馬鈴薯StSSR2 的克隆與表達(dá)分析

王宇 鄧孟勝 徐馳 余麗萍 謝良帥 李立芹 王西瑤

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院馬鈴薯研究與開(kāi)發(fā)中心，成都 611130；2. 作物科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)），成都 611130）

馬鈴薯（Solanum tuberosumL.）是茄科茄屬一年生植物，具有適應(yīng)性廣、產(chǎn)量高、營(yíng)養(yǎng)豐富的特點(diǎn)［1］，是我國(guó)重要的糧菜兼用作物，對(duì)促進(jìn)貧困地區(qū)增產(chǎn)增收、保證糧食安全、助力脫貧攻堅(jiān)和鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略具有重要意義。馬鈴薯塊莖具有復(fù)雜的萌芽特性［2］，貯藏不當(dāng)會(huì)引起塊莖發(fā)芽或腐爛，其內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗并伴隨以龍葵素為主的有毒物質(zhì)產(chǎn)生，嚴(yán)重影響馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

龍葵素（Steroidal glycoalkaloids，SGA）是茄科植物生長(zhǎng)過(guò)程中的次生代謝物［3］，馬鈴薯中龍葵素主要分布于呼吸作用旺盛的部位，其含量隨著馬鈴薯生長(zhǎng)發(fā)育呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，并在抵御昆蟲、病原菌等生物脅迫和干旱、冷害等非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要的作用。當(dāng)馬鈴薯受到馬鈴薯塊莖蛾的取食時(shí)，StHMGR1表達(dá)增加，龍葵素大量積累，增加植物抗性［4］，單獨(dú)施加龍葵素能顯著影響對(duì)大蠟螟幼蟲的存活率和發(fā)育繁殖能力［5］，而在沉默StGAME4的轉(zhuǎn)基因株系中龍葵素減少，黃萎病菌水平增加［6］。龍葵素加入晚疫病霉培養(yǎng)液中能顯著抑制晚疫病霉生長(zhǎng)［7］，光照和受傷處理塊莖，均能促進(jìn)StSSR2的表達(dá)，提高內(nèi)源龍葵素的含量［8］。馬鈴薯腐爛、變綠、發(fā)芽時(shí)，龍葵素大量積累［9］，且龍葵素與馬鈴薯的發(fā)芽表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)［10］，在芽和芽周部位呈現(xiàn)異常的高含量，研究證實(shí)，龍葵素對(duì)茄子、番茄和辣椒種子的萌發(fā)和幼苗的生長(zhǎng)均有抑制作用，但對(duì)大白菜和菜豆種子萌發(fā)呈現(xiàn)出低濃度促進(jìn)高濃度抑制［11］，敲除龍葵素合成基因PGA1 和PGA2 以及對(duì)16DOX 蛋白功能缺失后，馬鈴薯塊莖中龍葵素含量降低、芽不萌發(fā)或萌發(fā)生長(zhǎng)受抑［12-13］，甾醇側(cè)鏈還原酶2（Sterol side chain reductase 2，SSR2）催化環(huán)阿屯醇還原成膽甾醇，沉默NbSSR2的煙草植株中膽甾醇含量降低，但未對(duì)煙草生長(zhǎng)產(chǎn)生影響［14］，對(duì)馬鈴薯StSSR2 和番茄SlSSR2 體外酶活試驗(yàn)表明，酵母細(xì)胞中積累了大量膽甾醇［15］，而馬鈴薯中StSSR2作為龍葵素合成途徑上的關(guān)鍵限速酶，是否影響塊莖萌發(fā)，仍不清楚。

本研究以馬鈴薯短休眠期品種費(fèi)烏瑞它（Favorite）為材料，克隆StSSR2編碼序列，運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其蛋白作用區(qū)域，結(jié)合qRT-PCR 法分析StSSR2在馬鈴薯各組織表達(dá)特異性，并檢測(cè)不同生育時(shí)期、不同貯藏時(shí)期中該基因的表達(dá)差異，旨為進(jìn)一步探究StSSR2與馬鈴薯萌芽的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以見(jiàn)光易變綠的馬鈴薯品種費(fèi)烏瑞它（Favorita）塊莖為試驗(yàn)材料，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院馬鈴薯研究與開(kāi)發(fā)中心提供。TRIzol 試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNASynthesis購(gòu)自Thermo 公司，高保 真PrimeSTAR? Max DNA Polymerase 酶、SYBR Green Master mix 購(gòu)自寶生物公司，DNA 凝膠純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、pMD19-T 載體購(gòu)自天根生化科技有限公司，大腸桿菌DH5α 購(gòu)自博邁德基因技術(shù)有限公司，引物合成、測(cè)序由擎科梓熙生物科技有限公司完成，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或者化學(xué)純。

1.2 方法

1.2.1 取樣 不同生育時(shí)期取樣：播種后第2 周開(kāi)始取樣，分別取出苗期、塊莖形成期、成熟期的葉片，取樣周期為1 周；不同組織部位取樣：取成熟期的根、莖、葉、塊莖、匍匐莖；不同貯藏時(shí)期取樣：挑取大小均勻剛收獲的馬鈴薯塊莖，愈傷化后置于常溫（16±2）℃儲(chǔ)藏。收獲當(dāng)天為第1 次取樣，取樣周期為10 d，共取7 次樣；取樣方式為，以頂芽芽眼為中心，用直徑3 mm 硬質(zhì)塑料管打孔，取從表皮起5 mm 的圓柱體，芽長(zhǎng)超過(guò)2 mm 時(shí)，即認(rèn)為該薯塊已解除休眠而萌芽，本實(shí)驗(yàn)中貯藏第56 天塊莖萌芽，所有取樣材料于-80℃保存。

1.2.2 StSSR2 的克隆 從馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（PGSC）中找 到StSSR2 的CDS序列，利用primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物并由成都擎科梓熙生物科技有限公司合成引物（上游引物cSSR2-PF：5'-CACCATGTCGGATGCTAAGGCCC-3'，下游引物cSSR2-PR：5'-TCAATTCGCAGG TTCATCAG-3'），用TRIzol 法［16］提取費(fèi)烏瑞它塊莖芽眼的RNA，采用Thermo 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，以cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為2×PrimeSTAR Max Premix 25 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1.5 μL、cDNA2μL 和ddH2O 20 μL；反應(yīng)程序?yàn)?4℃3min；98℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃2min，35 個(gè)循環(huán)；72℃7min?；厥漳康臈l帶，并與pMD19-T 載體連接后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR 檢測(cè)后測(cè)序。

1.2.3 StSSR2 的生物信息學(xué)分析 將測(cè)得的序列拼接后通過(guò)NCBI 的BLAST 比對(duì)同源序列（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）；利用ProtParam 程序（http：//web.expasy.org/protparam/）在線預(yù)測(cè)氨基酸序列分子量、理論等電點(diǎn)（pI）、不穩(wěn)定系數(shù)等；通過(guò)SOPMA 軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在線預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)，運(yùn)用SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/interactive）進(jìn)行三維建模，使用PROSITE（https：//prosite.expasy.org/）預(yù)測(cè)功能 域；通 過(guò)TMHMM Server v.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)其是否屬于跨膜蛋白，使用在線工具WoLFPSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測(cè)StSSR2蛋白的亞細(xì)胞定位；通過(guò)DNAMAN 軟件分析氨基酸序列同源性，采用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

1.2.4 qRT-PCR 分析 提取費(fèi)烏瑞它不同生育時(shí)期、成熟期不同組織部位和不同貯藏時(shí)期的總RNA，以O(shè)ligo（dT）為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以馬鈴薯EF1αL 為內(nèi)參基因設(shè)計(jì)定量引物（EF1αL-F：5'-CTTGTACACCACGCTAAGGAG-3'；EF1αL-R：5'-GTCAATGCAAACCATTCCTTG-3'）。依據(jù) 全長(zhǎng)cDNA 序列設(shè)計(jì)StSSR2 定量引物（qSSR2-PF：5'-CATGGATTTCAGGCTCAATACG-3'；qSSR2-PR：5'-GAACGTTCCGATAGCTTTGTAC-3'）。熒光定量PCR 反應(yīng)體系為2×Ssofast Eva Green5μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL、cDNA 4.2 μL；反應(yīng)程序?yàn)?5℃3min；95℃5s，56℃ 30 s，39 個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，65-95℃1min 做熔解曲線，各溫度以0.5℃上升，并停5 s。每個(gè)試驗(yàn)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，基因表達(dá)量用2-△△Ct方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2013 整理和作圖，Data Processing System 7.05 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用LSD 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著性水平設(shè)定為α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 StSSR2的克隆

提取馬鈴薯塊莖總RNA 后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，有2條明顯條帶（28S和18S），RNA質(zhì)量較好（圖1-A），分光光度計(jì)測(cè)定D260/D280和D260/D230均在2.0左右。以O(shè)ligo（dT）為引物合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆StSSR2片段，擴(kuò)增出一條約1 700 bp 清晰條帶（圖1-B），對(duì)目的片段進(jìn)行回收，并連接pMD19-T 載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，鑒定陽(yáng)性克隆并測(cè)序，結(jié)果表明，目的片段大小為1 713 bp。

圖1 馬鈴薯總RNA 提取與StSSR2 的克隆

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析StSSR2蛋白分子式為C3026H4625N795O842S23，原子總數(shù)9 311 個(gè)，相對(duì)分子質(zhì)量為66.35 kD，由570 個(gè)氨基酸組成，包含75 個(gè)酸性氨基酸，73 個(gè)堿性氨基酸，理論等電點(diǎn)為6.73，平均親水系數(shù)為-0.389，脂肪指數(shù)為82.23，不穩(wěn)定系數(shù)為43.65，屬于親水性的酸性不穩(wěn)定蛋白。

2.2.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析 對(duì)StSSR2 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析（圖2）發(fā)現(xiàn)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋構(gòu)成，含量分別是40.07%和38.42%，其次是延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角，含量分別是16.67%和4.21%；對(duì)其蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，并構(gòu)建三維蛋白模型（圖3）；利用在線網(wǎng)站Net NES1.1 Sever預(yù)測(cè)StSSR2 蛋白的NES，結(jié)果表明，StSSR2 蛋白具有7 個(gè)NES 保守位點(diǎn)，分別是亮氨酸（155，158，161）、天冬氨酸（159，160）、丙氨酸（156）和谷氨酸（157）。

圖2 StSSR2 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖3 StSSR2 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.2.3 功能域、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 將StSSR2 蛋白序列通過(guò)PROSITE 網(wǎng)站分析其功能域（圖4-A），結(jié)果顯示StSSR2 蛋白在51-234 位氨基酸處具有FAD 結(jié)合結(jié)構(gòu)域保守區(qū)域，該區(qū)域與氧化還原反應(yīng)的發(fā)生有關(guān)；通過(guò)TMHMM Server v.2.0 在線網(wǎng)站對(duì)StSSR2 蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)域分析（圖4-B），該蛋白在24-47 位氨基酸處存在跨膜區(qū)域，推測(cè)StSSR2 蛋白為跨膜蛋白；亞細(xì)胞定位通過(guò)WoLF PSORT 網(wǎng)站預(yù)測(cè)（圖4-C），結(jié)果表明，StSSR2 蛋白主要存在于質(zhì)膜（45.95%）和細(xì)胞質(zhì)（27%），其余存在于葉綠體（5.41%）、細(xì)胞核（5.41%）、液泡（5.41%）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（5.41%）和過(guò)氧化物酶體（5.41%）中，利用SignalP5.0 信號(hào)肽預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示StSSR2蛋白無(wú)信號(hào)肽。

2.2.4 同源比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 在NCBI中使用Blast 工具檢索與StSSR2 蛋白同源的蛋白，用DNAMAN 軟件對(duì)檢索到的同源蛋白進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果（圖5）表明，馬鈴薯StSSR2 蛋白（Solanum tuberosum，BAQ55275.1）與野生番茄（Solanum pennellii，XP_015065843.1）、番茄（Solanum lycopersicum，NP_001306251.1）、中華 辣椒（Capsicum chinense，PHU25746.1）、本氏煙草（Nicotiana benthamiana，BBE00761.1）、藥用酸漿果（Alkekengi officinarum，AXG64151.1）、南非醉茄（Withania somnifera，AXG64150.1）、朝天椒（Capsicum baccatum，PHT55506.1）的SSR 蛋白均具有同源性，相似度分別為97.89%、97.02%、91.07%、90.03%、89.67%、88.79%和85.83%，通過(guò)MEGA 7.0 軟件，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖6），結(jié)果表明，StSSR2 蛋白與番茄、辣椒、煙草等茄科植物親緣關(guān)系較近，與花生、蘋果等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，系統(tǒng)進(jìn)化樹與物種進(jìn)化關(guān)系一致。

圖4 功能域、跨膜區(qū)、亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

2.3 qRT-PCR分析

通過(guò)分析StSSR2在馬鈴薯根、匍匐莖、塊莖、莖、葉中的表達(dá)，以及在不同生育時(shí)期的葉片和不同貯藏時(shí)期的塊莖中的表達(dá)。結(jié)果（圖7）表明，StSSR2在5 種組織中均有表達(dá)，經(jīng)顯著性分析（P＜0.05），StSSR2在塊莖和莖中的表達(dá)顯著高于其他組織，其次是葉片、匍匐莖和根，表明StSSR2主要在塊莖和莖中表達(dá)，各組織表達(dá)存在顯著差異；StSSR2在馬鈴薯生長(zhǎng)各時(shí)期的葉片中均有表達(dá)，0-14d出苗期StSSR2表達(dá)最高，21-28d塊莖形成期StSSR2表達(dá)平穩(wěn)，35-56d塊莖成熟期下降到最低并趨于穩(wěn)定；StSSR2在馬鈴薯塊莖不同貯藏時(shí)期均有表達(dá)，0-10 d貯藏早期StSSR2表達(dá)維持穩(wěn)定，10-20d深度休眠期StSSR2表達(dá)最低且保持穩(wěn)定，30-60d萌芽期StSSR2表達(dá)量急劇上升且與其他時(shí)期表達(dá)量有顯著性差異，表明StSSR2與塊莖萌芽存在一定關(guān)系。

3 討論

植物次生代謝物合成與積累取決于其合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，它們?cè)谥参锎紊x物生物合成途徑中往往位于代謝支路分叉口或途徑的下游［17］。馬鈴薯中龍葵素的生物合成主要通過(guò)萜類、甾醇類與茄啶三大合成路徑［18］，StSSR2 不僅是甾醇類合成途徑中催化環(huán)阿屯醇合成膽甾醇的關(guān)鍵限速酶，還位于龍葵素和油菜素內(nèi)酯（BR）合成的分支點(diǎn)，其同家族StDWF1 催化BR 合成［19］。本研究從馬鈴薯費(fèi)烏瑞它塊莖中克隆StSSR2全長(zhǎng)編碼序列1 713 bp，與前期馬鈴薯全基因組和轉(zhuǎn)錄組研究一致，但與PGSC 中公布的序列相比，氨基酸序列存在一個(gè)位點(diǎn)的差異，而該位點(diǎn)不在功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)，這可能是由于測(cè)序品種和試驗(yàn)品種不同造成的［20］，保守結(jié)構(gòu)域分析表明StSSR2 包含高度保守的FAD 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，是催化氧化還原反應(yīng)的重要功能域，這與StDWF1 研究結(jié)果相同［21］，表明StSSR2 與StDWF1在催化龍葵素和油菜內(nèi)酯合成中的功能高度相似；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明StSSR2 蛋白位于質(zhì)膜上，與番茄、辣椒、煙草中同源蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果相同，但其具體定位仍需深入分析；系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果顯示馬鈴薯StSSR2 蛋白與番茄、辣椒、煙草、藥用酸漿果、南非醉茄等茄科植物中SSR2 蛋白親緣關(guān)系最近，具有相似的保守結(jié)構(gòu)域，表明StSSR2基因功能相對(duì)保守，而與花生、蘋果親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，符合植物各科屬在進(jìn)化中的關(guān)系，多序列比對(duì)結(jié)果也表明馬鈴薯StSSR2 與番茄、辣椒和煙草等同源性分別高達(dá)97.89%、91.07%和90.03%，其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近程度與同科植物較高的同源性也體現(xiàn)了各同源蛋白與StSSR2 蛋白的功能相似性［22］。

圖5 在不同植物中多序列比對(duì)StSSR2 同源蛋白

圖6 SSR2 系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖7 StSSR2 的表達(dá)分析

研究表明，馬鈴薯塊莖中龍葵素的積累與其合成基因的表達(dá)呈現(xiàn)一致［23］。馬鈴薯中龍葵素廣泛存在于各個(gè)部位，在不同組織器官中表現(xiàn)出不同的含量且通常不發(fā)生轉(zhuǎn)移［24-25］，馬鈴薯地下部分以根中含量最低，地上部分以花中含量較高，而塊莖表皮下1.5 mm 的組織是龍葵素含量最高的部位［26-27］；SSR2基因在不同茄科植物中的表達(dá)具有不同的組織特異性，辣椒中CaSSR2在根中表達(dá)量高，在葉片中表達(dá)量低，茄子中SmSSR2在花中表達(dá)量較高，衰老的葉片中表達(dá)偏低［28］。本研究中，StSSR2在馬鈴薯塊莖和莖中的表達(dá)顯著高于其他組織，該基因在不同植物中發(fā)揮作用的部位不同。

馬鈴薯呼吸作用旺盛的部位龍葵素含量較高，高濃度CO2和低濃度O2處理均顯著抑制塊莖龍葵素的積累［29］，隨著馬鈴薯塊莖的生長(zhǎng)和成熟，龍葵素含量呈下降趨勢(shì)［30］；不同生育時(shí)期表達(dá)分析表明，StSSR2在出苗期表達(dá)量高，該時(shí)期馬鈴薯生長(zhǎng)旺盛，龍葵素在幼嫩葉片中大量積累［31］，其高水平有助于增加植株抗性［32］，促進(jìn)發(fā)育，隨著生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行，龍葵素含量降低，StSSR2表達(dá)趨于穩(wěn)定。

馬鈴薯收獲后的儲(chǔ)藏條件對(duì)龍葵素的含量有較大影響，提前收獲未充分成熟的塊莖，其含量往往偏高，隨著儲(chǔ)藏期的延長(zhǎng)，特別是儲(chǔ)藏期間見(jiàn)光薯皮變綠和塊莖發(fā)芽時(shí)，龍葵素明顯積累［33］。不同貯藏時(shí)期表達(dá)分析表明StSSR2在馬鈴薯貯藏過(guò)程中發(fā)生顯著變化，剛收獲時(shí)塊莖處于深度休眠，代謝水平較低［34］，StSSR2表達(dá)量較低，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，StSSR2表達(dá)量逐漸增加，當(dāng)馬鈴薯塊莖休眠解除時(shí)，StSSR2表現(xiàn)出高水平表達(dá)，表明StSSR2通過(guò)催化龍葵素的合成促進(jìn)塊莖的萌發(fā)，關(guān)于龍葵素與塊莖萌芽的內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

從馬鈴薯品種費(fèi)烏瑞它中克隆獲得StSSR2，其全長(zhǎng)1 713 bp，編碼570 個(gè)氨基酸，含有FAD 結(jié)合域，與番茄、辣椒、煙草等茄科植物親緣關(guān)系較近。馬鈴薯StSSR2在塊莖中呈現(xiàn)高表達(dá)，在各生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，幼苗期表達(dá)量高，隨著馬鈴薯貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，萌芽期時(shí)該基因表達(dá)量急劇上升。StSSR2可能參與馬鈴薯生長(zhǎng)與塊莖萌芽過(guò)程。