廣東省主要紅樹(shù)林植物DNA條形碼評(píng)價(jià)1)

武鋒 裴男才 廖寶文 管偉 姜仲茂 李玫

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，廣州，510520)

2003年Hebert et al.[1]第一次提出識(shí)別物種的新方法——DNA條形碼技術(shù)。兩年后，該技術(shù)的相關(guān)理論被引入植物學(xué)開(kāi)展科學(xué)研究[2-3]。隨后國(guó)際生命條形碼聯(lián)盟植物工作組(Consortium for the Barcode of Life Plant Working Group)初步確定并推薦葉綠體基因片段的rbcL和matK[4]作為的DNA核心條形碼片段。然而該片段并不能像動(dòng)物的COI片段一樣具有普遍適用性。因此葉綠體基因非編碼區(qū)trnH-psbA[5-6]及核基因ITS[7-9]作為核心條形碼的補(bǔ)充片段被提了出來(lái)。選擇、比較、推薦合適的DNA條形碼片段的工作也一直在繼續(xù)[10-13]。DNA條形碼技術(shù)不僅能應(yīng)用于相似生物的識(shí)別[14-17]。還可以利用DNA條形碼片段測(cè)序所獲得的分子序列，構(gòu)建特定生物類(lèi)群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[18-20]。這將促進(jìn)群落生態(tài)學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育生物學(xué)、生態(tài)學(xué)與條形碼技術(shù)的交叉融合，帶來(lái)進(jìn)化生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的整合與發(fā)展[21-25]。

紅樹(shù)林是生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶海陸過(guò)渡地區(qū)的木本植物群落[26]，具有重要的生態(tài)服務(wù)價(jià)值，在世界16種主要生態(tài)系統(tǒng)中排名第四[27]。全世界共有紅樹(shù)植物84種[28]。廣東共有紅樹(shù)林植物25種[29]，占世界紅樹(shù)林物種數(shù)的29.76%。相對(duì)以往對(duì)紅樹(shù)林的研究主要集中在宏觀方面，如紅樹(shù)林生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能評(píng)價(jià)、碳匯、防風(fēng)消浪等，近年來(lái)對(duì)紅樹(shù)林DNA條形碼[30]、基因組[31-32]等微觀分子方面的研究也越來(lái)越多。然而對(duì)紅樹(shù)林的準(zhǔn)確識(shí)別是開(kāi)展各項(xiàng)研究的基礎(chǔ)。利用紅樹(shù)林植物的外部形態(tài)來(lái)不能快速、準(zhǔn)確的區(qū)分相同屬相似物種，比如海桑屬(Sonneratia)的杯萼海桑(SonneratiaalbaSm.)、海桑(Sonneratiacaseolaris(L.) Engl.)、海南海桑(SonneratiaxhainanensisW. C. Ko et al.)、擬海桑(SonneratiaparacaseolarisW. C. Ko et al.)等；木欖屬(Bruguiera)的海蓮(Bruguiera.sexangula(Lour.) Poir)、尖瓣海蓮(Bruguiera.sexangulavar.rhynchopetalaKo.)等。傳統(tǒng)的植物群落發(fā)育關(guān)系構(gòu)建中，如APG分類(lèi)系統(tǒng)(Angiosperm Phylogeny Group)，多是以大類(lèi)群植物間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，對(duì)大多數(shù)植物只能解決到目或科的水平，不宜于科及以下分類(lèi)水平的研究，進(jìn)化樹(shù)分辨率低[28]。同時(shí)運(yùn)用該方法得出的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)容易出現(xiàn)多分枝結(jié)構(gòu)。DNA條形碼以動(dòng)物[33]、熱帶、亞熱帶植物[21，34]、微生物[35]為對(duì)象的研究在物種識(shí)別和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系構(gòu)建方面都取得了一定的成果。Saddhe et al.[30]利用核心條形碼片段和ITS2片段對(duì)印度西海岸5科14種紅樹(shù)林的識(shí)別也取得了成功，但是該研究對(duì)象與分布在中國(guó)的紅樹(shù)林植物多有不同，同時(shí)該研究的對(duì)象僅包含真紅樹(shù)，植物種類(lèi)少。紅樹(shù)植物群落物種豐富度較低，類(lèi)群間關(guān)系比較簡(jiǎn)單。是否利用DNA條形碼序列也能成功構(gòu)建紅樹(shù)植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系答案尚不明確。本文嘗試研究DNA條形碼在中國(guó)紅樹(shù)林(包含真紅樹(shù)和半紅樹(shù))植物類(lèi)群中的通用性，并構(gòu)建紅樹(shù)林植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為紅樹(shù)林生物多樣性保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

本研究選取紅樹(shù)林在廣東的主要分布地，統(tǒng)籌考慮選取珠三角地區(qū)的深圳、惠州，粵東的汕頭和粵西的湛江等4地市的紅樹(shù)林分布區(qū)(珠海淇澳島作為補(bǔ)充采樣點(diǎn))，具體的采樣地信息詳見(jiàn)表1。根據(jù)Li等[9]和高連明等[36]DNA條形碼樣品采集規(guī)范，每個(gè)紅樹(shù)林物種采樣2～3個(gè)個(gè)體，主要以采取新鮮葉子、新芽為主，便于提取DNA分子材料，每個(gè)個(gè)體相距20 m以上。采集完試驗(yàn)材料立刻用硅膠干燥。共采集紅樹(shù)林植物144個(gè)個(gè)體。經(jīng)廖寶文研究員、李玫副研究員鑒定，確定類(lèi)屬于16科22屬23種(其中2種屬于紅樹(shù)林伴生種)，全部正確分類(lèi)到種。本研究采樣的物種數(shù)占廣東紅樹(shù)林植物真紅樹(shù)和半紅樹(shù)種類(lèi)25種的84%，因其中人工引種的海蓮和尖瓣海蓮幾乎滅絕、消失，故未采樣；小花老鼠簕(AcanthusebracteatusVahl)、鈍葉臭黃荊(PremnaobtusifoliaR. Br.)未找到。

1.1 DNA提取、擴(kuò)增和測(cè)序

采用調(diào)整過(guò)的CTAB法[37]提取紅樹(shù)植物DNA。根據(jù)國(guó)際生命條形碼聯(lián)盟推薦以及前人[6，38-39]在區(qū)域性植物DNA條形碼的研究，選取葉綠體基因片段rbcL、matK以及trnH-psbA總計(jì)3個(gè)分子序列作為研究的擴(kuò)增片段。引物信息和擴(kuò)增程序參考表2。所有擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后送廣州美吉生物公司完成測(cè)序，3種片段均采取雙向測(cè)序，獲得的序列在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/上進(jìn)行BLAST搜索，如發(fā)現(xiàn)序列與采樣物種存在科、屬不一致的情況，咨詢(xún)專(zhuān)家再次確認(rèn)或重新取樣擴(kuò)增，直到所有序列的BLAST結(jié)果與采集樣品為同屬或者同科植物。使用DNAstar中的SeqMan(5.0.0)對(duì)測(cè)序獲得的序列進(jìn)行拼接和校對(duì)。然后在Geneious11.1.3中選擇MAFFT Aligement插件，按默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行序列比對(duì)。

注：A代表湛江；B代表深圳；C代表惠州；D代表汕頭；E代表珠海。

1.2 數(shù)據(jù)分析

參考Kress et al.[40]計(jì)算PCR擴(kuò)增成功率和測(cè)序成功率方法。PCR擴(kuò)增成功率是指某片段擴(kuò)增的成功個(gè)體數(shù)占該片段所有個(gè)體的百分?jǐn)?shù)。測(cè)序成功率是指獲得的高質(zhì)量序列數(shù)占所有個(gè)體的百分?jǐn)?shù)。研究中采用了序列相似法(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)法中的鄰接樹(shù)(Neighbor-Joining tree,NJ tree)法來(lái)評(píng)估紅樹(shù)林植物種的鑒定能力。(1)BLAST方法，首先在Geneious 11.1.3中將3種DNA片段分別建立一個(gè)本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)[40]，將所有序列比對(duì)后另存為*fasta文件，調(diào)整序列方向，清除序列間gap。再用blast+2.7.1+把每條序列與數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的所有序列進(jìn)行BLAST，以相同位點(diǎn)(Identical Sites)的百分比作為量化標(biāo)準(zhǔn)。若同物種的Identical Sites最小值都大于與其他所有物種個(gè)體間的Identical Sites值，那么我們認(rèn)為這個(gè)物種的序列得到了準(zhǔn)確鑒定，若該物種只包含一個(gè)樣品，為避免過(guò)高估計(jì)鑒定成功率，標(biāo)記為鑒定失敗[41]。鑒定成功率是通過(guò)成功鑒定物種數(shù)的百分比再乘以該片段的測(cè)序成功率得到的。聯(lián)合片段的鑒定成功率與單個(gè)片段計(jì)算方法相同。(2)NJ tree方法，用rbcL、matK、trnH-psbA3個(gè)單片段或者片段組合，在MEGA6中利用基于Kimra’2-parameter model的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并完成1000次運(yùn)算獲得節(jié)點(diǎn)支持率。當(dāng)同一物種的所有個(gè)體聚為一枝，并且節(jié)點(diǎn)支持率≥70%，則認(rèn)為鑒定成功[39，42]。所有單個(gè)個(gè)體的物種被用來(lái)構(gòu)建NJ樹(shù)，但是在分辨率計(jì)算時(shí)不被計(jì)算在內(nèi)[43]。

從NCBI網(wǎng)站下載小花老鼠簕、鈍葉臭黃荊、海蓮的rbcL、matK和trnH-psbA片段信息各1條(無(wú)尖瓣海蓮相關(guān)條形碼片段信息)，與采集到的紅樹(shù)林植物的序列信息拼接，組成一個(gè)包含26種物種，49個(gè)個(gè)體的序列文件。用于構(gòu)建紅樹(shù)林植物系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列通用性

對(duì)23種紅樹(shù)林植物的144個(gè)個(gè)體進(jìn)行序列統(tǒng)計(jì)，共獲得3種DNA條形碼片段可用序列386條(表3)，序列獲得率89.35%。其中，在湛江紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)共收集紅樹(shù)植物16種，35個(gè)個(gè)體，測(cè)序后共得到89條序列。PCR擴(kuò)增后發(fā)現(xiàn)rbcL和trnH-psbA片段的擴(kuò)增成功率同為最高100%，其次是matK71.43%。測(cè)序成功率最高為rbcL片段100%，trnH-psbA片段次之88.57%，最低為matK片段65.71%。

在深圳紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)共收集紅樹(shù)植物12種，36個(gè)個(gè)體，測(cè)序手得到99條序列。PCR擴(kuò)增后3片段的擴(kuò)增成功率由高到低依次為rbcL和trnH-psbA100%、matK(80.56%)。測(cè)序成功率最高為rbcL片段(100%)，trnH-psbA片段次之(97.22%)，最低為matK片段(77.78%)。

在惠州紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)共收集紅樹(shù)植物14種，40個(gè)個(gè)體，測(cè)序后得到108條序列。3個(gè)片段擴(kuò)增成功率由高到低依次為rbcL片段100%、trnH-psbA97.5%，matK77.5%。測(cè)序成功率最高為rbcL片段100%，trnH-psbA次之92.5%，最低為matK77.5%。

在汕頭紅樹(shù)林保護(hù)區(qū)采集到紅樹(shù)植物9種，24個(gè)個(gè)體，測(cè)序后共得到67條序列。PCR擴(kuò)增后3片段的擴(kuò)增成功率由高到低依次為rbcL、trnH-psbA(100%)、matK(91.67%)。測(cè)序成功率最高為rbcL和trnH-psbA片段100%，matK片段為79.17%。

表3 廣東省紅樹(shù)林植物DNA片段擴(kuò)增和測(cè)序成功率 %

注：珠海作為補(bǔ)充采樣點(diǎn)，共采集植物3種9個(gè)樣品，獲得序列23條，用于后續(xù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，此處未做統(tǒng)計(jì)。PCR(Polymerase Chain Reaction)：多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；SEQ(Sequence)：測(cè)序。R為rbcL；M為matK；T為trnH-psbA。

2.2 物種鑒定成功率

2.2.1 序列相似性分析

因分布在廣東的紅樹(shù)、半紅樹(shù)植物除海桑屬和老鼠簕屬外均是單屬、單種存在，故這里僅統(tǒng)計(jì)紅樹(shù)植物的種的鑒定成功率。BLAST結(jié)果顯示，單個(gè)片段中對(duì)物種的鑒別成功率最高為trnH-psbA84.48%±12.09%，其次依次為rbcL片段82.16%±9.68%，最低為matK片段65.09±6.00%，trnH-psbA片段和rbcL片段的物種識(shí)別率顯著高于matK片段(表4)。然而除汕頭地區(qū)，rbcL片段成功鑒定的物種均高于trnH-psbA片段，主要差別為汕頭地區(qū)紅樹(shù)林中trnH-psbA能準(zhǔn)確區(qū)分開(kāi)無(wú)瓣海桑和海桑，而rbcL不行。

對(duì)多片段的不同組合統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)核心條形碼rbcL+matK的鑒定成功率最高，為84.58%±10.83%；rbcL+trnH-psbA鑒定成功率次之，為83.71%±15.96%。補(bǔ)充條形碼trnH-psbA聯(lián)合rbcL+matK片段后物種鑒定率反而降低到76.89%±8.07%。

表4 利用序列相似法的單片段和多片段DNA條形碼在紅樹(shù)林種上的鑒別成功率 %

注：R為rbcL；M為matK；T為trnH-psbA。

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

運(yùn)用系統(tǒng)發(fā)育方法分析統(tǒng)計(jì)物種識(shí)別率結(jié)果如表5。結(jié)果顯示rbcL物種識(shí)別率最高，為66.65%±17.35%；其次是trnH-psbA，為61.21%±9.34%，matK最低為47.75%±13.23%。片段聯(lián)合時(shí)rbcL+trnH-psbA的物種識(shí)別率為62.23%±9.47%；rbcL+matK62.54%±17.41%，再增加trnH-psbA片段可以提高到65.15%±11.09%。

表5 利用系統(tǒng)發(fā)育法的單片段和多片段DNA條形碼在紅樹(shù)林種上的鑒別成功率 %

注：R為rbcL；M為matK；T為trnH-psbA。

利用rbcL、matK和trnH-psbA單個(gè)或3個(gè)片段的聯(lián)合片段，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用rbcL單一片段即可構(gòu)建平均節(jié)點(diǎn)支持率最高的紅樹(shù)林植物系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。除老鼠簕外，同一物種首先聚為一支，同屬物種再聚為一支(綠色標(biāo)記)，然后同科的物種關(guān)系最近(黃色標(biāo)記)。

3 結(jié)論與討論

本文嘗試?yán)肈NA條形碼技術(shù)對(duì)廣東省紅樹(shù)林植物進(jìn)行研究，目的在于評(píng)估DNA條形碼在紅樹(shù)林植物種的引物通用性、鑒別成功率、系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建等方面的表現(xiàn)。

3.1 DNA條形碼在紅樹(shù)林群落中的通用性

在本研究中，核心條形碼中的rbcL片段在紅樹(shù)植物DNA樣品中的PCR擴(kuò)增和測(cè)序成功率都達(dá)到了100%，獲得序列條帶信息、質(zhì)量良好。與Kress et al.[21]研究相比、表現(xiàn)出更高的通用性和成功率。與裴男才[44]研究同處于熱帶、亞熱帶的森林植物群落的測(cè)序成功率相比(90%-100%)持平。這也與Saddhe et al.[45]研究印度西海岸紅樹(shù)植物的擴(kuò)增和測(cè)序成功率(97.7%)不相上下。說(shuō)明通用片段rbcL可變位點(diǎn)最少，所選引物序列通用性強(qiáng)。推薦其成為紅樹(shù)林DNA條形碼片段。而另一核心片段matK的PCR擴(kuò)增成功率和測(cè)序成功率均是3個(gè)片段中的最低水平，其中利用該片段對(duì)角果木、秋茄擴(kuò)增或測(cè)序不成功，在木欖、鹵蕨、紅海欖等物種只有少量個(gè)體測(cè)序成功，說(shuō)明該片段引用的通用性不強(qiáng)，可能是由于存在單核苷酸重復(fù)序列的原因。如Costion et al.[46]研究中matK片段的擴(kuò)增率也只有68.18%；Parmentier et al.[47]的研究中，matK片段的擴(kuò)增成功率僅為64%。劉娟[39]、盧孟孟等[42]、魏亞男等[41]的研究中也存在類(lèi)似情況，普遍修正做法是增加引物數(shù)量進(jìn)行多次嘗試。而Saddhe et al.[45]的研究中，matK片段的擴(kuò)增成功率達(dá)到95.5%，這主要是因?yàn)槠洳捎玫囊锊煌Ｍ瑫r(shí)印度西海岸的紅樹(shù)植物與中國(guó)廣東分布的紅樹(shù)植物種類(lèi)不同也是造成擴(kuò)增成功率差異較大的原因。在以后的研究中可嘗試?yán)闷溲芯恐胁捎玫膍atK引物。補(bǔ)充條形碼trnH-psbA的引物通用性好，僅用一對(duì)引物即可使樣品的擴(kuò)增率和測(cè)序成功率保持在88%以上，僅次于rbcL片段，同時(shí)該片段能成功區(qū)分海桑屬植物。綜上所述，推薦rbcL、trnH-psbA作為紅樹(shù)林DNA條形碼的研究片段。

圖1 運(yùn)用rbcL片段構(gòu)建的廣東省紅樹(shù)林植物群落系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3.2 物種鑒定能力

本文采用兩種不同的方法來(lái)評(píng)價(jià)DNA條形碼對(duì)紅樹(shù)林植物的識(shí)別能力。獲得的結(jié)果也有不同。比如利用BLAST方法物種識(shí)別率最高的單片段是trnH-psbA；利用NJ方法物種識(shí)別率最高的片段是rbcL。且同一片段或者片段組合的物種識(shí)別率均是BLAST法大于NJ樹(shù)法，且差距較大。這與盧孟孟等[42]的研究結(jié)論一致。主要因?yàn)榍罢邇H比較位點(diǎn)之間的差異，后者還要兼顧所有個(gè)體是否形成單系，同時(shí)隱存種的存在也會(huì)降低NJ樹(shù)獲得的物種識(shí)別率。此外相對(duì)于前人要求節(jié)點(diǎn)支持率大于50%[41，47]或60%[48]，本文要求節(jié)點(diǎn)支持率大于70%，也是NJ法物種識(shí)別率降低的一個(gè)原因。同時(shí)多片段的組合分析還會(huì)降低物種識(shí)別率，如利用BLAST法rbcL+matK片段物種識(shí)別率為84.58%±10.83%，rbcL+matK+trnH-psbA后為76.89%±8.07%；NJ樹(shù)法中，單片段rbcL物種識(shí)別率為66.65%±17.35%，rbcL+trnH-psbA后為62.23%±9.47%。主要是因?yàn)閠rnH-psbA片段變異較大，存在多個(gè)插入或者缺失的堿基，造成同物種個(gè)體間Identical Site值變小，導(dǎo)致物種識(shí)別率下降。

利用BLAST法分析發(fā)現(xiàn)matK片段物種的識(shí)別率為65.09%±6.00%，這與前人進(jìn)行植物DNA條形碼的研究結(jié)果大體一致[38，48]。盡管trnH-psbA在不同植物類(lèi)群間堿基數(shù)目差異很大，存在大量的插入和缺失造成在紅海欖、木欖、闊苞菊等物種中測(cè)序困難。但在本研究中trnH-psbA的測(cè)序成功率與rbcL無(wú)顯著差異，都明顯高于matK片段。同時(shí)該片段能獨(dú)立使用時(shí)成功鑒別海桑屬的海桑和無(wú)瓣海桑。Gonzalez et al.[49]等和Tripathi et al.[50]研究也表明trnH-psbA是最具希望和潛力的條形碼之一。

NJ法分析顯示同一物種聚為一枝，4個(gè)地區(qū)存在大量相似的物種，但不同地區(qū)間相似物種的DNA條形碼片段物種識(shí)別率率無(wú)顯著差異。相似物種的存在可能反映了紅樹(shù)林物種起源和系統(tǒng)發(fā)育框架的相似性。同時(shí)由于紅樹(shù)林地理位置的不同，所處的環(huán)境條件也不同。這些差異可能導(dǎo)致4個(gè)地區(qū)的紅樹(shù)林物種向不同方演變。由南到北，真紅樹(shù)植物種類(lèi)逐步減少。

Burgess et al.[40]在加拿大溫帶植物群的研究中，發(fā)現(xiàn)核心條碼組合可以成功鑒定93%的物種，以及De Vere et al.[43]發(fā)現(xiàn)rbcL+matK可以鑒別威爾士境內(nèi)69．4%～74．1%的有花植物。Kress et al.[21]對(duì)Panama區(qū)域內(nèi)296個(gè)木本物種進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)葉綠體片段rbcL+matK的物種識(shí)別率高達(dá)98%。本研究中核心條碼rbcL+matK組合片段物種平均識(shí)別率也可以達(dá)到84.58%±10.83%，與rbcL+trnH-psbA片段組合的物種平均識(shí)別率無(wú)顯著差異。然而無(wú)論采用哪種分析方法，片段組合rbcL+matK的物種平均識(shí)別率與單片段rbcL的相比無(wú)顯著提高。說(shuō)明rbcL是片段組合rbcL+matK中物種識(shí)別的主要片段。綜上所述，本文推薦rbcL、trnH-psbA作為紅樹(shù)林植物DNA條形碼片段。

3.3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

熱帶的巴羅科羅拉多島(Barro Colorado Island，BCI)[21]、海南熱帶云杉林[51]，亞熱帶的鼎湖山樣地[44]，哀勞山森林[42]等地利用rbcL+matK+trnH-psbA片段組合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)均獲得成功。然而在對(duì)處于相同緯度帶紅樹(shù)林植物群落構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)時(shí)卻未能成功。rbcL+matK片段組合也存在類(lèi)似情況。

只用單一片段rbcL可成功構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，且發(fā)育樹(shù)的節(jié)點(diǎn)平均支持率也最高，該片段在Saddhe et al.[45]研究的印度西海岸的真紅樹(shù)群落中也獲得成功。即使加上從網(wǎng)站下載的紅樹(shù)林植物DNA條形碼片段信息后，該片段對(duì)應(yīng)的物種也能成功歸類(lèi)，這也印證了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)法下rbcL片段的物種識(shí)別率最高。此外，我們發(fā)現(xiàn)各分枝上節(jié)點(diǎn)的平均支持率均大于50%，說(shuō)明紅樹(shù)林樹(shù)種的進(jìn)化關(guān)系具有較高的可靠性。同時(shí)利用DNA條形碼獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)框架末端都獲得了很好的二岐分枝結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)末端分枝為分類(lèi)單元提供了準(zhǔn)確的系統(tǒng)位置，可根據(jù)DNA條形碼片段來(lái)計(jì)算整個(gè)群落內(nèi)所有類(lèi)群內(nèi)部真實(shí)的分枝長(zhǎng)度。相比于傳統(tǒng)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)建樹(shù)方法，利用DNA條形碼獲得的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)在進(jìn)化樹(shù)的分辨率和進(jìn)化時(shí)間的準(zhǔn)確性方面都更具優(yōu)勢(shì)。Sahu et al.[52]用rbcL、matK和ITS片段基于最大似然法(Maximun likelihood，ML)成功構(gòu)建印度東、西部海岸37種紅樹(shù)林植物和63種非紅樹(shù)植物組成的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。相比于最大似然法，鄰接樹(shù)法運(yùn)算更快，可以滿足構(gòu)建小群落的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。故推薦用rbcL片段基于鄰接樹(shù)法構(gòu)建廣東紅樹(shù)林植物系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

總的來(lái)說(shuō)，rbcL和trnH-psbA片段擴(kuò)增成功率、測(cè)序成功率高，說(shuō)明這兩種條碼在紅樹(shù)樹(shù)種中是通用的。在物種識(shí)別方面，3種片段中rbcL和trnH-psbA的物種識(shí)別率相對(duì)較高，片段組合未能明顯提高紅樹(shù)植物物種識(shí)別率。同時(shí)僅用一對(duì)引物的rbcL片段即可準(zhǔn)確構(gòu)建出廣東省紅樹(shù)林植物群落系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。trnH-psbA片段作為葉綠體基因非編碼區(qū)序列，進(jìn)化速率快，且能準(zhǔn)確區(qū)分某些rbcL不能識(shí)別的物種，可以作為補(bǔ)充片段。綜合比較，rbcL、trnH-psbA是值得推薦為紅樹(shù)林植物DNA條形碼片段。

本研究得到23種紅樹(shù)林植物3種DNA條形碼片段386條有效序列，紅樹(shù)林植物種類(lèi)占中國(guó)真紅樹(shù)和半紅樹(shù)的55.26%。后續(xù)可繼續(xù)擴(kuò)大采樣范圍，補(bǔ)充其他紅樹(shù)林樹(shù)種及紅樹(shù)林伴生植物的DNA條形碼，構(gòu)建一個(gè)完整、高覆蓋度的紅樹(shù)林植物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)。