三穗鴨ATF4基因多態(tài)性鑒定及其與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析

譚光輝 李杰章 覃媛鈺 吳磊 張依裕

摘要：【目的】探討三穗鴨轉(zhuǎn)錄激活子4基因（ATF4）多態(tài)性與蛋殼品質(zhì)的相關(guān)性，揭示禽類ATF4的生物學(xué)功能及其遺傳特性，為進(jìn)一步研究蛋殼品質(zhì)的調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)?！痉椒ā恳匀滕啚檠芯繉?duì)象，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得ATF4基因后采用直接測(cè)序法檢查三穗鴨ATF4基因全部編碼區(qū)的變異位點(diǎn)，運(yùn)用SHEsis計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、單倍型頻率及基因型分布卡方值（c2）等，利用PopGen32計(jì)算各SNP位點(diǎn)的觀察雜合度（He）、有效等位基因（Ne）及多態(tài)信息量（PIC），并以SPSS 18.0中的一般線性模型（GLM）分析SNP位點(diǎn)對(duì)蛋殼品質(zhì)的遺傳效應(yīng)?！窘Y(jié)果】在三穗鴨ATF4基因第3外顯子（Exon-3）上發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNPs位點(diǎn)（g.2394G>A、g.2571A>G和g.2667A>G），均屬于同義突變。3個(gè)SNPs位點(diǎn)在三穗鴨群體中均呈中度多態(tài)性（0.25G位點(diǎn)對(duì)三穗鴨蛋重和蛋殼重的影響達(dá)顯著水平（P<0.05，下同），g.2667A>G位點(diǎn)對(duì)蛋殼厚度的影響達(dá)顯著水平，g.2394G>A位點(diǎn)對(duì)蛋殼品質(zhì)性狀指標(biāo)的影響不顯著（P>0.05）;雙倍型H2H2（AAGGGG）的蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度和蛋形指數(shù)均最高，是對(duì)三穗鴨蛋殼品質(zhì)最有利的基因型，且3個(gè)SNPs位點(diǎn)共同對(duì)蛋殼品質(zhì)的影響效應(yīng)明顯大于單個(gè)SNP位點(diǎn)?！窘Y(jié)論】三穗鴨ATF4基因存在3個(gè)SNPs位點(diǎn)（g.2394G>A、g.2571 A>G和g.2667A>G），均屬于同義突變，其中g(shù).2571A>G和g.2667A>G位點(diǎn)對(duì)蛋殼品質(zhì)有顯著影響，3個(gè)SNPs位點(diǎn)組合基因型對(duì)蛋殼品質(zhì)也產(chǎn)生顯著影響，可作為鴨蛋蛋殼品質(zhì)選擇的分子遺傳標(biāo)記。

關(guān)鍵詞： 三穗鴨;ATF4基因;SNP位點(diǎn);多態(tài)性;蛋殼品質(zhì)

0 引言

【研究意義】蛋殼作為禽蛋天然保護(hù)殼，在其保存、運(yùn)輸及孵化等方面發(fā)揮著重要作用;高質(zhì)量蛋殼不僅能延長(zhǎng)禽蛋的保質(zhì)期，減少運(yùn)輸中的破損率，還能調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育過程中的氣體交換，并為胚胎的生長(zhǎng)提供鈣源，而有利于幼禽孵化（俞路等，2008;宋凌子，2019）。隨著畜禽養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，禽蛋的生產(chǎn)及銷售已形成巨大產(chǎn)業(yè)鏈，而蛋殼破損帶來的經(jīng)濟(jì)損失也日益突出。因此，有效提高蛋殼品質(zhì)，減少蛋殼破損，已成為家禽育種研究的重要內(nèi)容之一?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蛋殼在蛋殼腺形成過程中需要大量的鈣離子沉積（宋凌子，2019）。轉(zhuǎn)錄激活子4（Activating transcription factor 4，ATF4）最初被認(rèn)為是一種廣泛表達(dá)的哺乳動(dòng)物DNA結(jié)合蛋白，又稱為環(huán)腺苷酸連接效應(yīng)元件2（cAMP-response element binding protein 2，cREB2），在各種應(yīng)激信號(hào)誘導(dǎo)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，也是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放的基本調(diào)控因子，對(duì)機(jī)體內(nèi)鈣離子的沉積具有調(diào)控作用（Rzymski et al.，2009;St-Arnaud and Mandic，2010;Singleton and Harris，2012;王慧和劉勤江，2018;Tesei et al.，2019）。ATF4基因是鴨蛋蛋殼品質(zhì)調(diào)控候選基因IP3R2的下游基因，其生物功能的發(fā)揮需要鈣離子活化激活，同時(shí)又是鈣離子釋放的基本調(diào)控因子之一（Sun et al.，2015），位于第1號(hào)染色體上，其mRNA全長(zhǎng)1065 bp，DNA序列全長(zhǎng)2914 bp，含3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。Chen等（2011）研究揭示，ATF4基因多態(tài)性與豬臀部脂肪厚度（BFT）、腰眼高度（LEH）、腰眼面積（LEA）及骨骼發(fā)育顯著相關(guān)。Voloshanenko等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖依賴于b-連環(huán)蛋白及獨(dú)立的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在Wnt信息傳導(dǎo)路徑中ATF4和ATF2能調(diào)控多種目標(biāo)基因表達(dá)。此外，ATF4和ATF2基因沉默會(huì)降低靶基因原膠原賴氨酸-2-酮戊二-5-雙加氧酶（Recombinant procollagen lysine-2-oxoglutarate-5-dioxygenase，PLOD2）和配體依賴的輔阻遏物（Ligand-dependent corepressor，LCOR）表達(dá)，推測(cè)ATF4基因涉及Wnt信號(hào)傳導(dǎo)，而對(duì)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖有一定影響（De，2011;Ackers and Malgor，2018）。此外，ATF4基因在動(dòng)物的眼部和骨骼發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用。Ameri和Harris（2008）研究表明，若缺失ATF4基因，小鼠則表現(xiàn)出盲眼、貧血及鈣離子分泌不足造成骨骼發(fā)育不良等癥狀。Rzymski等（2009）、Saito等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，在成骨細(xì)胞的分化進(jìn)程中，PERK-Eif2a-ATF4信號(hào)路徑能誘導(dǎo)成骨必需基因的表達(dá)，如骨鈣素基因。綜上所述，ATF4能調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放，影響細(xì)胞的凋亡與增殖，而直接或間接影響生物體表型性狀?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，有關(guān)ATF4生物學(xué)功能的研究主要集中在人類和小鼠上（秦蜀等，2018;張晟等，2019;Xin et al.，2019），而鮮見針對(duì)禽類ATF4的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以三穗鴨為研究對(duì)象，探討ATF4基因多態(tài)性與其蛋殼品質(zhì)的相關(guān)性，揭示禽類ATF4的生物學(xué)功能及其遺傳特性，為進(jìn)一步研究蛋殼品質(zhì)的調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

用于檢測(cè)ATF4基因多態(tài)性的288羽三穗鴨樣本來自貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院農(nóng)場(chǎng)，45周齡，健康無病，且均采取單體籠飼養(yǎng)的管理方式。采用無抗凝劑的普通生化管對(duì)每羽三穗鴨翅靜脈采血1.0～1.5 mL，采血管編號(hào)與其翅號(hào)一致，靜置斜放待血清析出后用移液槍將血清轉(zhuǎn)移至離心管中，離心至樣品清澈透亮，-20 ℃保存?zhèn)溆?。逐一收集記錄產(chǎn)蛋情況并編號(hào)（與翅號(hào)一致），進(jìn)行蛋殼品質(zhì)測(cè)定。全血DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，2×Taq PCR MasterMix試劑和瓊脂糖購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，DM2000 DNA Marker購(gòu)自重慶擎科生物科技有限公司。主要儀器設(shè)備：DYY-2C電泳儀（北京六一生物科技有限公司），PTC200梯度PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司），BL-320H電子天平（日本島津公司），EFR-01蛋殼強(qiáng)度測(cè)定儀（北京天翔飛域儀器設(shè)備有限公司），EA-01蛋品質(zhì)分析儀（北京天翔飛域儀器設(shè)備有限公司），HRLM-80高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 基因組DNA提取 按照動(dòng)物全血DNA提取試劑盒說明抽提血清基因組DNA，DNA編號(hào)對(duì)應(yīng)三穗鴨翅號(hào)，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合核酸濃度測(cè)定儀進(jìn)行檢測(cè)，稀釋至終濃度100 ng/mL，備用。

1. 2. 2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank已公布的鴨ATF4基因序列（登錄號(hào)NC_040046.1），以Primer 3.0（http：//primer3.ut.ee/）設(shè)計(jì)擴(kuò)增ATF4基因所有編碼區(qū)的5對(duì)引物（表1），所有引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2. 3 DNA池PCR擴(kuò)增及測(cè)序分型 PCR反應(yīng)體系20.0 mL：PCR MasterMix 8.0 mL，正、反向引物各1.0 mL，DNA模板1.0 mL，RNase-Free Water 9.0 mL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性6 min;94 ℃ 30 s，退火50 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，并以MegAlign篩選單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)。根據(jù)SNP位點(diǎn)，以個(gè)體DNA為模板，選用相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，并進(jìn)行基因分型。

1. 3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SHEsis（http：//analysis.bio-x.cn/）計(jì)算基因型頻率、等位基因頻率、單倍型頻率、基因型分布卡方值（c2）和連鎖不平衡的D和g2，采用PopGen32計(jì)算各SNP位點(diǎn)的觀察雜合度（He）、有效等位基因（Ne）及多態(tài)信息量（PIC），并利用SPSS 18.0中的一般線性模型（GLM）分析SNP位點(diǎn)基因型和雙倍型與蛋殼品質(zhì)性狀指標(biāo)的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 三穗鴨ATF4基因多態(tài)性分析結(jié)果

使用MegAlign對(duì)三穗鴨ATF4基因多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果在鴨ATF4基因第3外顯子（Exon-3）上共發(fā)現(xiàn)3個(gè)SNPs位點(diǎn)，且每個(gè)SNP位點(diǎn)均存在3種基因型，如圖2所示。3個(gè)SNPs位點(diǎn)分別是：g.2394G>A、g.2571A>G和g.2667A>G。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，3個(gè)SNPs位點(diǎn)均屬于同義突變，未引起編碼氨基酸變化。

2. 2 三穗鴨ATF4基因群體遺傳學(xué)分析結(jié)果

對(duì)三穗鴨ATF4基因檢測(cè)到的3個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行遺傳特性分析，結(jié)果（表2）表明，g.2571A>G位點(diǎn)以GA基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，其基因型頻率為0.479，以G為優(yōu)勢(shì)等位基因，其頻率為0.573;該SNP位點(diǎn)在三穗鴨群體中的He為0.489。g.2667A>G位點(diǎn)以AA基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，其基因型頻率為0.469，以A為優(yōu)勢(shì)等位基因，其頻率為0.672;該SNP位點(diǎn)在三穗鴨群體中的He為0.441。g.2394G>A位點(diǎn)以GG基因型為優(yōu)勢(shì)基因型，其基因型頻率為0.458，以G為優(yōu)勢(shì)等位基因，其頻率為0.682;該SNP位點(diǎn)在三穗鴨群體中的He為0.434。3個(gè)SNPs位點(diǎn)在三穗鴨群體中均呈中度多態(tài)性（0.25

2. 3 三穗鴨ATF4基因SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡分析結(jié)果

D和g2是常用于衡量連鎖不平衡的2個(gè)重要參數(shù)，其中，區(qū)域內(nèi)重組事件發(fā)生連鎖不平衡的概率通過D反映，而連鎖分析通過g2反映（Mayo，2008）。當(dāng)D>0.8時(shí)，表明SNP位點(diǎn)間強(qiáng)連鎖且不平衡，當(dāng)g2>0.330時(shí)，表明SNP位點(diǎn)間緊密連鎖且趨向于一個(gè)整體遺傳（Ardlie et al.，2002;Slatkin，2008）。由表3可知，g.2667A>G位點(diǎn)與g.2571A>G位點(diǎn)間的D為1.0，大于0.8，且g2為0.665，大于0.330，可確定這2個(gè)位點(diǎn)間處于強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài)，即g.2667A>G位點(diǎn)和g.2571A>G位點(diǎn)為高度連鎖，趨向整體遺傳;g.2394G>A位點(diǎn)與g.2571A>G位點(diǎn)間的D為1.0，大于0.8，且g2為0.347，大于0.330，可確定這2個(gè)位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài);g.2667A>G位點(diǎn)與g.2394G>A位點(diǎn)間的D為1.0，大于0.8，但g2為0.227，小于0.330，說明這2個(gè)位點(diǎn)間不存在強(qiáng)連鎖不平衡。

2. 4 三穗鴨ATF4基因SNP位點(diǎn)的單倍型和雙倍型分析結(jié)果

三穗鴨ATF4基因SNP位點(diǎn)的單倍型和雙倍型分析結(jié)果如表4所示，3個(gè)SNPs位點(diǎn)在三穗鴨群體中共檢測(cè)到4種單倍型（H1、H2、H3和H4）和9種雙倍型（H1H2、H1H3、H1H4、H2H2、H2H3、H2H4、H3H3、H3H4和H4H4）。其中，H2（AGG）為優(yōu)勢(shì)單倍型，其頻率為0.328，H1（AAG）為劣勢(shì)單倍型，其頻率為0.099;H2H3（GAGAGA）為優(yōu)勢(shì)雙倍型，其頻率為0.219，H1H2（AAGAGG）和H1H3（GAAAGG）為劣勢(shì)雙倍型，其頻率均為0.063。

2. 5 三穗鴨ATF4基因SNP位點(diǎn)基因型與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

三穗鴨ATF4基因3個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果（表5）表明，g.2571A>G位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的蛋重和蛋殼重存在一定差異，以GA基因型個(gè)體的蛋重和蛋殼重最高，其次是GG基因型個(gè)體，AA基因型個(gè)體的最低，GA基因型個(gè)體的蛋重和蛋殼重均顯著高于AA基因型個(gè)體（P<0.05，下同）;g.2667A>G位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的蛋殼厚度存在一定差異，GG基因型個(gè)體的蛋殼最厚，AA基因型個(gè)體的蛋殼最薄，二者差異顯著;g.2394G>A位點(diǎn)不同基因型個(gè)體間的蛋殼品質(zhì)未存在顯著差異（P>0.05，下同）。

2. 6 三穗鴨ATF4基因SNP位點(diǎn)雙倍型與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果

三穗鴨ATF4基因雙倍型與蛋殼品質(zhì)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果（表6）表明，H2H2個(gè)體的蛋殼厚度顯著高于H1H4個(gè)體和H4H4個(gè)體，H2H2個(gè)體和H3H4個(gè)體的蛋殼強(qiáng)度顯著高于H3H3個(gè)體，H2H2個(gè)體的蛋形指數(shù)顯著高于H4H4個(gè)體，H4H4個(gè)體的蛋重顯著高于H1H2個(gè)體和H2H2個(gè)體，H4H4個(gè)體的蛋殼重顯著高于H3H3個(gè)體，其他雙倍型與蛋殼指標(biāo)間未產(chǎn)生顯著影響。

3 討論

近年來，有關(guān)ATF4基因多態(tài)性的研究主要集中在人類和動(dòng)物上（Qu et al.，2010;Morris et al.，2014）。本研究在貴州地方品種三穗鴨ATF4基因的Exon-3上檢測(cè)到3個(gè)SNPs位點(diǎn)：g.2394G>A、g.2571A>G和g.2667A>G，均屬于同義突變，且這3個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡。Hardy-Weinberg平衡常用于預(yù)測(cè)未來世代的基因型和等位基因頻率，評(píng)估當(dāng)前種群的平衡狀態(tài)，在一個(gè)大孟德爾群體中的個(gè)體間進(jìn)行隨機(jī)交配，同時(shí)不存在選擇、突變、遷移和遺傳漂變發(fā)生時(shí)，其基因頻率將保持不變，即這個(gè)群體被稱為處于Hardy-Weinberg平衡（Mayo，2008）。由此推測(cè)，本研究中的3個(gè)SNPs位點(diǎn)尚未受到突變、選擇及遺傳漂變等的影響。畜禽基因組功能結(jié)構(gòu)基因的變異可能會(huì)影響其生產(chǎn)性狀，而變異位點(diǎn)間的連鎖關(guān)系則決定群體遺傳結(jié)構(gòu)的變化。本研究通過3個(gè)SNPs位點(diǎn)的連鎖不平衡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)g.2667A>G位點(diǎn)和g.2394G>A位點(diǎn)間不存在強(qiáng)連鎖不平衡，說明這2個(gè)SNPs位點(diǎn)間趨向獨(dú)立遺傳，而其他SNP位點(diǎn)間均處于強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài);此外，3個(gè)SNPs位點(diǎn)在三穗鴨群體中共檢測(cè)到4種單倍型（H1、H2、H3和H4）和9種雙倍型（H1H2、H1H3、H1H4、H2H2、H2H3、H2H4、H3H3、H3H4和H4H4），但理論上應(yīng)該有8種單倍型和36種雙倍型，實(shí)際觀測(cè)值與理論值存在差異，可能是長(zhǎng)期人工選育致使其他單倍型個(gè)體消失，也可能與本研究選擇的三穗鴨群體數(shù)量較少有關(guān)。由于3個(gè)SNPs位點(diǎn)均處于中度多態(tài)性，更有利于遺傳選擇（陳祥等，2017;李青等，2019），可在今后的遺傳選育工作中獲得更高的遺傳潛力;且3個(gè)SNPs位點(diǎn)的He相近，表明三穗鴨群體具有較高的遺傳質(zhì)量（張躍博等，2018），但更精確的遺傳多樣性評(píng)價(jià)可能需要更多的樣本數(shù)量來支持。

本研究的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示，g.2571A>G位點(diǎn)對(duì)蛋殼品質(zhì)產(chǎn)生明顯影響，GA基因型個(gè)體和GG基因型個(gè)體的蛋重分別比AA基因型個(gè)體重2.569和2.105 g，其差異均達(dá)顯著水平，且GA基因型個(gè)體的蛋殼重顯著高于AA基因型個(gè)體;g.2667A>G位點(diǎn)對(duì)蛋殼厚度產(chǎn)生明顯影響，GG基因型個(gè)體的蛋殼厚度顯著高于AA基因型個(gè)體;g.2394G>A位點(diǎn)不同基因型與蛋殼品質(zhì)性狀間的相關(guān)性尚未達(dá)顯著水平。綜合各蛋殼品質(zhì)性狀指標(biāo)與不同基因型間的相關(guān)性，可初步確定GG基因型是對(duì)蛋殼品質(zhì)有利的基因型。單個(gè)核苷酸堿基突變可引起蛋白構(gòu)象變化，增加或降低熵值，影響基因復(fù)制速度、轉(zhuǎn)錄剪接過程及蛋白翻譯速度，甚至影響其半衰期，即通過調(diào)控基因表達(dá)水平進(jìn)而影響畜禽生產(chǎn)性能（Gahlon et al.，2018）。g.2571A>G位點(diǎn)和g.2667A>G位點(diǎn)與蛋殼品質(zhì)存在顯著相關(guān)性，推測(cè)其原因是A→G突變影響ATF4基因剪接的外顯子基序（Moura et al.，2011;Sauan and Kimchi-Sarfaty，2011;Supek et al.，2014），而基因剪接是基因表達(dá)中最重要的過程，直接影響ATF4基因編碼蛋白翻譯及蛋白功能、構(gòu)象和表達(dá)水平的變化，進(jìn)而影響機(jī)體鈣離子表達(dá)及引起機(jī)體調(diào)控蛋殼形成相關(guān)組織細(xì)胞的增殖和凋亡，間接或直接對(duì)蛋殼品質(zhì)產(chǎn)生影響。

動(dòng)物表型除受單個(gè)核苷酸堿基突變影響外，多個(gè)SNPs位點(diǎn)的組合效應(yīng)也對(duì)其表型產(chǎn)生明顯影響。將多個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行組合產(chǎn)生的基因型分析能同步考慮非等位基因的相互作用及突變位點(diǎn)間的連鎖不平衡，具有更好的統(tǒng)計(jì)效力（Orozco et al.，2009）。本研究的SNP位點(diǎn)雙倍型與蛋殼品質(zhì)關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，3個(gè)SNPs位點(diǎn)聯(lián)合組成的雙倍型對(duì)蛋殼品質(zhì)性狀指標(biāo)有不同程度的影響，H2H2個(gè)體的蛋殼厚度、蛋殼強(qiáng)度和蛋形指數(shù)均最高，綜合各項(xiàng)蛋殼品質(zhì)性狀指標(biāo)在不同雙倍型個(gè)體間的差異，認(rèn)為H2H2（AAGGGG）雙倍型是對(duì)三穗鴨蛋殼品質(zhì)最有利的基因型，且3個(gè)SNPs位點(diǎn)共同對(duì)蛋殼品質(zhì)的影響效應(yīng)明顯大于單個(gè)SNP位點(diǎn)，說明3個(gè)SNPs位點(diǎn)共同聯(lián)合引起基因結(jié)構(gòu)變化強(qiáng)于單個(gè)SNP位點(diǎn)，其對(duì)蛋殼品質(zhì)的調(diào)控作用可能更有效。但由于部分雙倍型個(gè)體數(shù)量相對(duì)較少，其統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果尚需進(jìn)一步增加測(cè)試樣本以確定研究結(jié)論。

4 結(jié)論

三穗鴨ATF4基因存在3個(gè)SNPs位點(diǎn)（g.2394G>A、g.2571A>G和g.2667A>G），均屬于同義突變，其中g(shù).2571A>G和g.2667A>G位點(diǎn)對(duì)蛋殼品質(zhì)有顯著影響，3個(gè)SNPs位點(diǎn)組合基因型對(duì)蛋殼品質(zhì)也產(chǎn)生顯著影響，可作為鴨蛋蛋殼品質(zhì)選擇的分子遺傳標(biāo)記。

參考文獻(xiàn)：

陳祥，龍威海，孫振梅，馮文武，李鵬程，許厚強(qiáng). 2017. 貴州地方山羊FSHR基因與繁殖性狀的相關(guān)性研究[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，25（1）：94-101. [Chen X，Long W H，Sun Z M，F(xiàn)eng W W，Li P C，Xu H Q. 2017. Correlation study between FSHR gene and reproductive Traits of Guizhou native goat（Capra hircus）[J]. Journal of Agricultural Biotechnology，25（1）：94-101.]

李青，王慧華，盧曾奎，金美林，儲(chǔ)明星，魏彩虹. 2019. 綿羊PDGF-D基因多態(tài)性與尾型的關(guān)聯(lián)[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，50（4）：688-700. [Li Q，Wang H H，Lu Z K，Jin M L，Chu M X，Wei C H. 2019. Association of the PDGF-D gene genetic variation with sheep tail traits[J]. Acta Ve-terinaria et Zootechnica Sinica，50（4）：688-700.]

秦蜀，陳潤(rùn)，趙曉芳，王勇，向遠(yuǎn)彩，羅國(guó)松，周虹，代榮陽，張春燕. 2018. ATF4在CCl4和LPS/D-GalN介導(dǎo)小鼠肝損傷中的保護(hù)作用[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，34（13）：2146-2150. [Qin S，Chen R，Zhao X F，Wang Y，Xiang Y C，Luo G S，Zhou H，Dai R Y，Zhang C Y. 2018. Protective role of ATF4 in CCl4-and LPS/D-Gal N-mediated liver injury in mice[J]. The Journal of Practical Medicine，34（13）：2146-2150.]

宋凌子. 2019. 禽蛋鈣化殼中有機(jī)基質(zhì)組分及其與蛋殼性狀相關(guān)性的研究[D]. 杭州：浙江農(nóng)林大學(xué). [Song L Z. 2019. The organic matrix components in the poultry calcified shells and the correlations between the organic matrix and eggshell traits[D]. Hangzhou：Zhejiang A & F University.]

王慧，劉勤江. 2018. ATF4基因與腫瘤[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，15（18）：36-39. [Wang H，Liu Q J. 2018. ATF4 gene and tumor[J]. China Medical Herald，15（18）：36-39.]

俞路，王雅倩，章世元，潘志樂. 2008. 雞蛋殼內(nèi)部組成、構(gòu)造及其質(zhì)量的基因調(diào)控技術(shù)[J]. 動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，20（3）：366-370. [Yu L，Wang Y Q，Zhang S Y，Pan Z L. 2008. Gene regulation technology for internal composition，structure and quality of chicken eggshell[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition，20（3）：366-370.]

張晟，林曉琳，和法蓮，彭珊，申紅芬. 2019. 活化轉(zhuǎn)錄因子4基因敲除小鼠完全缺失晶狀體致小眼癥[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，40（7）：39-42. [Zhang S，Lin X L，He F L，Peng S，Shen H F. 2019. ATF4-deficient adult mice displayed microphthalmia due to complete absence of a lens[J]. Progress in Veterinary Medicine，40（7）：39-42.]

張躍博，蒲蕾，張金山，顏華，王立剛，侯欣華，劉欣，高紅梅，王立賢，張龍超. 2018. 杜洛克豬HLCS基因組織表達(dá)分析及其編碼區(qū)多態(tài)性與剩余采食量的關(guān)聯(lián)[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，49（6）：1108-1115. [Zhang Y B，Pu L，Zhang J S，Yan H，Wang L G，Hou X H，Liu X，Gao H M，Wang L X，Zhang L C. 2018. Tissue expression profiles of HLCS gene and its association with residual feed intake in Duroc[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica，49（6）：1108-1115.]

Ackers I，Malgor R. 2018. Interrelationship of canonical and non-canonical Wnt signalling pathways in chronic metabolic diseases[J]. Diabetes & Vascular Disease Research，15（1）：3-13.

Ameri K，Harris A L. 2008. Activating transcription factor 4[J]. The International Journal of Biochemistry & Cell Bio-logy，40（1）：14-21.

Ardlie K G，Kruglyak L，Seielstad M. 2002. Patterns of lin-kage disequilibrium in the human genome[J]. Nature Reviews Genetics，3（4）：299-309.

Chen C，Wu W J，Xiong Y Z. 2011. Association of porcine ATF4 gene polymorphism and production traits and ana-lysis of gene expression[J]. Hereditas，33（12）：1347-1352.

De A. 2011. Wnt/Ca2+ signaling pathway：A brief overview[J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica，43（10）：745-756.

Gahlon H L，Walker A R，Cisneros G A，Lamers M H，Rueda D S. 2018. Reduced structural flexibility for an exonuc-lease deficient DNA polymerase III mutant[J]. Physical Chemistry Chemical Physics，20（42）：26892-26902.

Mayo O. 2008. A century of Hardy-Weinberg equilibrium[J]. Twin Research and Human Genetics，11（3）：249-256.

Morris B J，Donlon T A，He Q，Grove J S，Masaki K H，Elliott A，Willcox D C，Willcox B J. 2014. Association ana-lyses of insulin signaling pathway gene polymorphisms with healthy aging and longevity in Americans of Japanese Ancestry[J]. The Journals of Gerontology. Series A：Biological Sciences and Medical Sciences，69（3）：270-273.

Moura G R，Pinheiro M，F(xiàn)reitas A，Oliveira J L，F(xiàn)rommlet J C，Carreto L，Soares A R，Bezerra A R，Santos M A. 2011. Species-specific codon context rules unveil non-neutrality effects of synonymous mutations[J]. PLoS One，6（10）：e26817.

Orozco G，Hinks A，Eyre S，Ke X，Gibbons L J，Bowes J，F(xiàn)lynn E，Martin P，Wilson A G，Bax D E，Morgan A W，Eme-ry P，Steer S，Hocking L，Reid D M，Wordsworth P，Harrison P，Thomson W，Barton A，Worthington J. 2009. Combined effects of three independent SNPs greatly increase the risk estimate for RA at 6q23[J]. Human Molecular Genetics，18（14）：2693-2699.

Qu M，Tang F，Wang L，Yan H，Han Y，Yan J，Yue W，Zhang D. 2010. Associations of ATF4 gene polymorphisms with schizophrenia in male patients[J]. American Journal of Medical Genetics. Part B：Neuropsychiatric Genetics，147B（6）：732-736.

Rzymski T，Milani M，Singleton D C，Harris A L. 2009. Role of ATF4 in regulation of autophagy and resistance to drugs and hypoxia[J]. Cell Cycle，8（23）：3838-3847.

Saito A，Ochiai K，Kondo S，Tsumagari K，Murakami T，Cavener D R，Imaizumi K. 2011. Endoplasmic reticulum stress response mediated by the PERK-eIF2（alpha）-ATF4 pathway is involved in osteoblast differentiation induced by BMP2[J]. The Journal of Biological Chemistry，286（6）：4809-4818.

Sauna Z E，Kimchi-Sarfaty C. 2011. Understanding the contribution of synonymous mutations to human disease[J]. Nature Reviews. Genetics，12（10）：683-691.

Singleton D C，Harris A L. 2012. Targeting the ATF4 pathway in cancer therapy[J]. Expert Opinion on Therapeutic Targets，16（12）：1189-1202.

Slatkin M. 2008. Linkage disequilibrium—Understanding the evolutionary past and mapping the medical future[J]. Nature Reviews Genetics，9（6）：477-485.

St-Arnaud R，Mandic V. 2010. FIAT control of osteoblast activity[J]. Journal of Cellular Biochemistry，109（3）：453-459.

Sun C，Qu L，Yi G，Yuan J，Duan Z，Shen M，Qu L，Xu G，Wang K，Yang N. 2015. Genome-wide association study revealed a promising region and candidate genes for eggshell quality in an F2 resource population[J]. BMC Geno-mics，16：565. doi：10.1186/s12864-015-1795-7.

Supek F，Mi?ana B，Valcárcel J，Gabaldón T，Lehner B. 2014. Synonymous mutations frequently act as driver mutations in human cancers[J]. Cell，156（6）：1324-1335.

Tesei A，Cortesi M，Pignatta S，Arienti C，Dondio G M，Bigogno C，Malacrida A，Miloso M，Meregalli C，Chiorazzi A，Carozzi V，Cavaletti G，Rui M，Marra A，Rossi D，Collina S. 2019. Anti-tumor efficacy assessment of the sigma receptor pan modulator RC-106. A promising therapeutic tool for pancreatic cancer[J]. Frontiers in Pharmacology，10：490. doi：10.3389/fphar.2019.00490.

Voloshanenko O，Schwartz U，Kranz D，Rauscher B，Linnebacher M，Augustin I，Boutros M. 2018. b-catenin-independent regulation of Wnt target genes by RoR2 and ATF2/ATF4 in colon cancer cells[J]. Scientific Reports，8（1）：3178. doi：10.1038/s41598-018-20641-5.

Xin Y G，Wu W C，Qu J，Wang X J，Lei S，Yuan L X，Liu X J. 2019. Inhibition of mitofusin-2 promotes cardiac fibroblast activation via the PERK/ATF4 pathway and reactive oxygen species[J]. Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2019：3649808. doi：10.1155/2019/3649808.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）