RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定金匱腎氣片中黃芩苷和丹皮酚的含量

付恩桃，劉修樹(shù)，李會(huì)婷，范高福，胥振國(guó)，方麗波

(1.合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物應(yīng)用技術(shù)系，安徽 合肥 238000；2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué) 附屬第一醫(yī)院，安徽 合肥 230036)

金匱腎氣片是用于治療腎虛水腫，腰膝酸軟，小便不利，畏寒肢冷等癥狀的中成藥，由地黃、酒萸肉、山藥、牡丹皮、桂枝等10味中藥材組成[1-2]，具有溫補(bǔ)腎陽(yáng)、化氣行水的功效。金匱腎氣片中的成分復(fù)雜，其質(zhì)量控制難度較大，目前執(zhí)行的是國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)(WS-10439(ZD-0439)-2002-2011Z)，標(biāo)準(zhǔn)中也缺少相關(guān)成分的定量分析。通過(guò)查閱文獻(xiàn)資料發(fā)現(xiàn)，對(duì)于金匱腎氣片進(jìn)行質(zhì)量控制的文獻(xiàn)報(bào)道很少，且已報(bào)道的文獻(xiàn)中僅通過(guò)測(cè)定其中一味中藥材中的指標(biāo)性成分的含量來(lái)控制其質(zhì)量。如采用HPLC法測(cè)定金匱腎氣片中丹皮酚的含量，且分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，樣品前處理較為復(fù)雜，不利于金匱腎氣片的質(zhì)量控制[3-8]。本文采用HPLC等度洗脫法同時(shí)測(cè)定金匱腎氣片片中黃芩苷、丹皮酚兩種指標(biāo)性成分的含量，操作簡(jiǎn)便，能夠更加快速、準(zhǔn)確、全面的控制金匱腎氣片的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

島津LC-20A高效液相色譜儀，SHIMADZU C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，MS205DU十萬(wàn)分之一分析天平(梅特勒-托利多公司)，寧波新芝SB-5200D超聲波清洗器(功率300W，50kHZ)。對(duì)照品：黃芩苷(批號(hào)110715-201318，含量93.3%)、丹皮酚(批號(hào)110708-201407，含量99.9%)均于中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)買。水為純化水，甲醇為色譜純，磷酸為分析純，金匱腎氣片(特一藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，規(guī)格：每片重0.27 g)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用SHIMADZU C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，甲醇-0.1%磷酸水溶液(52：48)為流動(dòng)相，等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μl，理論塔板數(shù)按黃芩苷和丹皮酚峰計(jì)算分別為6904和16764，均不低于3000；分離度分別為7.436和2.533，均大于1.5，分離度符合要求。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液

精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品(黃芩苷10.40 mg、丹皮酚10.80 mg)，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得對(duì)照品母液。精密吸取黃芩苷母液0.5 mL，丹皮酚母液1.0 mL置同一10 mL量瓶中，并用流動(dòng)相稀釋定容至刻度，充分振搖均勻，即得。

2.2.2 供試品溶液

圖1 金匱腎氣片液相色譜圖A：對(duì)照品溶液 B：供試品溶液 C：陰性對(duì)照溶液 1.黃芩苷 2.丹皮酚

取金匱腎氣片20片，除去薄膜衣，充分研細(xì)，精密稱取細(xì)粉1 g，放置于具塞錐形瓶中，然后精密量取50%的甲醇溶液100 mL，立即稱定其重量后用功率為300 W超聲儀超聲提取40 min，放冷至室溫，再稱定其重量，用50%的甲醇補(bǔ)足減失的重量，充分搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。取處方中除牡丹皮和地黃外的各藥材，制備陰性對(duì)照溶液，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)干擾。對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照色譜圖見(jiàn)圖1。

2.3 方法學(xué)試驗(yàn)

2.3.1 線性關(guān)系考察

精密吸取上述混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，充分搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液；分別取上述系列溶液20 μL，按照確定的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將各自溶液濃度C(μg/mL)作為橫坐標(biāo)，黃芩苷和丹皮酚的峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算得到回歸方程。黃芩苷：A=95346C-4031.2(r=0.9998)；丹皮酚：A=131660C-18051(r=0.9999)，線性范圍分別為：黃芩苷0.485～19.406 μg/mL，丹皮酚1.079～43.157 μg/mL。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

在“2.1”色譜條件下，取混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算黃芩苷和丹皮酚峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，分別為0.61%、1.31%，試驗(yàn)結(jié)果表明精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取金匱腎氣片樣品(批號(hào)1181203)，在“2.2.3”方法下，平行制得6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄黃芩苷和丹皮酚的峰面積，測(cè)得黃芩苷和丹皮酚的平均含量分別為0.427 mg/g、1.431 mg/g，RSD分別為0.30%、0.44%。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，于室溫下放置，并在放置0、2、4、6、8、12 h后，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算黃芩苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為1.27%、0.55%，試驗(yàn)結(jié)果表明供試品溶液在配制后12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)

取含量已知的金匱腎氣片樣品(批號(hào)1181203)9份，每份約0.5 g，分成低、中、高三組，分別加入黃芩苷對(duì)照品母液0.4、0.5、0.6 mL，丹皮酚對(duì)照品母液0.6、0.7、0.8 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.4 樣品含量測(cè)定

取金匱腎氣片3批樣品，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算，得到樣品中黃芩苷和丹皮酚的含量，結(jié)果如下表。

表2 金匱腎氣片中黃芩苷和丹皮酚的含量(mg/片)

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取適宜濃度的黃芩苷和丹皮酚對(duì)照品溶液，分別在200～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃芩苷的最大吸收波長(zhǎng)為280 nm，丹皮酚的最大吸收波長(zhǎng)為274 nm，由于本試驗(yàn)是同時(shí)測(cè)定這兩種成分的含量，因此選擇278 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)，依據(jù)吸收曲線和試驗(yàn)結(jié)果，黃芩苷和丹皮酚在此波長(zhǎng)下都有很好的吸收。

3.2 流動(dòng)相選擇

本試驗(yàn)在參照《中國(guó)藥典》(2015版)第一部中關(guān)于黃芩和牡丹皮兩味藥材含量測(cè)定的基礎(chǔ)上，先后考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙睛-水以及不同濃度的甲醇-磷酸水、乙睛-磷酸水等流動(dòng)相體系，同時(shí)查閱了關(guān)于丹皮酚和黃芩苷這兩種成分含量測(cè)定的相關(guān)中英文文獻(xiàn)，絕大多數(shù)采用梯度洗脫，樣品分析時(shí)間較長(zhǎng)，通過(guò)色譜條件優(yōu)化，最終選用甲醇-0.1%磷酸水溶液(52∶48)作為流動(dòng)相，等度洗脫，大大的提高了樣品分析的效率。加入0.1%磷酸，改善了色譜峰的峰形，且樣品中待測(cè)組分與雜質(zhì)完全分離。

3.3 提取時(shí)間

本實(shí)驗(yàn)采取超聲方法提取金匱腎氣片樣品中的待測(cè)組分，同時(shí)比較了超聲時(shí)間對(duì)提取結(jié)果的影響，結(jié)果超聲20 min的樣品中黃芩苷和丹皮酚的提取不夠充分，超聲40 min與60 min的提取效果一致，因此最終將金匱腎氣片樣品的提取時(shí)間確定為40 min。同時(shí)，本試驗(yàn)所用超聲功率為300 W，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超聲儀功率偏小也會(huì)影響提取效果。

4 結(jié)論

金匱腎氣片的藥品標(biāo)準(zhǔn)收載于國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)(WS-10439(ZD-0439)-2002-2011Z)，但標(biāo)準(zhǔn)中僅僅收載薄層色譜法控制茱萸中熊果酸的含量，且單一指標(biāo)成分的測(cè)定難以全面控制藥品的質(zhì)量，本次試驗(yàn)首次建立了快速同時(shí)測(cè)定金匱腎氣片中黃芩苷和丹皮酚的含量，并采用流動(dòng)相甲醇-0.1%磷酸水溶液等度洗脫的方法，該方法線性良好，精密度、準(zhǔn)確度、穩(wěn)定性、回收率符合要求。