海鮮菇栽培料中細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)及多樣性分析

徐兵 陸灝鈺 韋雪銘 張良 冀宏

摘要： 采用高通量測序技術(shù)研究海鮮菇栽培料中的細(xì)菌群落多樣性、微生物群落組成，結(jié)果表明，海鮮菇栽培料細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)測序共獲得52 192條序列，10 588個(gè)OTU數(shù)目，栽培料中具有較多的微生物群落;群落中，變形菌門占92.71%，γ-變形菌綱占75.77%，假單胞菌目占69.76%，莫拉氏菌科占68.73%，不動(dòng)桿菌屬占66.30%。

關(guān)鍵詞： 海鮮菇栽培料;微生物群落;多樣性;高通量測序;細(xì)菌

中圖分類號： S182? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）05-0148-05

海鮮菇別稱真姬菇，在分類學(xué)上隸屬白蘑科玉蕈屬[1]，為藥食兩用菌，其營養(yǎng)豐富，味道鮮美，海鮮菇多糖具有提高免疫力、抗老化、降血脂等功效[2-3]。在海鮮菇工廠化生產(chǎn)中，栽培料的應(yīng)用具有悠久的歷史[4]，其質(zhì)量、數(shù)量直接關(guān)系到海鮮菇的產(chǎn)量、質(zhì)量。栽培料主要營養(yǎng)提供者為農(nóng)業(yè)廢棄物，發(fā)酵時(shí)間相對較長，需要3個(gè)月左右，對環(huán)境要求高，這就大大增加了海鮮菇工廠化生產(chǎn)的場地空間、人工成本，從而導(dǎo)致企業(yè)生產(chǎn)成本增加。有研究表明，栽培料在天然堆肥條件下，微生物菌落生長受溫度變化的影響較大[5-6]，研制出既適合海鮮菇生長，又能縮短堆料時(shí)間的菌劑顯得尤其重要，而開展海鮮菇栽培料中微生物群落研究具有更重要的意義[7-9]。目前，國內(nèi)外對海鮮菇栽培料主要研究其配比優(yōu)化，對海鮮菇栽培料細(xì)菌群落的研究鮮見報(bào)道。

高通量測序技術(shù)是目前相對比較成熟的檢測手段，被廣泛應(yīng)用于微生物群落多樣性的研究。自2007年Orsouw等初次對玉米采用高通量測序技術(shù)進(jìn)行測序[10]開始，便開啟了測序新世界的大門，2011年完成對橡膠樹、可可樹等多種植物的測序[11-12]。本研究利用高通量測序技術(shù)，分析海鮮菇栽培料中的微生物群落組成和多樣性，剖析各類微生物的數(shù)量比例，明確優(yōu)勢菌群，了解優(yōu)勢菌群在栽培料中的主要作用，為主動(dòng)控制堆肥發(fā)酵過程、縮短堆料周期、減少企業(yè)生產(chǎn)成本、提高海鮮菇產(chǎn)量和質(zhì)量提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 堆料3個(gè)月的海鮮菇栽培料，其配比為玉米芯3%、甘蔗渣3%、木屑3%、麥麩1%、豆粕0.5%、玉米粉0.5%、生石灰0.025%，由昆山正興食用菌有限公司提供。

1.1.2 試劑 DNA提取試劑盒E.Z.N.A.Soil DNA Kit，由OMEGA公司生產(chǎn);Qubit 3.0 DNA檢測試劑盒，由Life公司生產(chǎn);2×Taq Master Mix，由Vazyme公司生產(chǎn);MagicPure Size Selection DNA Beads，由Transgen公司生產(chǎn)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 臺(tái)式離心機(jī)，由Thermo Fisher公司生產(chǎn);混勻型干式恒溫器，由深圳拓能達(dá)科技有限公司生產(chǎn);電泳儀、電泳槽，由北京六一儀器廠生產(chǎn);凝膠成像系統(tǒng)，由UVP公司生產(chǎn);Qubit3.0熒光計(jì)，由Invitrogen公司生產(chǎn);PCR儀，由BIO-RAD生產(chǎn);移液器，由Eppendorf公司生產(chǎn)。

1.2 測定內(nèi)容與方法

1.2.1 理化指標(biāo) 分別參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》（GB 5009.3—2016）、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》（GB 5009.4—2016）、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》（GB 5009.237—2016）、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》（GB 5009.5—2016）、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》（GB 5009.235—2016）測定海鮮菇栽培料的水分、灰分、pH值、蛋白質(zhì)含量、氨基酸態(tài)氮含量。采用DNS法測定還原糖、總糖含量。

1.2.2 微生物指標(biāo) 分別參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》（GB 4789.3—2016）、《飼料中細(xì)菌總數(shù)的測定》（GB/T 13093—2006）測定海鮮菇栽培料中的菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)、細(xì)菌總數(shù)。

1.2.3 微生物多樣性

1.2.3.1 樣品處理 取栽培料原始樣品200 mg，放入無菌的2 mL EP管中，加入濃度為70%的乙醇1 mL，混合，振蕩;室溫10 000 r/min離心3 min，丟棄上漿;添加1×磷酸緩沖鹽溶液（PBS溶液），混勻，室溫10 000 r/min離心1 min，丟棄上層液體;倒置EP管在吸濕紙上1 min，直到?jīng)]有液體流出，將樣品管置于烘箱中55 ℃干燥10 min，使殘留乙醇完全揮發(fā)。

1.2.3.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增 采用試劑盒提取海鮮菇栽培料中的細(xì)菌基因組DNA，提取的基因組DNA在細(xì)菌16S rDNA的V3～V4區(qū)進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增;待反應(yīng)完全結(jié)束，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，可得到清晰的條帶（圖1），DNA濃度達(dá)到擴(kuò)增所需要求，可用于后續(xù)的研究分析。

1.2.3.3 測序數(shù)據(jù)處理優(yōu)化 運(yùn)用Qiime 1.8.0軟件過濾序列，去除3′端的引物接頭、引物錯(cuò)配比率>0.1的序列、樣本中序列尾部質(zhì)量值<20的堿基、含N的序列、長度<200 bp的序列、嵌合體序列，使用Mothur 1.30.1軟件中的Uchime去除嵌合體序列。

1.2.3.4 多樣性分析 采用Usearch 5.2.236軟件對97%相似水平下的操作分類單元（OTU）進(jìn)行聚類分析，選擇豐度最高的序列作為OTU代表性序列;采用Mothur 1.30.1軟件分析得出Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、Coverage指數(shù)等群落分布多樣性指數(shù)及Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)等群落分布豐度指數(shù)。

1.2.3.5 群落結(jié)構(gòu)分析 采用序列比對分析軟件Blastn工具將OTU序列與對應(yīng)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，篩選出OTU序列的最佳比對結(jié)果，并對比對結(jié)果進(jìn)行過濾，獲得樣品在門、綱、目、科、屬不同分類水平上的分類學(xué)比對情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 海鮮菇栽培料的理化性狀及微生物指標(biāo)

試驗(yàn)結(jié)果表明，海鮮菇栽培料中水分含量、灰分含量、pH值、蛋白質(zhì)含量、氨基酸態(tài)氮含量、還原糖含量、總糖含量分別為60.27%、2.44%、7.20、3.98%、0.023%、0.18%、26.70%，菌落總數(shù)、細(xì)菌總數(shù)分別為1.3×107、1.2×108 CFU/g，大腸菌群未檢出。

2.2 海鮮菇栽培料中的微生物多樣性

試驗(yàn)結(jié)果表明，從16S rDNA基因的V3～V4測序中獲得56 422個(gè)序列，平均長度為462.26 bp，質(zhì)控后，共有52 192個(gè)序列，平均長度為424.26 bp;對97%相似水平下的序列進(jìn)行OTU統(tǒng)計(jì)分析，共獲得10 588個(gè)OTU數(shù);經(jīng)軟件分析，ACE、Chao1、Shannon、Simpson、Coverage指數(shù)分別為480 779.61、151 060.50、4.59、0.10、0.81，說明栽培材料中微生物群落的多樣性、總體豐富程度相對較高[13]。

2.3 海鮮菇栽培料細(xì)菌群落在不同分類學(xué)上的分布

2.3.1 門、綱 試驗(yàn)結(jié)果表明，海鮮菇栽培料中共鑒定出11個(gè)細(xì)菌門，主要的有變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、軟壁菌門（Tenericutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）9個(gè)細(xì)菌門，占比分別為92.71%、3.63%、3.37%、0.19%、0.02%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%、0.01%。由圖2可見，變形菌門中的γ-變形菌綱占比相對最高，為75.77%，是細(xì)菌的主要種類。

2.3.2 目、科 由圖3、圖4可見，海鮮菇栽培料中共鑒定出超過20種細(xì)菌目，其中，假單胞菌目 （Pseudomonadales）的比例相對最高，達(dá)到69.76%，而伯克氏菌目（Burkholderiales）、紅細(xì)菌目（Rhodobacterales）分別為11.57%、4.72%，說明從目水平上看，假單胞菌目最為占優(yōu);在科水平上，莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、叢毛單胞菌科（Comamonadaceae）分別屬于假單胞目、伯克氏菌目，所占比例分別為68.73%、11.46%，而紅細(xì)菌目中紅桿菌科（Rhodobacteraceae）僅為4.72%，說明莫拉氏菌科最為占優(yōu)。

2.3.3? 屬 由圖5可見，海鮮菇栽培料中共鑒定獲得超過49個(gè)細(xì)菌屬，主要有不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）、芽孢桿菌屬（Gemmobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas），占比分別為66.30%、9.56%、3.43%、2.99%、1.55%、1.49%，其中，不動(dòng)桿菌屬最為占優(yōu)。

3 結(jié)論與討論

食用菌栽培料中的含水量一般控制在60%～65%[14-15];灰分含量的高低會(huì)直接影響海鮮菇中礦物質(zhì)含量的多少;pH值偏低，拌料操作中往往加入1%的石灰來調(diào)控[16]，pH值偏高，可以在栽培料中添加含氮量較高的物質(zhì)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，海鮮菇栽培料中的水分含量、灰分含量、pH值分別為60.27%、2.44%、7.20，滿足海鮮菇工廠化生產(chǎn)的需求。栽培料中微生物生長有一部分是依靠其分解栽培料中的糖，糖含量高低至關(guān)重要，而發(fā)酵時(shí)間越長，糖含量會(huì)越少，因此，在早期發(fā)酵階段，應(yīng)盡可能滿足微生物的生長需求，使其充分發(fā)酵[17-18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，海鮮菇栽培料中蛋白質(zhì)含量、氨基酸態(tài)氮含量、還原糖含量、總糖含量分別為3.98%、0.023%、0.18%、26.70%，能較好滿足海鮮菇生長對養(yǎng)分的需求。

海鮮菇生長所需養(yǎng)料是靠微生物分解栽培料中的營養(yǎng)物質(zhì)獲得，微生物扮演著重要的角色。γ-變形菌亞群在變形菌門中是重要的菌群，而變形菌門是革蘭氏陰性菌的主要組成部分[19]。Peters等分析由玉米秸稈、木屑組成的堆肥材料中的細(xì)菌群落發(fā)現(xiàn)，其中存在大量的γ-變形菌亞群[20]。假單胞菌目在栽培料發(fā)酵過程中對加快腐熟發(fā)揮著重要的作用，王勝認(rèn)為，一個(gè)好的腐熟環(huán)境可以加快碳、氮、磷、鉀、硫等分解而被植物吸收，并在秸稈腐熟中加入沼澤紅假單胞菌以創(chuàng)造好的發(fā)酵環(huán)境[21]。不動(dòng)桿菌是兼性厭氧菌，能降解纖維素，在自然發(fā)酵過程中，栽培料中的氧含量會(huì)相對較低，對不動(dòng)桿菌而言可提高堆肥中纖維素的分解效率[22-23]。本試驗(yàn)采用高通量測序、微生物多樣性檢測技術(shù)分析海鮮菇栽培料中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，結(jié)果表明，共獲得52 192條序列，10 588個(gè)OTU數(shù);栽培料中共鑒定得到細(xì)菌菌落11個(gè)門、20個(gè)目、49個(gè)屬，栽培料中的優(yōu)勢菌群分別是變形菌門、γ-變形菌綱、假單胞菌目、莫拉氏菌科、不動(dòng)桿菌屬，其相應(yīng)占比分別為92.71%、75.77%、69.76%、68.73%、66.30%，說明栽培料中菌群有較好的多樣性和豐度，對海鮮菇生長十分有利。

須補(bǔ)充的是，本次試驗(yàn)中未檢出大腸桿菌，說明海鮮菇栽培料被糞便污染的可能性很小，存在腸道病原微生物的可能性微乎其微，這在一定程度上減少了不利菌群對栽培材料潛在的危害。

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收 稿日期：2019-02-26

基金項(xiàng)目：江蘇省蘇州市農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新項(xiàng)目（編號：SNG2017066）。

作者簡介：徐 兵（1982—），男，江蘇常熟人，碩士，實(shí)驗(yàn)師，從事微生物學(xué)研究。E-mail：xubing@cslg.cn。

通信作者：冀 宏，博士，教授，從事食、藥用菌研究。E-mail：595827676@qq.com。