遼寧省花生網(wǎng)斑病病原菌鑒定及生物學特性研究

謝瑾卉　林英　臧超群　裴雪　梁春浩

摘要：為確定遼寧省花生（Arachis hypogaea Linn.）網(wǎng)斑病病原菌，采用柯赫氏法則，測定從病樣中分離的純培養(yǎng)物致病性，根據(jù)其形態(tài)學特性及ITS序列分析，對病原菌進行鑒定。采用菌落生長法及凹載玻片萌發(fā)法研究病原菌生物學特性。結果表明，遼寧省花生網(wǎng)斑病病原菌為Peyronellaea arachidicola。菌絲生長最適溫度為23 ℃，最佳碳源為麥芽糖、最佳氮源為酵母膏，最適pH為7，光暗交替有利于菌絲生長，菌絲致死溫度為45 ℃。分生孢子萌發(fā)的最適溫度為25 ℃，最適pH為7，光照條件有利于分生孢子萌發(fā)。

關鍵詞：花生（Arachis hypogaea Linn.）;花生網(wǎng)斑病;派倫霉（Peyronellaea arachidicola）;生物學特性

中圖分類號：S435.652? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2020）02-0082-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.02.017? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Identification and biological characteristics of the pathogen

from peanut web blotch in Liaoning province

XIE Jin-hui，LIN Ying，ZANG Chao-qun，PEI Xue，LIANG Chun-hao

（Plant Protection Research Institute，Liaoning Academy of Agricultural Sciences， Shenyang 110161，China）

Abstract： In order to confirm the pathogen of peanut web blotch in Liaoning province， the pathogenicity of pure cultures separated from the disease samples was determined by Kirsch's rule， and the pathogenic bacteria were identified according to their morphological characteristics and ITS sequence analysis. The biological characteristics of pathogenic bacteria were studied by colony growth method and concave glass slide germination method. The results showed that the pathogen of peanut netted spot disease in Liaoning province was Peyronellaea arachidicola. The optimum temperature of mycelium growth was 23 ℃. The best carbon source was maltose， the best nitrogen source was yeast paste， the optimum pH was 7， the light dark alternation was beneficial to the mycelium growth and the mycelial lethal temperature was 45 ℃. The optimum temperature for conidia germination was 25 ℃， the optimum pH was 7， and the illumination condition was beneficial to conidial germination.

Key words： peanut（Arachis hypogaea Linn.）; peanut web blotch; Peyronellaea arachidicola; biological characteristics

花生（Arachis hypogaea Linn.）是重要的油料作物，其種植生產(chǎn)遍布全球100多個國家。中國是全世界重要的花生生產(chǎn)國，而遼寧省是國內重要的花生產(chǎn)區(qū)之一。遼寧省的花生素以品質好、黃曲霉毒素含量低著稱，是省內最主要的油料作物。近年來，由于種植花生的經(jīng)濟效益日漸凸顯，遼寧省的花生種植面積顯著增加，成為遼寧省種植的第三大主栽作物和第一大油料作物，2017年遼寧省花生種植面積近40萬hm2。隨著花生種植面積不斷擴大及部分主栽區(qū)常年連作，導致花生病害發(fā)生率連年上升[1]。其中花生網(wǎng)斑病是花生最為嚴重的葉部病害之一，可使花生減產(chǎn)10%～20%，病害發(fā)生嚴重時，重茬種植地塊可減產(chǎn)30%，經(jīng)濟損失大，嚴重制約了遼寧省花生產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展[2]。

1972年花生網(wǎng)斑病在美國德克薩斯州首次被發(fā)現(xiàn)[3]。1982年該病害在中國的山東、遼寧等省花生主產(chǎn)區(qū)被首次發(fā)現(xiàn)，陜西省、河南省也相繼發(fā)現(xiàn)了該病害。Marasas等[4]1974年研究南非發(fā)現(xiàn)的花生網(wǎng)斑病害時將花生網(wǎng)斑病的病原菌命名為花生莖點霉（Phoma arachidicola）。歷史上，花生網(wǎng)斑病病原菌的屬級分類地位相對混亂，至2010年，Aveskamp等[5]采用最新的分子生物學技術對莖點霉屬的系統(tǒng)發(fā)育進行分析，將原莖點霉屬下的派倫霉節(jié)升為派倫霉屬，并將花生網(wǎng)斑病病原菌歸到派倫霉屬，由此，花生網(wǎng)斑病病原菌被命名為花生派倫霉（Peyronellaea arachidicola）?；ㄉW(wǎng)斑病發(fā)病時，病原菌侵染葉片造成葉部病斑，嚴重影響葉片光合作用，隨著病斑擴大可導致花生葉片干枯脫落，在花生的花期、結莢期、成熟期均可發(fā)病[6]。針對遼寧省花生網(wǎng)斑病的研究主要集中在品種抗性、化學防治、流行規(guī)律等方面，而對病原菌鑒定及生物學特性研究缺乏系統(tǒng)的報道[7-15]。因此，本試驗從病原菌分離及生物學特性等方面進行系統(tǒng)研究，為遼寧省花生網(wǎng)斑病害綜合防治提供一定理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 花生網(wǎng)斑病病原菌分離

花生網(wǎng)斑病葉片采集于遼寧省農業(yè)科學院試驗基地，參照方中達[16]的方法進行病菌分離，即在典型病斑的病健交界處剪取5 mm×5 mm大小的病葉組織，用乙醇和氯化汞進行表面消毒，無菌水沖洗3次，滅菌濾紙吸干后接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 ℃。經(jīng)單孢分離后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 病原菌致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則，對已純化的菌株進行致病性測定。選取健康的花生葉片進行接種[17]。花生葉片用75%乙醇進行表面消毒，將單孢分離純化的菌株轉接到PDA平板上，25 ℃條件下培養(yǎng)10 d，制成5 mm菌餅接種于葉片上，以接種相同大小菌餅的PDA培養(yǎng)基作為對照。25 ℃保濕培養(yǎng)，每24 h觀察接種部位癥狀，每處理重復10次?；ㄉ~片發(fā)病時，再次從病健交界處分離病原物[18]。

1.3? 病原菌分子生物學鑒定

將純化的病原菌接種到液體培養(yǎng)基中，25 ℃條件下160 r/min振蕩培養(yǎng)10 d，離心收集菌絲體進行冷凍干燥，-40 ℃保存?zhèn)溆?。采用Aidlab真菌DNA快速提取試劑盒提取病原菌的基因組DNA，采用真菌rDNA ITS的通用引物ITS4、ITS5進行PCR擴增，引物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成。PCR反應條件：95 ℃預變性4 min;95 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，并將測序結果與GenBank中已知序列進行同源性比對[19-21]。

1.4? 病原菌生物學特性測定

①PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g（去皮）、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、無菌水1 000 mL，pH 7.0;②Czapek培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂20 g、無菌水1 000 mL，pH 7.0;③OA培養(yǎng)基：燕麥粉15 g、瓊脂10 g、無菌水1 000 mL，pH 7.0。

1.4.1? 溫度對病原菌生長的影響? 將純化好的菌株于PDA平板上培養(yǎng)5 d，用滅菌打孔器在菌落邊緣取5 mm的菌餅，將菌餅接種到PDA平板中央，分別置于5、10、15、20、23、25、28、30、35 ℃條件下恒溫培養(yǎng)[22]，每個處理3次重復。培養(yǎng)10 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.2? 不同碳、氮源對病原菌生長的影響? 以Czapek培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，用葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、甘露醇、淀粉、核糖代替其中的蔗糖，測定不同碳源對花生網(wǎng)斑病菌生長的影響;用蛋白胨、酵母膏、尿素、硝酸銨、甘氨酸、牛肉膏、硫酸銨代替硝酸鈉，測定不同氮源對花生網(wǎng)斑病菌生長的影響。用無菌的打孔器在活化菌落邊緣取5 mm的菌餅接種于含有不同碳、氮源的培養(yǎng)基上，23 ℃恒溫培養(yǎng)，每處理重復3次。培養(yǎng)10 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.3? pH對病原菌生長的影響? 用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液調節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH，制成pH為4、5、6、7、8、9、10的PDA培養(yǎng)基平板，將5 mm菌餅接種于平板中央，23 ℃恒溫培養(yǎng)，每處理重復3次。培養(yǎng)10 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.4? 光照對菌落生長的影響? 將5 mm菌餅接種于PDA平板中央，置于連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、12 h光照/12 h黑暗環(huán)境下25 ℃恒溫培養(yǎng)，每處理重復3次。培養(yǎng)10 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。

1.4.5? 菌絲致死溫度測定? 將5 mm菌餅置于裝有無菌水的2 mL離心管中，置于40、45、50、55、60、65 ℃的水浴鍋中，10 min后將菌餅取出，接種于PDA平板上，23 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，每處理重復3次，觀察病原菌生長情況。

1.4.6? 溫度對分生孢子萌發(fā)的影響? 將病原菌在OA平板上培養(yǎng)15 d，待其產(chǎn)生分生孢子器后，用無菌解剖刀刮取分生孢子器置于裝有適量無菌水的50 mL燒杯中，靜置20 min，使分生孢子器吸水脹破，釋放分生孢子，后用無菌水配制成濃度為105個孢子/mL懸浮液備用。采用凹載玻片孢子萌發(fā)法，將孢子懸浮液分別置于5、10、15、20、25、30、35、40 ℃條件下，每隔1 h鏡檢萌發(fā)情況，測定萌發(fā)率，每處理重復3次。

1.4.7? pH對分生孢子萌發(fā)的影響? 用1 mol/L HCl溶液和1 mol/L NaOH溶液將無菌水的pH調節(jié)成4、5、6、7、8、9、10共7個梯度，采用凹載玻片萌發(fā)法測定孢子萌發(fā)率，25 ℃條件下培養(yǎng)，每隔1 h鏡檢萌發(fā)情況，測定萌發(fā)率，每處理重復3次。

1.4.8? 光照對分生孢子萌發(fā)的影響? 采用凹載玻片孢子萌發(fā)法，將孢子懸浮液分別置于連續(xù)光照、連續(xù)黑暗、12 h光照/12 h黑暗環(huán)境下，每隔1 h鏡檢萌發(fā)情況，測定萌發(fā)率，每處理重復3次。

2? 結果與分析

2.1? 病癥與致病性

花生網(wǎng)斑病主要為害花生葉片，其次為害葉柄和莖部。常在花期染病，先侵染葉片，初期沿主脈產(chǎn)生圓形至不規(guī)則形的黑褐色小斑，病斑周圍有退綠暈圈，后期在葉片正面邊緣呈現(xiàn)網(wǎng)紋狀的不規(guī)則形褐色斑，且病部可見粟褐色小點，即病菌分生孢子器，不透過葉面。陰雨連綿時葉面病斑較大，近圓形（不規(guī)則），黑褐色;葉背病斑不明顯，淡褐色，重者病斑融合。病部可見粟褐色小點，即病菌分生孢子器，干燥條件下病斑易破裂穿孔。

將從病斑上（圖1a）分離純化的菌株接種于健康的花生葉片上，在接種部位均出現(xiàn)花生網(wǎng)斑病病斑（圖1b），對照植株不發(fā)病。從接種部位分離得到的菌株與接種菌株相同，因而分離所得菌株為花生網(wǎng)斑病病原菌。

2.2? 花生網(wǎng)斑病病原菌鑒定

花生網(wǎng)斑病病原菌菌絲體在PDA培養(yǎng)基上菌落呈白色至灰白色（圖2a），分生孢子無色，長橢圓形或啞鈴形，多雙胞，少數(shù)單胞，分生孢子大小為（12～20） μm×（3～4） μm（圖2b）。孢子殼黑色，近球形，埋生或半埋生于病組織中，大小為50～200 μm（圖2c）。

用ITS4&5對花生網(wǎng)斑病病原菌的ITS序列進行擴增，得到長度為569 bp的序列。經(jīng)過BLAST分析，與GenBank中的Perronellaea（KC802087、MK 267758、KR012905）同源性高達98%～99%。

2.3? 溫度對花生網(wǎng)斑病病原菌生長的影響

由圖3可知，花生網(wǎng)斑病病原菌菌絲在5～35 ℃均可生長，病原菌最適生長溫度為23 ℃，菌落平均直徑為53 mm，在23 ℃和25 ℃條件下病原菌的菌落平均直徑顯著高于其他溫度下菌落平均直徑。

2.4? 不同碳、氮源對花生網(wǎng)斑病病原菌菌落生長的影響

由圖4可知，花生網(wǎng)斑病病原菌生長最好的碳源為麥芽糖，病原菌在以葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、淀粉作為碳源的培養(yǎng)基中也能較好生長，生長較差的碳源為核糖。23 ℃條件下培養(yǎng)15 d，以麥芽糖為碳源的病原菌菌落平均直徑為33 mm，顯著高于以葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露醇、淀粉、核糖為碳源的菌落平均直徑，其中以核糖為碳源的病原菌菌落平均直徑最小，為16 mm。

由圖5可知，花生網(wǎng)斑病病原菌生長最好的氮源為酵母膏，病原菌在以蛋白胨、牛肉膏、甘氨酸作為氮源的培養(yǎng)基中也能較好生長，生長較差的氮源為硫酸銨。23 ℃條件下培養(yǎng)15 d，以酵母膏為氮源的病原菌菌落平均直徑為56 mm，以蛋白胨為氮源的病原菌菌落平均直徑為53 mm，顯著高于以硝酸鈉、尿素、硝酸銨、甘氨酸、牛肉膏、硫酸銨為氮源的菌落平均直徑，其中以硫酸銨為氮源的病原菌菌落平均直徑最小，為21 mm。

2.5? pH對花生網(wǎng)斑病病原菌菌落生長的影響

由圖6可知，花生網(wǎng)斑病病原菌對酸堿度的適應范圍廣泛，在pH 4～10均可生長，pH為7時最適宜病原菌生長，菌落平均直徑為54 mm，pH為6、7、8時病原菌的菌落平均直徑顯著高于其他pH的菌落平均直徑。

2.6? 光照對花生網(wǎng)斑病病原菌菌落生長的影響

由圖7可知，在光暗交替條件下，花生網(wǎng)斑病病原菌菌落的生長速度最快，25 ℃條件下培養(yǎng)8 d，菌落平均直徑為42 mm;全光照條件下菌落平均直徑為40 mm，與光暗交替條件下差異不顯著;全黑暗條件下菌落平均直徑為36 mm，顯著低于光暗交替和全光照條件下的菌落平均直徑。

2.7? 花生網(wǎng)斑病病原菌菌絲致死溫度

花生網(wǎng)斑病病原菌菌絲在40 ℃水浴處理10 min后能在PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)生長，在45～65 ℃條件下水浴處理10 min后無法繼續(xù)生長。在40、41、42、43、44、45 ℃ 6個溫度梯度下，水浴處理10 min后，40～44 ℃條件下處理的菌絲均能在培養(yǎng)基上繼續(xù)生長。因此，確定花生網(wǎng)斑病病原菌菌絲的致死溫度為45 ℃。

2.8? 溫度對花生網(wǎng)斑病病原菌分生孢子萌發(fā)的影響

在5、10、15、20、25、30、35、40 ℃條件下，花生網(wǎng)斑病病原菌孢子的萌發(fā)率分別為0、12.67%、65.00%、76.00%、91.67%、83.33%、49.33%、0。

2.9? pH對花生網(wǎng)斑病病原菌分生孢子萌發(fā)的影響

花生網(wǎng)斑病病原菌分生孢子在pH為4、5、6、7、8、9、10時萌發(fā)率分別為30.67%、55.33%、75.00%、89.00%、70.67%、61.00%、22.00%。孢子萌發(fā)最適pH為7。

2.10? 光照對花生網(wǎng)斑病病原菌分生孢子萌發(fā)的影響

花生網(wǎng)斑病病原菌孢子在24 h光照、12 h光暗交替、24 h黑暗條件下萌發(fā)率分別為86%、81%、67%。24 h光照條件下孢子萌發(fā)率最高，即光照對孢子萌發(fā)有一定的促進作用。

3? 小結與討論

ITS鑒定結果表明，實驗室分離純化的菌種為花生網(wǎng)斑病原菌。研究表明，花生網(wǎng)斑病菌菌絲在5～35 ℃條件下均可生長，最適生長溫度為23 ℃。pH為4～10條件下菌絲均可生長，最適pH為7，最佳碳源為麥芽糖，最佳氮源為酵母膏，光照有利于菌絲生長。菌絲的致死溫度為45 ℃。分生孢子在5～35 ℃條件下，pH在4～10的條件下均能萌發(fā)。分生孢子萌發(fā)的最適溫度是25 ℃，最適pH為7，光照有利于分生孢子的萌發(fā)。遼寧省花生網(wǎng)斑病病原菌菌絲的生物學特性與許欣然等[14]針對河南省花生網(wǎng)斑病原菌的研究基本一致，在其研究基礎上明確了分生孢子萌發(fā)的最適條件，并且在新的分類系統(tǒng)下對病原菌的ITS序列進行了分析。遼寧省花生網(wǎng)斑病發(fā)病高峰期為每年8月中旬至9月中旬，在花生收獲前期發(fā)病尤為嚴重，而病原菌菌絲生長的最適溫度是23 ℃，分生孢子萌發(fā)的最適溫度是25 ℃，溫度過高或過低都不利于菌絲生長及分生孢子的萌發(fā)，這與花生網(wǎng)斑病發(fā)病高峰期的溫度一致。

近年來，針對該病害的研究主要集中在化學防治、流行規(guī)律及病原菌致病性差異等方面。朱茂山等[23]、呂賓等[24]對病原菌的化學防治進行了研究，明確了常用殺菌劑對該病害的室內毒力活性及田間防治效果。李紹建等[25]對該病原菌的致病力差異進行了研究，明確了不同病斑類型及其病原菌的致病力差異。Pettit等[26]、Smith等[27]明確了網(wǎng)斑病的越冬形式、初侵染來源和傳播途徑。周如軍等[28，29]、崔建潮等[30]對遼寧省花生葉斑病流行時間動態(tài)、混合侵染、產(chǎn)量損失、品種抗性鑒定等方面開展了研究?；ㄉ谶|寧省的種植面積連年上升，然而針對花生網(wǎng)斑病的防治并不規(guī)范，田間用藥主要以化學農藥為主，長期單一使用化學農藥致使病原菌產(chǎn)生抗性的風險顯著提高，給花生網(wǎng)斑病的有效防治帶來較大困難，同時也造成嚴重的環(huán)境污染問題，了解花生網(wǎng)斑病病原菌的生物學特性為下一步該病害的生物防治提供一定理論依據(jù)，同時為該病害的科學治理提供策略。

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收稿日期：2019-03-21

基金項目：農業(yè)部東北作物有害生物綜合治理重點實驗室開放基金項目（DB2018-6）

作者簡介：謝瑾卉（1987-），女，遼寧沈陽人，助理研究員，碩士，主要從事植物病害及生物防治工作，（電話）13464002199（電子信箱）

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