呋喃糖苷酶的活性。

2.2 BoAra43A的表達(dá)與蛋白純化

用鎳柱純化大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白，SDSPAGE 驗(yàn)證結(jié)果如圖2，其表觀分子量與理論值基本相符（箭頭所指）。

2.3 BoAra43A的酶學(xué)性質(zhì)分析

以10 mg/mL 的小麥阿拉伯木聚糖、玉米糠和玉米糠堿提物（主要成分之一為木聚糖）作為底物，在50℃、pH 5.0 的條件下進(jìn)行還原糖測(cè)定，發(fā)現(xiàn)BoAra43A 對(duì)3 種底物均可測(cè)得一定活性，其中對(duì)小麥阿拉伯木聚糖的活性最高。使用HPAEC-PAD 分析（圖3）發(fā)現(xiàn)，從3 種底物中均只釋放出阿拉伯糖為最終產(chǎn)物，證明BoAra43A 為阿拉伯糖呋喃糖苷酶。以pNPA 為底物，卻未能檢測(cè)到BoAra43A 對(duì)其的相關(guān)活性。

圖1 BoAra43A 和特異腐質(zhì)霉阿拉伯呋喃糖苷酶HiAXHd3 的氨基酸序列比對(duì)

選擇活性最高的小麥阿拉伯木聚糖為底物，測(cè)得BoAra43A 的最適溫度為50℃，在40℃仍有68%活性，在30℃有60%活性。當(dāng)孵育溫度從50℃升為60℃，酶活快速下降至25%，并緩慢下降至80℃的12%（圖4-A）。BoAra43A 的最適pH 為5.0，在pH 3.0 時(shí)仍有20%活性，在pH 7.0 時(shí)有50%活性，但在pH 2.0和9.0活性下降至幾乎檢測(cè)不到（圖4-B）。該酶在40℃和50℃溫浴10 min 均可保持85%左右的酶活性，在60℃溫浴10 min 則基本喪失酶活力。在40℃保溫2h后，阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A還可保持80%酶活性。但在50℃溫浴30 min 只剩下20%左右的酶活性，溫浴1h基本喪失酶活力（圖4-C）。在pH 2.0-12.0 的范圍內(nèi)37℃保溫1 h，BoAra43A 均可以保持80%左右的酶活力（圖4-D）。對(duì)小麥阿拉伯木聚糖，BoAra43A 的比活為191.21 U/mg，動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km和kcat分別是9.54 mg/mL 和1.043×10-3s-1。

2.4 BoAra43A的作用模式分析

從上述對(duì)多糖的離子色譜分析表明，BoAra43A特異的從多糖中釋放出阿拉伯糖。為了進(jìn)一步分析其作用模式，選取了9 種含阿拉伯糖的寡糖作為底物同BoAra43A 進(jìn)行孵育，并以離子色譜進(jìn)行分析（圖5）。表2 是這9 種含阿拉伯糖的寡糖的結(jié)構(gòu)模式圖及降解結(jié)果匯總。除了阿拉伯五糖，這9 種寡糖分別以木糖或阿拉伯糖聚合體作為主鏈，但均帶有阿拉伯糖的側(cè)鏈，阿拉伯糖側(cè)鏈分別以α-（1 →2）和α-（1 →3）鍵和主鏈連接。結(jié)果表明，BoAra43A 僅能與A2，3XX、XA2，3XX、AA2，3AA/AAA3A 這3 種底物反應(yīng)產(chǎn)生阿拉伯糖，與A2XX、XA3XX 和AA3A 均不反應(yīng)。這些結(jié)果（圖5）顯示，BoAra43A 只能特異識(shí)別側(cè)鏈上具有雙取代的寡糖，且不論主鏈?zhǔn)悄竟烟沁€是阿拉伯寡糖。雖然XA2，3XX 可以被降解而單取代的XA3XX 不能被降解，但從反應(yīng)產(chǎn)物分析來(lái)看，BoAra43A 和A2，3XX反應(yīng)后生成了A2XX，和XA2，3XX 反應(yīng)后并未生成XA3XX（圖5），暗示該酶特異識(shí)別的有可能是雙取代側(cè)鏈上α-（1 →3）連接的阿拉伯糖。

圖2 重組蛋白BoAra43A 的純化

圖3 離子色譜分析BoAra43A 降解多糖的反應(yīng)產(chǎn)物

圖4 溫度及pH 對(duì)BoAra43A 的影響測(cè)定

2.5 BoAra43A和PsAra43A協(xié)同水解異質(zhì)性木聚糖

PsAra43A 是來(lái)源于Paenibacillussp. Strain E18的GH43 阿拉伯呋喃糖苷酶，可能降解α-（1 →2）或α-（1 →3）的單取代阿拉伯糖側(cè)鏈，其作用模式不同于BoAra43A。該酶能降解小麥阿拉伯木聚糖，但卻對(duì)堿抽提的玉米木聚糖和脫淀粉玉米糠無(wú)任何活性。因此，分別選取0.5 μmol/L 的BoAra43A 和PsAra43A 和堿抽提后的玉米木聚糖進(jìn)行反應(yīng)。從圖6 可看出，在等比例BoAra43A 和PsAra43A 條件下，同時(shí)加入兩種酶，或先加PsAra43A 再加BoAra43A并未產(chǎn)生協(xié)同降解的作用；但當(dāng)先加入BoAra43A 孵育4h以去除2，3-雙取代上3 號(hào)位的阿拉伯糖側(cè)鏈后，反應(yīng)總體上釋放的阿拉伯糖大大增強(qiáng)，具強(qiáng)烈的協(xié)同作用（協(xié)同系數(shù)=1.34）。

圖5 BoAra43A 降解寡糖底物的產(chǎn)物的離子色譜分析

表2 BoAra43A 降解木寡糖及阿拉伯寡糖分析

圖6 BoAra43A 與PsAra43A 協(xié)同降解堿抽提玉米木聚糖

3 討論

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量廢棄物，如農(nóng)作物收獲時(shí)殘留在農(nóng)田內(nèi)的農(nóng)作物秸稈（包括玉米秸、高粱秸、稻草和小麥秸稈等）以及在農(nóng)作物加工過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄物，如米糠、麥麩和玉米糠（或稱為玉米皮）等［16］，它們都屬于可再生的生物質(zhì)資源。然而由于植物纖維結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，使用糖苷水解酶來(lái)降解其中的一些生物質(zhì)多糖效率還不高［17］。例如，在生產(chǎn)生物燃料和生物基化學(xué)品時(shí)酶的成本是產(chǎn)品的主要成本之一；而在養(yǎng)殖領(lǐng)域，雖然添加飼料酶已成為提高飼料轉(zhuǎn)化率和降低養(yǎng)殖成本的標(biāo)準(zhǔn)做法，但玉米糠由于其極為復(fù)雜的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，很少有酶能有效的將其降解，因此阻礙了玉米中營(yíng)養(yǎng)成分的釋放和進(jìn)一步將其資源化利用。

本研究從稻平臍蠕孢中克隆得到一個(gè)序列新穎的GH43 家族阿拉伯呋喃糖苷酶基因BoAra43A，并成功將該基因在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)。分析發(fā)現(xiàn)，BoAra43A 能降解小麥阿拉伯木聚糖、經(jīng)預(yù)處理或未經(jīng)處理的玉米糠木聚糖；該酶只和寡糖如A2，3XX、XA2，3XX 和AA2，3AA/AAA3A 進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物均釋放出阿拉伯糖；該酶對(duì)所測(cè)定的側(cè)鏈單取代的木寡糖沒有任何的降解，因此可以推斷，BoAra43A 所降解的鍵型為側(cè)鏈雙取代上3 號(hào)位的糖苷鍵，這與已報(bào)道的具降解雙取代阿拉伯糖側(cè)鏈的阿拉伯呋喃糖苷酶的性質(zhì)一致。有意思的是，對(duì)于具有這種糖苷鍵連接的寡糖，不論主鏈?zhǔn)悄竟烟沁€是阿拉伯寡糖均能被降解；這可能是由于阿拉伯糖和木糖具有非常相似的分子結(jié)構(gòu)，因而BoAra43A 的底物結(jié)合口袋可以容納不同的寡糖主鏈。

目前，發(fā)現(xiàn)能降解雙取代阿拉伯糖側(cè)鏈的阿拉伯呋喃糖苷酶還較少。此前發(fā)現(xiàn)的3 個(gè)能夠降解雙取代阿拉伯木聚糖上的阿拉伯呋喃糖苷酶，兩個(gè)分別來(lái)自特異腐質(zhì)霉和青春雙歧桿菌的GH43 酶，其中又以特異腐質(zhì)霉的阿拉伯呋喃糖苷酶HiAXHd3 研究較多。另一個(gè)則來(lái)自于青春雙歧桿菌的GH51 家族酶AbfB［18］。來(lái)源于稻平臍蠕孢（Bipolaris oryzae）的BoAra43A 為第3 個(gè)來(lái)自GH43 的阿拉伯呋喃糖苷酶，可降解雙取代阿拉伯木聚糖上3 號(hào)位的阿拉伯糖。來(lái)源于特異腐質(zhì)霉H. insolens的HiAXHd3 的最適pH 為6.7，最適溫度為53℃。來(lái)源于青春雙歧桿菌GH43 酶的最適pH 為6.0，最適溫度為40℃。兩個(gè)酶均不能降解pNPA，可降解阿拉伯聚糖［12］。來(lái)源于青春雙歧桿菌GH51 的最適pH 為6.0，最適溫度為30℃（以pNPA 為底物檢測(cè)），可以水解pNPA，但不能降解pNPX，它在支鏈阿拉伯聚糖上有活性，但在線性阿拉伯聚糖上幾乎沒有活性，在阿拉伯聚糖上僅具有微弱的活性［18］。BoAra43A 和HiAXHd3的氨基酸序列與HiAXHd3 的一致性為63%，與其他阿拉伯呋喃糖苷酶相比是最高的。與阿拉伯木聚糖結(jié)合相關(guān)的殘基在HiAXHd3 中為His272、Asp291和Arg297［14］，在BoAra43A 中也有，相對(duì)應(yīng)的殘基也為His272、Asp291 和Arg297。這些保守氨基酸殘基說(shuō)明BoAra43A 可能存在阿拉伯呋喃糖苷酶的活性。BoAra43A 的最適溫度為50℃，最適pH 為5.0；而HiAXHd3 的最適溫度為53℃，最適pH 為6.7。這兩種酶分子量相近（HiAXHd3 分子量為60.11 kD，BoAra43A 為57.85 kD），同源性也超過(guò)50%，序列相似性可能與酶的底物特異性、最適溫度和最適pH 均有關(guān)［12］。重組酶HiAXHd3 對(duì)人工合成的底物p-nitrophenyl-α-L-arabinofuranoside（pNPA）無(wú)活性［12］；同樣，在BoAra43A 上未能檢測(cè)到針對(duì)pNPA 的活性。

我們還測(cè)試了BoAra43A 和PsAra43A 在協(xié)同降解玉米糠來(lái)源的異質(zhì)性木聚糖時(shí)的協(xié)同作用。PsAra43A 是來(lái)源于芽孢桿菌的一個(gè)GH43 家族的酶，它可能特異識(shí)別、降解α-（1 →2）或α-（1 →3）連接的單取代阿拉伯糖側(cè)鏈［15］，而BoAra43A 降解的是雙取代基團(tuán)上的α-（1 →3）阿拉伯呋喃糖殘基。在等比例BoAra43A 和PsAra43A 條件下，同時(shí)加入兩種酶，或先加PsAra43A 再加BoAra43A 并未產(chǎn)生協(xié)同降解的作用。但當(dāng)先加入BoAra43A 孵育一段時(shí)間以去除雙取代的α-（1 →3）-阿拉伯呋喃糖殘基后，最終反應(yīng)釋放出的阿拉伯糖大大增強(qiáng)，證明兩個(gè)酶之間具有強(qiáng)烈的協(xié)同作用（協(xié)同系數(shù)=1.34）。從酶的底物特異性可推斷得出，這種協(xié)同作用是通過(guò)BoAra43A 從阿拉伯糖雙取代的木聚糖中去除α-（1 →3）連接的阿拉伯糖，從而增加了可被PsAra43A 降解的底物濃度。文獻(xiàn)報(bào)道中PsAra43A 從單取代側(cè)鏈的α-（1 →2）還是α-（1 →3）的切割方式并未明確；從本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)中看來(lái)，PsAra43A 可能是從單取代側(cè)鏈的α-（1 →2）連接而非α-（1 →3）連接進(jìn)行切割，因此預(yù)先使用BoAra43A 處理玉米糠木聚糖，可以解除雙取代側(cè)鏈上α-（1 →3）糖苷鍵對(duì)PsAra43A 的空間位阻效應(yīng)，使得更多的酶能結(jié)合上底物并對(duì)其進(jìn)行有效的降解。

4 結(jié)論

本研究從稻平臍蠕孢中克隆、表達(dá)了一個(gè)新的阿拉伯呋喃糖苷酶BoAra43A，它特異的從木寡糖或阿拉伯寡糖雙取代的阿拉伯糖側(cè)鏈上去除α-（1→3）-連接的阿拉伯糖，并與PsAra43A 在降解玉米糠木聚糖上表現(xiàn)出較強(qiáng)的協(xié)同性質(zhì)。未來(lái)可以尋找和BoAra43A 同時(shí)作用能協(xié)同降解玉米糠木聚糖的阿拉伯呋喃糖苷酶，并對(duì)該酶的熱穩(wěn)定性和催化能力進(jìn)行改造，以更好地拓寬該酶的潛在應(yīng)用價(jià)值。