枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化

羅 璇，石 玉，袁敏文，陳 同，馮光志

（1.武漢設(shè)計工程學(xué)院 食品與生物科技學(xué)院，湖北 武漢 430205；2.黃石市食品藥品檢驗檢測中心，湖北 黃石 435000）

克氏原螯蝦俗稱小龍蝦，是一種雜食性動物。自然環(huán)境中的一些水生植物、小型水生動物，甚至是同類都會成為小龍蝦的食物[1]?？耸显r腸道內(nèi)存在著某些益生菌，可以分泌半纖維素酶來降解植物性食物中的半纖維素成分[2-3]，半纖維素中含有50%的木聚糖[4]。王振宇等[5-6]研究發(fā)現(xiàn)，牲畜飼料中木聚糖酶的添加有助于提高飼料的利用率。因此，從克氏原螯蝦腸道內(nèi)篩選高產(chǎn)木聚糖酶活力的菌株，并通過固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化菌株的產(chǎn)酶工藝條件，提高木聚糖酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶活力，將會有益于小龍蝦對飼料的充分利用。

目前，少量研究主要是對小龍蝦致病菌的鑒定及致病機理的研究[7]。馮光志等[8-9]在2019年初對小龍蝦腸道產(chǎn)木聚糖酶細菌的分離與鑒定進行了報道，而國內(nèi)外對小龍蝦腸道益生菌的相關(guān)研究鮮有報道。因此，本研究以前期從克氏原螯蝦腸道內(nèi)篩選的一株產(chǎn)木聚糖酶的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Z-3[8]為研究對象，木聚糖酶活力為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法對其固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，以期將其作為益生菌添加到克氏原螯蝦飼料中，為克氏原螯蝦的高產(chǎn)養(yǎng)殖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Z-3：分離自小龍蝦腸道，保存于武漢設(shè)計工程學(xué)院生物工程實驗室[8-9]。

1.1.2 試劑

玉米芯、麩皮：武漢江夏農(nóng)貿(mào)市場；酵母浸粉、蛋白胨、苯酚、無水三氯化鐵、氯化銨、3,5-二硝基水楊酸（3,5-dini trosalicylic，DNS）（生化試劑或分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉、酒石酸鉀鈉、無水亞硫酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；木聚糖（分析純）：上海金穗生物科技有限公司；D（+）木糖（生化試劑）：上海山浦化工有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面保藏培養(yǎng)基（LB固體培養(yǎng)基）：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂2 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然，121 ℃條件下滅菌20 min。

液體種子培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基中不添加瓊脂。

固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基[10-11]：麩皮15 g，NH4Cl 2 g，F(xiàn)eCl30.34 g，蒸餾水1 000 mL，攪拌均勻，pH自然，121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

722型分光光度計：天津瑞普斯儀器有限公司；TS-211B型恒溫搖床：上海天呈實驗儀器制造有限公司；SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱、BXM-30R型臺式高速離心機：上海博遠實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；AL104型分析天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

1.3 方法

1.3.1 木聚糖酶粗酶液的制備

稱取1 g固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)，將其溶解在裝有10倍體積蒸餾水的50 mL離心管中，在20 ℃條件下漩渦振蕩溶解，用兩層紗布過濾發(fā)酵基質(zhì)，濾液于4 000 r/min條件下離心10 min，上清液即為木聚糖酶粗酶液[12]。

1.3.2 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[13]

取6支試管，依次加入0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL的木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，補加蒸餾水至0.5 mL，各管再加入1 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的木聚糖溶液，搖勻，37 ℃反應(yīng)8 min后，各管加入3 mL DNS試劑，搖勻，沸水浴5 min，取出加入5 mL蒸餾水，冷卻后，搖勻，于波長540 nm處測定吸光度值。以木糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=1.951 0x-0.030 1，R2=0.994 1）。

1.3.3 木聚糖酶酶活測定[14-15]

在一支試管中加入0.5 mL粗酶液，再取一支試管加入0.5 mL蒸餾水用作調(diào)零，分別加入1.0 mL木聚糖溶液，37 ℃保溫5 min，加入3 mL DNS試劑沸水浴5 min后取出，迅速冷卻至室溫，補加蒸餾水5 mL，于540 nm處測定其吸光度值。

酶活力定義：在37 ℃條件下，1 mL酶液每分鐘水解底物生成1 μg葡萄糖的酶量為一個酶活單位，以U/mL表示。本研究中的酶活力單位選定為單位濕基培養(yǎng)基的酶活力，以U/g濕基表示。具體計算公式如下：

式中：E為樣品的酶活力，U/mL；S為樣品中葡萄糖質(zhì)量，mg；N為粗酶液的稀釋倍數(shù)；T為反應(yīng)時間，min；V為參與反應(yīng)的粗酶液體積，mL。

1.3.4 枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

取斜面保藏的枯草芽孢桿菌Z-3，按2.5%～3.0%（V/V）的接種量接入裝有100 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min條件下過夜培養(yǎng)。按2%（V/V）的接種量將種子液接種于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝料量為30 g/250 mL，37 ℃條件下培養(yǎng)7 d，每天取一次樣，測定木聚糖酶活力，考察培養(yǎng)時間對Bacillus subtilisZ-3產(chǎn)木聚糖酶的影響。在此基礎(chǔ)上，以麩皮與玉米芯混合物為碳源培養(yǎng)3 d，考察麩皮占比（20%、40%、60%、80%、100%）對Bacillus subtilisZ-3產(chǎn)木聚糖酶的影響[16-17]。隨后，固定其他條件不變的情況下，依次考察添加量均為2.0 g/L氮源種類（氯化銨、硫酸銨、酵母提取物、蛋白胨）、培養(yǎng)基初始pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、培養(yǎng)溫度（27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃）、裝料量（20 g/250 mL、30 g/250 mL、40 g/250 mL、50 g/250 mL）、接種量（1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）對Bacillus subtilisZ-3產(chǎn)木聚糖酶的影響。

1.3.5 枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗[18]

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取影響顯著的3個因素初始pH值（A）、麩皮占比（B）及培養(yǎng)時間（C）為考察因素，木聚糖酶活力（Y）為響應(yīng)值，采用軟件Design Expert8.0.6.1設(shè)計3因素3水平Box-Behnken試驗，因素與水平見表1。

表1 枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests for solid-state fermentation technology optimization of xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 培養(yǎng)時間對菌株Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響

培養(yǎng)時間對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響見圖1。

圖1 培養(yǎng)時間對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.1 Effect of culture time on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

由圖1可知，隨著發(fā)酵時間的延長，酶活力逐漸升高，并于發(fā)酵3 d時達到最高（2 330 U/g），隨后呈下降趨勢，分析原因可能是枯草芽孢桿菌Z-3的生長和木聚糖酶的產(chǎn)生屬于同步偶聯(lián)合成，隨著發(fā)酵的進行，菌株的生長受到營養(yǎng)條件的限制和代謝產(chǎn)物的阻遏，導(dǎo)致發(fā)酵3 d后酶活力逐漸下降。因此，確定最佳培養(yǎng)時間為3 d。

2.1.2 碳源中麩皮占比對菌株產(chǎn)木聚糖酶的影響

根據(jù)前期試驗結(jié)果，選用價格廉價、產(chǎn)酶能力強的麩皮與玉米芯混合物為碳源，固態(tài)發(fā)酵枯草芽孢桿菌Z-3，又根據(jù)麩皮在固態(tài)發(fā)酵過程中具有較好的松散透氣特性，考察麩皮占比對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 麩皮占比對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.2 Effect of bran ratio on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

由圖2可知，隨著麩皮占比的增加，木聚糖酶活力呈先增加后下降的趨勢，當(dāng)碳源中麩皮占比為60%時，酶活力最高，為2 882 U/g。因此，確定最佳麩皮占比為60%。

2.1.3 氮源種類對菌株產(chǎn)木聚糖酶的影響

氮源種類對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響見圖3。

圖3 氮源種類對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source types on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

由圖3可知，不同氮源對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響不同。當(dāng)以氯化銨為氮源時，木聚糖酶活力最高，為2 330 U/g；當(dāng)以蛋白胨為氮源時，木聚糖酶活力最低，為1 170 U/g。結(jié)合工業(yè)經(jīng)濟考慮，氯化銨適合作為廉價易得的大規(guī)模氮源添加劑，因此，確定最優(yōu)氮源為氯化銨。

2.1.4 初始pH值對菌株產(chǎn)木聚糖酶的影響

初始pH值對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響見圖4。

圖4 初始pH值對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.4 Effect of initial pH on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

由圖4可知，隨著初始pH值的升高，木聚糖酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)初始pH值為6.0時，木聚糖酶活力達到最高，為2 588 U/g。因此，確定最優(yōu)初始pH值為6.0。

2.1.5 培養(yǎng)溫度對菌株產(chǎn)木聚糖酶的影響

培養(yǎng)溫度對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響見圖5。

圖5 培養(yǎng)溫度對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.5 Effect of culture temperature on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

由圖5可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，木聚糖酶活力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當(dāng)培養(yǎng)溫度為37 ℃時，酶活力最高，為2 599 U/g。分析原因可能是枯草芽孢桿菌Z-3的最適宜發(fā)酵溫度也為37 ℃，利于菌株產(chǎn)酶，這樣也進一步驗證了枯草芽孢桿菌Z-3的生長和木聚糖酶的產(chǎn)生屬于同步偶聯(lián)合成。因此，選擇37 ℃作為最佳發(fā)酵溫度。

2.1.6 裝料量對菌株產(chǎn)木聚糖酶的影響

裝料量對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響見圖6。

由圖6可知，隨著裝料量的增加，木聚糖酶活力呈先升高后下降的趨勢，但裝料量對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響不顯著。當(dāng)裝料量為30 g/250 mL時，木聚糖酶活力最高，為2 658 U/g。分析原因可能與枯草芽孢桿菌Z-3的來源有關(guān)，其來源于小龍蝦腸道，腸道微生物多為厭氧或兼性好氧微生物，它們的生長與氧的關(guān)系不是特別密切，而裝料量正是側(cè)面反映微生物對氧的需求程度。因此，確定最優(yōu)裝料量為30 g/250 mL。

圖6 裝料量對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.6 Effect of loading volume on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

2.1.7 接種量對菌株產(chǎn)木聚糖酶的影響

接種量對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響見圖7。

圖7 接種量對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.7 Effect of inoculum on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

由圖7可知，木聚糖酶活力隨接種量的增高呈先升高后下降的趨勢，但接種量對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的影響不顯著。當(dāng)接種量為2.5%時，木聚糖酶活力最高，為2 598 U/g。分析原因可能是接種量過大會引起溶氧不足，影響產(chǎn)物合成，而且會過多移入代謝廢物，也不經(jīng)濟；過小會延長培養(yǎng)時間，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。因此，確定最佳接種量為2.5%。

2.2 枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定最優(yōu)氮源為氯化銨，培養(yǎng)溫度為37 ℃，裝料量為30 g/250 mL，接種量為2.5%，選取影響顯著的因素初始pH值（A）、麩皮占比（B）及培養(yǎng)時間（C）為考察因素，木聚糖酶活力（Y）為響應(yīng)值，采用軟件Design Expert 8.0.6.1設(shè)計3因素3水平Box-Behnken試驗，結(jié)果與分析見表2，回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of Box-Behnken tests

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

采用軟件Design Expert 8.0.6.1對表2的結(jié)果進行多元二次回歸擬合，得到以木聚糖酶活力（Y）為因變量，初始pH值（A）、麩皮占比（B）及培養(yǎng)時間（C）為自變量的二次多項回歸方程：Y=389.60-18.73A+42.65B+43.88C-154.9A2-238.65B2-202.60C2。

由表3可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明模型的擬合程度較良好。方程的決定系數(shù)R2=0.995 6，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.990 0，說明該模型設(shè)計良好，試驗誤差小，在實驗范圍內(nèi)能較準(zhǔn)確的預(yù)測木聚糖酶的活力。方程的一次項A、B、C對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），其他項對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。各因素間交互作用對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶影響的響應(yīng)面及等高線見圖8。

圖8 各因素交互作用對枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶影響的響應(yīng)面及等高線Fig.8 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between each factors on xylanase production by Bacillus subtilis Z-3

響應(yīng)面圖形分析可以直觀地反映出各因素之間的交互作用對于響應(yīng)值的影響[19]；等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。相應(yīng)曲面的最高區(qū)域存在最大值[20]，即試驗結(jié)果Y在試驗區(qū)域內(nèi)具有最大極值。由圖8可知，三個交互影響的等高線圖類似圓形，說明初始pH值和碳源中麩皮占比的交互作用、初始pH值和發(fā)酵時間的交互作用、碳源比例和發(fā)酵時間的交互作用對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響均不太顯著。同時響應(yīng)曲面光滑，均有最高點，說明均存在最大值。

2.3 驗證試驗及工藝條件的確定

利用軟件Design Expert 8.0.6.1得到回歸模型預(yù)測的枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵工藝為麩皮占比61.43%，培養(yǎng)時間3.28 d，初始pH值為5.44，此時預(yù)測木聚糖酶酶活力為3 507.43 U/g濕基。為便于實際操作，將最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵工藝修正為麩皮占比60%，培養(yǎng)時間3 d，初始pH值為5.0。在此最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下，木聚糖酶酶活力實際值為3 459.58 U/g濕基。與預(yù)測值相比，相對偏差為1.36%，從而證實該模型可用于枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化。

3 結(jié)論

通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化得到克氏原螯蝦腸道來源枯草芽孢桿菌Z-3產(chǎn)木聚糖酶的最優(yōu)固態(tài)發(fā)酵工藝：培養(yǎng)時間3 d、培養(yǎng)溫度37 ℃、初始pH值5.0、裝料量30 g/250 mL，接種量2.5%，碳源為麩皮與玉米芯混合物，麩皮占比60%，氮源為氯化銨，在此最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下，木聚糖酶活力為3 459.58 U/g濕基，較初始發(fā)酵工藝下的木聚糖酶活力2 079.1 U/g濕基，提高了66.40%。