56Fe17+重離子誘變選育高產(chǎn)輔酶Q10類球紅細菌

高維東，馬項英，彌 超，秦 云，劉 恭，謝小冬*

（1.蘭州天禾生物催化技術(shù)有限公司，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省特膳食品工程研究中心，甘肅 蘭州 730000；3.蘭州大學基礎醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730000）

輔酶Q10（coenzyme Q10）又名泛醌（ubiquinone），其在動物、植物及微生物體細胞內(nèi)廣泛存在，大量存在于細胞的膜結(jié)構(gòu)中，基本以具有抗氧化活性的還原態(tài)存在[1-3]。輔酶Q10由于在體內(nèi)直接參與代謝，無毒副作用，作為一種良好的生化藥物在臨床上被廣泛應用于心血管疾病方面的治療[4-9]；除此之外，輔酶Q10作為一種天然抗氧化劑、細胞代謝的激活劑，具有促進皮膚新陳代謝、減緩皺紋形成從而延緩衰老的功能，在化妝品和保健品領域越來越多的被應用到[10-13]。

輔酶Q10現(xiàn)有的生產(chǎn)方法主要包括提取分離法、化學合成法和微生物發(fā)酵法，其中微生物發(fā)酵法相較于提取分離法和化學合成法，生產(chǎn)的產(chǎn)品為全反式輔酶Q10，反式輔酶Q10具有還原性，有非常強的藥理活性，人體生物利用度高，且微生物發(fā)酵法原料廉價豐富，產(chǎn)物分離過程相對簡單，產(chǎn)品純度高[14-18]，受到廣泛的關(guān)注。但微生物本身生產(chǎn)輔酶Q10產(chǎn)量較低，多使用誘變方法提高輔酶Q10產(chǎn)量，然而56Fe17+重離子束照射類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides）誘變選育高產(chǎn)輔酶Q10突菌株技術(shù)仍屬空白[19]。

本研究采用56Fe17+重離子束照射對輔酶Q10生產(chǎn)野生型類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides）進行誘變，通過羅紅霉素、卡那霉素、疊氮鈉、對羥基苯甲酸和維生素K3五種篩選因子篩選高產(chǎn)輔酶Q10突變菌株，以期為商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)輔酶Q10尋求優(yōu)良菌株，并為相關(guān)研究提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroate）：中國工業(yè)微生物菌種保藏中心（China center of industrial culture collection，CICC），CICC編號為10287。

1.1.2 化學試劑

輔酶Q10標準品：美國Sigma公司；濃硫酸、葡萄糖、玉米漿粉、乙醇、酵母提取物、谷氨酸鈉、磷酸二氫鉀、羅紅霉素、疊氮鈉、卡那霉素、對羥基苯甲酸、氯化鈉、碳酸鈣、鹽酸硫銨、硫酸鎂、生物素、瓊脂粉、煙酸：均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（NH1培養(yǎng)基）[20]：葡萄糖3 g/L，氯化鈉2 g/L，酵母提取物8 g/L，磷酸二氫鉀1.3 g/L，硫酸鎂0.125 g/L，鹽酸硫胺1 mg/L，生物素15 μg/L，煙酸1 mg/L，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2，固體培養(yǎng)基添加2.0%瓊脂粉，115 ℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[20]：玉米漿干粉3 g/L，谷氨酸鈉3 g/L，氯化鈉2.8 g/L，硫酸銨3 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，葡萄糖30 g/L，硫酸鎂6.3 g/L，碳酸鈣2 g/L，鹽酸硫胺1 mg/L，生物素15 μg/L，煙酸1 mg/L，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

56Fe17+重離子束：中國科學院近代物理研究所蘭州重離子加速器國家重點實驗室；LAN-40-H/L純水儀：重慶力德高端水處理設備有限公司；AL104電子天平、FE20型pH計：梅特-托利多儀器有限公司；SHIMADZLJ型UV2450紫外可見分光光度計：日本島津企業(yè)管理（中國）有限公司；BSD-YX3600雙層恒溫搖床、LRH-150F生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；RE-5220高速冷凍離心機：上海試驗儀器廠；DHG9070A（101-1）實驗室烘箱：南京同皓干燥設備有限公司；YX-350B雙層立式蒸汽壓力滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 類球紅細菌的培養(yǎng)

菌株的活化：將保存的類球紅細菌接種于種子固體培養(yǎng)基，在30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)72 h。

種子液的制備：挑取單菌落接種于裝液量為30 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基，在30 ℃、230 r/min條件下振蕩培養(yǎng)30 h。

1.3.2 生長曲線的測定

取5 mL培養(yǎng)至對數(shù)期的種子液，接種到裝液量為30 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，在30 ℃、230 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)72 h。每間隔4 h取1 mL菌液，6 000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，加入1 mL蒸餾水混勻。采用紫外分光光度計于波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm值），繪制其生長曲線。

1.3.3 發(fā)酵曲線的測定

取5 mL處于對數(shù)生長期的種子培養(yǎng)液于裝液量為50 mL/250mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，平行設置3組，30℃、230r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)，每間隔4 h分別吸取10 mL發(fā)酵液，6 000 r/min離心10 min，棄上清液，測定輔酶Q10含量。

1.3.456Fe17+重離子束照射誘變

取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的發(fā)酵液10 mL，5 000 r/min離心，棄上清，用無菌生理鹽水洗滌兩次，重新懸浮于10 mL生理鹽水中，即得菌懸液。將2 mL菌懸液裝入3 mL無菌離心管中，在56Fe17+重離子束照射劑量分別為2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、16 Gy的條件下進行誘變處理，每個劑量重復試驗兩次，以未誘變處理的菌懸液為空白對照。56Fe17+重離子照射誘變結(jié)束后，將菌懸液梯度稀釋，取稀釋度為10-5、10-6、10-7的菌懸液各0.2 mL涂布于種子固體培養(yǎng)基，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d，進行菌落計數(shù)[21]，并計算致死率，其計算公式如下：

1.3.5 篩選因子對類球紅細菌的最小抑制濃度測定

取0.2 mL處于對數(shù)生長期的種子培養(yǎng)液接種于含有篩選因子的種子固體培養(yǎng)基，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d，進行菌落計數(shù)。篩選因子及其質(zhì)量濃度分別為疊氮鈉：6 mg/L、7 mg/L、8 mg/L、9 mg/L、10 mg/L；維生素K3：5 mg/L、6 mg/L、7 mg/L、8 mg/L、9 mg/L，對羥基苯甲酸：300 mg/L、350 mg/L、400 mg/L、450 mg/L、500 mg/L，羅紅霉素：10 mg/L、20 mg/L、30mg/L、40mg/L、50mg/L，卡那霉素：8mg/L、10mg/L、12mg/L、14 mg/L、16 mg/L，重復試驗3次。

1.3.6 高產(chǎn)輔酶Q10突變菌株的篩選

空白平板篩選：取最佳56Fe17+重離子束照射劑量誘變后的菌懸液0.2 mL涂布于NH1種子培養(yǎng)基，30 ℃恒溫倒置培養(yǎng)7 d，根據(jù)長出的菌落顏色、形狀、大小等性狀的不同，挑取菌落接種于NH1種子液體培養(yǎng)基，30 ℃條件下恒溫振蕩培養(yǎng)4 d。取種子液5 mL接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量50 mL/100 mL，30 ℃、230 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，測定輔酶Q10的產(chǎn)量。

抗性篩選：取最佳56Fe17+重離子束照射劑量誘變后的菌懸液0.2 mL分別涂布于含有篩選因子的5種NH1種子固體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d。挑取5種篩選培養(yǎng)基上的單菌落各200株，分別接種于NH1種子液體培養(yǎng)基，30 ℃條件下恒溫振蕩培養(yǎng)4 d。取種子液5 mL接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量50 mL/100 mL，30 ℃、230 r/min條件下培養(yǎng)48 h，測定輔酶Q10的產(chǎn)量。

1.3.7 高產(chǎn)輔酶Q10突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

將篩選到的高產(chǎn)輔酶Q10的突變株接種于NH1種子液體培養(yǎng)基，30 ℃、230 r/min條件下培養(yǎng)4 d。取種子液5 mL接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量50 mL/100 mL，30 ℃、230 r/min條件下培養(yǎng)48 h，測定輔酶Q10的產(chǎn)量。

1.3.8 輔酶Q10含量的測定

采用皂化法[22]提取類球紅細菌中的輔酶Q10，將已破碎的菌體細胞加入7.5 mL pH值為11.0的氫氧化鈉溶液中，90 ℃恒溫加熱30 min，迅速冷卻。將已冷卻的皂化液轉(zhuǎn)移至500 mL封液漏斗，加入等體積的石油醚，充分振蕩萃取兩次，靜置分層，收集上層萃取液，最后合并兩次萃取液，轉(zhuǎn)移至真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，60 ℃蒸干石油醚，在剩余干粉中加入一定量的無水乙醇，微熱溶解，采用紫外分光光度法測定輔酶Q10含量[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 類球紅細菌的生長曲線

類球紅細菌的生長曲線見圖1。由圖1可知，在0～l0 h，類球紅細菌處于較長的延滯期，培養(yǎng)基液體顏色基本無變化；15～30 h內(nèi)處于對數(shù)生長期，菌體數(shù)量急速增長，培養(yǎng)基液體顏色逐漸變灰綠色；30～40 h菌體處于穩(wěn)定期，培養(yǎng)基液體徹底變?yōu)闈饩G色；40 h后進入衰亡期。

圖1 類球紅細菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of Rhodobacter sphaeroate

2.2 類球紅細菌的發(fā)酵曲線

類球紅細菌的輔酶Q10產(chǎn)量見圖2。由圖2可知，隨著發(fā)酵時間的延長，輔酶Q10產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后緩慢下降的趨勢。當發(fā)酵48 h時，輔酶Q10產(chǎn)量最高，為74.53 mg/L，因此，確定最佳發(fā)酵時間為48 h。

圖2 類球紅細菌的發(fā)酵曲線Fig.2 Fermentation curve of Rhodobacter sphaeroate

2.3 56Fe17+重離子束照射類球紅細菌的致死率

經(jīng)56Fe17+重離子照射誘變后，類球紅細菌的致死率見圖3。由圖3可知，類球紅細菌的致死率隨著56Fe17+重離子照射劑量的增加而增大，當照射劑量為16 Gy時，致死率達到99.7%，誘變效果最好。因此，選擇最佳照射劑量為16 Gy。

圖3 類球紅細菌的致死率曲線Fig.3 Fatality rate of Rhodobacter sphaeroate

2.4 篩選因子最小抑制濃度測定

通過測定篩選因子對類球紅細菌的最小抑制濃度發(fā)現(xiàn)，疊氮鈉對類球紅細菌的最小抑制質(zhì)量濃度為10 mg/L；維生素K3對類球紅細菌的最小抑制質(zhì)量濃度為10 mg/L；對羥基苯甲酸的最小抑制質(zhì)量濃度為450 mg/L；羅紅霉素對類球紅細菌的最小抑制質(zhì)量濃度為50 mg/L；卡那霉素的最小抑制質(zhì)量濃度為16 mg/L。因此，確定各篩選因子的最小抑制質(zhì)量濃度為該篩選因子的初始濃度。

2.5 56Fe17+重離子束照射誘變高產(chǎn)輔酶Q10菌株的篩選

2.5.1 空白平板篩選

通過空白平板篩選得到5株高產(chǎn)輔酶Q10菌株，編號為B-1、B-2、B-3、B-4、B-5，其輔酶Q10產(chǎn)量見表1。由表1可知，5株菌株的輔酶Q10產(chǎn)量為76.34～96.43 mg/L，其中菌株B-5的輔酶Q10產(chǎn)量最高，達96.43 mg/L，比原始菌株提高了29.38%。

表1 空白平板篩選得到的突變株的輔酶Q10產(chǎn)量Table 1 Coenzyme Q10 yield of mutant strains screened by blank plates

2.5.2 疊氮鈉抗性篩選

通過疊氮鈉（10 mg/L）抗性平板篩選得到5株高產(chǎn)輔酶Q10菌株，編號為Sa-1、Sa-2、Sa-3、Sa-4、Sa-5，其輔酶Q10產(chǎn)量見表2。由表2可知，5株菌株的輔酶Q10產(chǎn)量為76.81～127.86 mg/L，其中菌株Sa-5的輔酶Q10產(chǎn)量最高，達127.86 mg/L，比原始菌株提高了69.73%。

表2 抗疊氮鈉突變菌株的輔酶Q10產(chǎn)量Table 2 Coenzyme Q10 yield of mutant strains with sodium azide resistance

2.5.3 維生素K3抗性篩選

通過維生素K3（9 mg/L）抗性平板篩選得到5株高產(chǎn)輔酶Q10菌株，編號為V-1、V-2、V-3、V-4、V-5，其產(chǎn)量見表3。由表3可知，5株菌株的輔酶Q10產(chǎn)量為75.30～91.03 mg/L，其中，菌株V-1輔酶Q10產(chǎn)量最高，達91.03 mg/L，比原始菌株提高了23.36%。

表3 抗維生素K3突變株的輔酶Q10產(chǎn)量Table 3 Coenzyme Q10 yield of mutant strains with vitamin K3 resistance

2.5.4 卡那霉素抗性篩選

通過卡那霉素（16 mg/L）抗性平板篩選得到5株高產(chǎn)輔酶Q10菌株，編號為K-1、K-2、K-3、K-4、K-5，其產(chǎn)量見表4。由表4可知，5株菌株的輔酶Q10產(chǎn)量為78.33～97.15 mg/L，其中菌株K-2輔酶Q10產(chǎn)量最高，達97.15 mg/L，比原始菌株提高了24.03%。

2.5.5 羅紅霉素抗性篩選

通過羅紅霉素（30 mg/L）抗性平板篩選得到5株高產(chǎn)輔酶Q10的菌株，編號為R-1、R-2、R-3、R-4、R-5，其產(chǎn)量見表5。由表5可知，5株菌株的輔酶Q10產(chǎn)量為73.56～85.48 mg/L，其中菌株R-2的輔酶Q10產(chǎn)量最高，達85.48 mg/L，比原始菌株提高了16.20%。

表5 抗羅紅霉素突變株的輔酶Q10產(chǎn)量Table 5 Coenzyme Q10 yield of mutant strains with roxithromycin resistance

綜上，通過56Fe17+重離子束照射誘變類球紅細菌并結(jié)合抗性因子篩選，得到1株高產(chǎn)輔酶Q10的菌株Sa-5，其輔酶Q10產(chǎn)量最高，達127.86 mg/L，比原始菌株提高了69.73%。

2.6 突變菌株Sa-5的遺傳穩(wěn)定性

將突變菌株Sa-5在斜面上連續(xù)傳5代，每代的輔酶Q10產(chǎn)量見圖4。由圖4可知，突變菌株Sa-5的輔酶Q10產(chǎn)量隨傳代次數(shù)的增加變化幅度較小，輔酶Q10產(chǎn)量為126～129.1mg/L。說明突變菌株Sa-5是一株高產(chǎn)輔酶Q10且遺傳穩(wěn)定的優(yōu)良菌株。

圖4 突變菌株Sa-5的遺傳穩(wěn)定性Fig.4 Genetic stability of mutant strain Sa-5

3 結(jié)論

通過照射劑量為16 Gy的56Fe17+重離子束對類球紅細菌進行誘變后，采用疊氮鈉抗性篩選得到1株高產(chǎn)輔酶Q10的菌株Sa-5，其輔酶Q10產(chǎn)量達127.86 mg/L，比原始菌株提高了69.73%，是一株高產(chǎn)輔酶Q10且遺傳穩(wěn)定的優(yōu)良菌株。