閃式輔助超聲提取長白落葉松中二氫槲皮素的工藝研究

霍云博，王露瑤，劉怡辰，呂 萍

(吉林農(nóng)業(yè)科技學院食品工程學院，吉林 吉林 132101)

長白落葉松(LarixolgensisHenry、KoreanLarch)別名黃花落葉松、黃花松、朝鮮落葉松長白。從長白落葉松中提取出的二氫槲皮素又叫花旗松素、紫杉葉素、雙氫櫟精。二氫槲皮素是藥用植物中重要的二氫黃酮醇類化合物，屬于維生素PP族[1]。研究表明，二氫槲皮素具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗心血管系統(tǒng)疾病等生物活性，在醫(yī)藥、食品、保健產(chǎn)品、煙草等行業(yè)有著廣泛的應用[1]。

閃式提取法是一種新型的提取方法，它利用植物組織破碎原理，使有效成分能夠從植物體內大量溶解，快速、簡便、無須加熱，可以節(jié)省大量的時間、精力和能源， 能夠在數(shù)秒鐘內完成提取過程。本實驗將閃式提取和超聲提取相結合，極有可能達到節(jié)能、高效、時間短和高提取率的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長白落葉松松針采摘于吉林農(nóng)業(yè)科技學院校園內，置于電熱恒溫干燥箱80℃常壓干燥至恒重，粉碎至80目篩，裝入磨口玻璃瓶備用。

實驗試劑：二氫槲皮素標品(實驗室自制)；硫酸、乙醇、乙酸、甲醇、蒸餾水(自制)、氫氧化鈉、無水乙醇、石油醚、乙醚、氯仿，均為分析純。

1.2 儀器與設備

實驗儀器：恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn))；500 g多功能粉碎機XS-10(上海兆申科技有限公司生產(chǎn))；數(shù)控超聲波清洗器KQ3200DB(昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn))；紫外可見分光光度計UV-2800AH(尤尼柯上海儀器有限公司生產(chǎn))或V-1100D可見分光光度計 (上海美譜達儀器有限公司生產(chǎn))；YRE-2000A旋轉蒸發(fā)器或旋轉蒸發(fā)儀RE-52A(上海亞榮盛華儀器廠生產(chǎn))等。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準曲線繪制

準確稱取標準二氫槲皮素50 mg溶于乙醇中，定容100 mL，制備成0.5 mg/mL的對照液。取對照液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL移入25 mL容量瓶中，加入乙醇，使乙醇的體積達到3 mL/25 mL，加水定容。于300 nm處測定其吸光度[2]，用吸光度Y對二氫槲皮素濃度X(mg/mL)繪制標準曲線。

1.3.2 二氫槲皮素提取及精制

提取工藝： 長白落葉松松針→干燥→粉碎→稱取松針粉末50 g→加入提取劑→閃式提取→收集提取液→超聲波處理→收集上清液→抽濾→減壓干燥→二氫槲皮素粗品→精制→高純度二氫槲皮素。

精制流程：二氫槲皮素粗品→熱水溶解殘渣→冰箱冷凍結晶→快速離心→干燥

將減壓濃縮至干的二氫槲皮素粗品，用熱水溶解殘渣，冰箱冷凍(5℃)結晶后快速離心，分離得到二氫槲皮素[3，4]。

計算：二氫槲皮素得率(mg/g)=aV/m×100%

式中：

a，提取液中二氫槲皮素濃度(mg/mL)；V，提取液的體積(mL)；m，樣品質量(g)。

1.3.3 二氫槲皮素的定性檢驗

三氯化鋁顯色法：取上清液和對照液各2 mL于25 mL容量瓶中，加入1.0 mL 1%的三氯化鋁-乙醇溶液，然后加入乙醇，使乙醇的總體積達到3 mL/25 mL，加水定容至25 mL，在波長200～600 nm范圍進行全波長掃描，兩者在300 nm處均有較強的吸收，其紫外可見光譜如圖1所示。

圖1 二氫槲皮素和樣品與三氯化鋁絡合后的紫外可見光譜圖Fig.1 UV-visible spectrum of complexed dihydroquercetin and sample with aluminum trichloride

1.3.4 提取劑的選擇

將長白落葉松、松樹、松枝粉末準確稱取3份，每份5 g。將3份樣品分別放入三角瓶中，并分別加入20 mL乙醇、乙酸和蒸餾水進行閃式提取后合并提取液，再進行超聲波提取合并提取液的上清液。將提取液進行抽濾干燥，算出提取率，選用提取率最高的溶劑作為提取劑。通過單因素實驗得出，最佳提取劑選擇為乙醇。

1.4 實驗設計

在單因素實驗數(shù)據(jù)基礎上， 利用Box-Behnken對實驗因素和水平進行設計，采用軟件Design Expert 8.0.6進行設計。最終根據(jù)響應曲面法來確定各相關因素之間的交互作用及影響長白落葉松松針中二氫槲皮素提取率的程度，篩選出優(yōu)化工藝的條件[5]。

2 結果與分析

2.1 長白落葉松松針中二氫槲皮素標準曲線的繪制

從計算結果來看, 二氫槲皮素濃度與吸光度線性關系R2為0.999 9，線性關系良好，回歸方程為y=51.786x-0.013，詳見圖2。

圖2 二氫槲皮素標準曲線Fig.2 Standard curve of dihydroquercetin

2.2 響應面法實驗

2.2.1 響應面法實驗結果

在單因素實驗的基礎上，進行4因素3水平響應面分析實驗，如表1所示， 數(shù)據(jù)方差分析結果如表2所示。

表1 響應面法實驗設計Tab.1 Experimental design of response surface method

2.2.2 響應面數(shù)學模型建立及其顯著性檢驗

經(jīng)過Design expert 8.0.6軟件的計算和表2的結果可知，回歸模型結果極其顯著 (P<0.01)，建立的模型具有統(tǒng)計學意義，回歸方程為：

表2 回歸方程的方差分析Tab.2 ANOVA of regression equations

注：**代表極顯著(P<0.01)、*代表顯著(P<0.05)。

2.2.3 優(yōu)化條件的模型驗證

利用Design expert 8.0.6軟件設計分析得出長白落葉松中二氫槲皮素最佳超聲提取工藝條件，得到回歸方程。考慮到實際操作的便利性以及更可靠的驗證模型預測準確性，將條件設定為：閃式提取時間120 s、超聲波功率190 w、液料比1∶10、超聲提取時間32 min，并再次進行了相關驗證，得到的實際平均二氫槲皮素提取率與之前計算的預測值間的相對偏差也是較為微小的，可以證明模型預測值與實際結果基本符合。

3 結論與討論

傳統(tǒng)的方法(回流法、浸漬法、微波萃取法等)操作簡單，但提取時間較長，有時長達數(shù)周或者提取率較低。本研究方法采用閃式輔助超聲提取法提取長白落葉松中二氫槲皮素，可加快提取速度，縮短提取時間，提高提取率。本研究利用響應面法優(yōu)化長白落葉松中二氫槲皮素閃式輔助超聲提取工藝參數(shù)，以長白落葉松中二氫槲皮素提取率為響應值，作為連續(xù)變量，應用軟件Design Expert 8.0.6進行實驗設計， 綜合考慮提取溫度、料液比、提取時間及其相互作用對二氫槲皮素提取率的影響，利用軟件對數(shù)據(jù)擬合得二氫槲皮素提取回歸方程，并對提取溫度、料液比、提取時間進行方差分析，并利用該軟件優(yōu)化提取工藝參數(shù)，確定最佳提取劑為乙醇。結果表明，對二氫槲皮素提取率的影響因素大小順序為液料比>超聲提取時間>閃式提取時間>超聲波功率，最佳提取工藝參數(shù)為閃式提取時間120 s、超聲波功率190 w、液料比1∶10、超聲提取時間32 min。在此條件下，二氫槲皮素提取率最高為0.48%。