基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的威靈仙抗結(jié)直腸癌分子機(jī)制研究

李 萍，周若瑜，闕月月，程 陽，何寶佳，章圣朋

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院；2.安徽省多糖藥物工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖 241002)

威靈仙來源于毛茛科植物臨床上常用于治療風(fēng)濕痹痛、肢體麻木、骨鯁、筋脈拘攣以及屈伸不利等癥[1]。近年來研究顯示，威靈仙還在抗腫瘤以及降血壓、降血糖等方面發(fā)揮廣泛的治療與預(yù)防作用[2-3]。由于中藥成分復(fù)雜，很難明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。利用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方法研究中藥作用機(jī)制，已成為中藥作用機(jī)制的探索和新藥研發(fā)的新手段[4-5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)等多學(xué)科理論，利益網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)行“疾病-藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”多層次網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，從多維度多視角探索疾病與藥物之間的關(guān)聯(lián)，特別適用于中藥藥效機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)研究[6-8]。本研究以威靈仙為對象，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，闡釋威靈仙抗結(jié)直腸癌藥效的作用機(jī)制，為其治療結(jié)直腸癌作用機(jī)制的深入研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 活性成分篩選

利用計(jì)算系統(tǒng)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)平臺(TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，搜索威靈仙拼音weilingxian，選擇對應(yīng)拉丁名RadixClematidis，找到所含化學(xué)成分后，通過設(shè)定篩選條件口服生物利用度(oralbioavailability，OB)≥30%以及類藥性(drug-like，DL)≥0.18篩選出威靈仙的活性成分。使用pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)查找化合物結(jié)構(gòu)及分子式。

1.2 藥物和疾病靶點(diǎn)篩選

利用TCMSP搜索威靈仙相關(guān)靶基因，使用篩選到的活性成分進(jìn)行過濾，去除重復(fù)基因后獲得威靈仙活性成分相關(guān)靶基因并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：//sparql.uniprot.org/)獲得基因名。GeneCards數(shù)據(jù)庫(https：//www.genecards.org/)，以“Colorectal cancer”為檢索關(guān)鍵詞，收集與結(jié)直腸癌相關(guān)基因，將挖掘得到的結(jié)直腸癌相關(guān)基因與藥物靶點(diǎn)基因映射篩選出共同靶點(diǎn)，從而得到威靈仙抗結(jié)直腸癌的作用基因靶點(diǎn)。

1.3 活性成分-癌癥靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建與分析

將威靈仙的活性成分和結(jié)直腸癌交集靶點(diǎn)等相關(guān)信息導(dǎo)入Cytoscape Version 3.7.1軟件，構(gòu)建結(jié)直腸癌-威靈仙-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心基因的獲得

將獲得的威靈仙和結(jié)直腸癌的蛋白靶點(diǎn)交集導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)，限定物種為人，獲得取蛋白相互作用關(guān)系，根據(jù)節(jié)點(diǎn)連接數(shù)目繪制柱狀圖，獲得核心基因。

1.5 GO富集分析和KEGG富集分析

找到基因?qū)?yīng)的ID，物種選擇人，Bioconductor數(shù)據(jù)庫(http：//www.bioconductor.org/)獲取GO注釋信息，使用R包c(diǎn)lusterProfiler，進(jìn)行GO功能富集分析，選擇20個GO進(jìn)行可視化并生成柱狀圖，進(jìn)行KEGG分析生成氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 威靈仙潛在活性化學(xué)成分篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索總共檢索到57種化合物。以O(shè)B≥30%、DL≥0.1作為化合物篩選條件。共篩選得到7個化合物作為潛在活性化合物(見表1)，占所有57種化合物的12.28%。7種潛在活性化合物中有4種無對應(yīng)靶基因，去除無對應(yīng)靶基因后獲得的活性化合物為β-谷固醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、鄰苯二甲酸二庚酯(Heptyl phthalate)，使用pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找相關(guān)的2D結(jié)構(gòu)式與分子式信息(見圖1)。

表1 威靈仙潛在活性化合物

圖1 三種活性化合物2D結(jié)構(gòu)式與分子式FIG.1 2D structural formulae and molecular formulae of the three active compounds

2.2 化合物基因取交集

圖2 結(jié)直腸癌-威靈仙靶點(diǎn)交集圖Fig.2 Network diagram of Radix climatidisand colorectal cancer

使用GenCards檢索結(jié)直腸癌相關(guān)基因，共收集到7469種基因。TCMSP搜索威靈仙對應(yīng)靶基因，共收集到310個基因，7種潛在活性化合物中有4種無對應(yīng)靶基因，收集的3種潛在活性化合物：β-谷固醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(Stigmasterol)、鄰苯二甲酸二庚酯(Heptyl phthalate)篩選到的潛在威靈仙抗結(jié)直腸癌活性化合物對應(yīng)基因40種。對3種潛在活性化合物對應(yīng)的靶基因和結(jié)直腸癌對應(yīng)的靶基因取交集，獲得30種既與威靈仙潛在活性化合物相關(guān)又與結(jié)直腸癌相關(guān)的基因(見圖1)。

2.3 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

基因注釋后，運(yùn)用Cytoscape 3.1.1軟件構(gòu)建威靈仙活性疾病-藥物-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，如圖3所示，紅色的代表疾病，藍(lán)色代表藥物，紫色代表潛在活性化合物，綠色代表靶點(diǎn)基因。

圖3 結(jié)直腸癌-威靈仙-威靈仙化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖疾病()藥物()化合物()靶基因()Fig.2 Target network diagram of compound of Radix climatidisdisease()drug()compounds()Target genes()

2.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建及其核心靶點(diǎn)的篩選

為了進(jìn)一步了解威靈仙靶點(diǎn)和結(jié)直腸癌靶點(diǎn)在蛋白水平上的作用機(jī)制，本研究將篩選到的30個交集靶點(diǎn)基因粘貼到在線網(wǎng)站STRING(http：//string-db.org/

cgi/input.pl)，物種選擇人，并去除游離的靶蛋白，獲取蛋白相互作用的關(guān)系(見圖4)。在PPI網(wǎng)絡(luò)，靶點(diǎn)的連線越多則表示靶點(diǎn)越重要，通過計(jì)數(shù)每個靶點(diǎn)和其他靶點(diǎn)的連線數(shù)目，連線≥5條的基因有18種，其中Casp3和JUN的連線最多，達(dá)到了10條(見圖5)。

圖4 威靈仙與結(jié)直腸癌蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Core network(PPICN)diagram of Radix climatidis and colorectal cancer

圖5 威靈仙抗結(jié)直腸癌核心靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間連線數(shù)Fig.5 Core target of Radix Clematidis anti-colorectal cancer

2.5 GO富集分析結(jié)果

將威靈仙與結(jié)直腸癌交集靶基因進(jìn)行GO富集分析得到GO條目55個，根據(jù)P值選擇富集高的20個生成柱狀圖(見圖5)，圖中的GO注釋基本都與生物過程(biological process，BP)相關(guān)，如陰離子：陽離子同向轉(zhuǎn)運(yùn)活動(anion：cationsymporter activity)、配體依賴的核受體結(jié)合(ligand-dependent nuclear receptor binding)、神經(jīng)遞質(zhì)：鈉同向轉(zhuǎn)運(yùn)活動(neurotransmitter：sodium symporter activity)、氯跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性(chloride transmembrane transporter activity)等。

圖6 威靈仙治療結(jié)直腸癌關(guān)鍵靶蛋白的生物學(xué)功能注釋Fig.6 Annotation of biological function of Radix Clematidis anti-colorectal cancer key target protein

2.6 KEGG通路富集分析結(jié)果

將威靈仙與結(jié)直腸癌交集靶基因進(jìn)行KEGG分析，關(guān)鍵靶基因富集在61條通路上。根據(jù)P值由小到大排序選擇前20條生成氣泡圖。圓點(diǎn)越大，富集基因數(shù)目越多；P值越小，圓點(diǎn)顏色越紅。主要通路包括復(fù)合型凋亡通路(Apoptosis-multiple species)、凋亡通路(Apoptosis)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、結(jié)直腸癌信號通路(Colorectal cancer)等相關(guān)通路(見圖7)。提示威靈仙可以通過以上多條通路作用于結(jié)直腸癌。

圖7 威靈仙治療結(jié)直腸癌KEGG通路富集分析Fig.7 Main KEGG pathways related to Radix Clematidis anti-colorectal cancer

3 討論

伴隨著環(huán)境變化、飲食結(jié)構(gòu)的改變和社會人口老齡化程度增加，直腸癌發(fā)病率呈上升趨勢[9-11]，已居消化道惡性腫瘤的第2位[12]。直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)，臨床預(yù)后普遍較差，已成為中老年人死亡的主要病因之一[13]。目前治療結(jié)直腸癌的核心手段仍然是手術(shù)切除，但存在費(fèi)用高、禁忌證多等問題[14]。中藥可有效改善結(jié)直腸癌進(jìn)程，存在著廣闊的應(yīng)用前景[15]。威靈仙是臨床上的常用藥物，《抗癌治驗(yàn)本草》言其能敗毒抗癌?，F(xiàn)代藥理研究也證明，威靈仙可抑制消化系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞增殖，從東北鐵線蓮分離的三萜皂苷mandshunosides A-B以及mandshunosides C-E可抑制2種結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116和HT-29活性[16-17]，但因該數(shù)據(jù)未被TCMSP收錄，可能結(jié)果尚存在爭議，因此未納入分析。

通過構(gòu)建“結(jié)直腸癌-威靈仙-威靈仙化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖”，以及生物信息挖掘，分析了威靈仙抗結(jié)直腸癌的活性成分、潛在作用靶點(diǎn)及其分子機(jī)制，結(jié)果顯示威靈仙中甾醇類(豆甾醇、β-谷固醇)及鄰苯二甲酸酯類(鄰苯二甲酸二庚酯)等化合物顯示出了潛在的抗結(jié)直腸癌活性。前期研究發(fā)現(xiàn)這豆甾醇、β-谷固醇確實(shí)具有較好的抗腫瘤作用[18，19]，鄰苯二甲酸二庚酯雖未有報道但本研究顯示其很大可能是潛在的抗腫瘤物質(zhì)。CASP3、JUN、ADRA1B、MAOA等是威靈仙抗結(jié)腸癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)，其中大部分成分都直接作用在CASP3、JUN 2個靶點(diǎn)上而發(fā)揮抗結(jié)腸癌作用。CASP3是細(xì)胞外源性死亡受體凋亡通路關(guān)鍵執(zhí)行蛋白，大量的研究證實(shí)CASP3是一切凋亡信號傳導(dǎo)的共同通路，其活化最終引起細(xì)胞凋亡[20]。凋亡的調(diào)控基因很重要的家族是CASP3超家族，CASP3在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[21-23]。JUN蛋白家族以二聚體形式結(jié)合形成激活子蛋白-1(activator protion，AP-1)。JUN作為AP-1的主要組成成分，通過調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖。有研究顯示在結(jié)直腸癌組織樣本中JUN蛋白在其細(xì)胞胞漿和細(xì)胞胞核的表達(dá)均呈現(xiàn)顯著增高[24-25]。c-Jun基因的顯性失活突變體(TAM67)可以通過抑制內(nèi)源性AP-1的活性導(dǎo)致細(xì)胞G1間期停滯。將攜帶此突變體的結(jié)直腸癌細(xì)胞移植入裸鼠可顯著減小裸鼠荷瘤體積[26]。這些研究均表明JUN蛋白在結(jié)直腸腫瘤形成過程中扮演了重要角色。

本研究對威靈仙抗結(jié)直腸癌的潛在通路進(jìn)行了KEGG通路分析，篩選出的相關(guān)度最高的20條相關(guān)通路中Apoptosis信號通路和p53信號通路尤為引入注目。Apoptosis信號通路包括外源性途徑和內(nèi)源性途徑。在外源性途徑中，TRAIL與DR5或DR4結(jié)合導(dǎo)致受體三聚化，誘導(dǎo)procaspase-8自裂解，釋放caspase-8，激活下游的caspase-3、caspase-6和caspase-7，最終使細(xì)胞凋亡。內(nèi)源性途徑又被稱為線粒體凋亡途徑，細(xì)胞膜電位的改變促使細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，繼而與凋亡相關(guān)因子-1(apaf-1)結(jié)合，形成多聚體，并促使procaspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體。procaspase-9活化，導(dǎo)致caspase-3的活化最終引起凋亡[22]。p53信號通路參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在致癌化合物、輻射等致病因素刺激下，經(jīng)過一系列的磷酸化和翻譯后修飾，p53被激活，參與細(xì)胞凋亡，DNA修復(fù)和細(xì)胞周期阻滯的p53靶基因表達(dá)[28]。p53能夠通過促進(jìn)DNA修復(fù)，推進(jìn)細(xì)胞程序死亡，從而阻止癌癥的發(fā)生進(jìn)展[29]。中藥中的一些成分如大黃素可通過誘導(dǎo)ROS，觸發(fā)p53介導(dǎo)的HCT-116細(xì)胞發(fā)生線粒體凋亡途徑[30]，而在人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-8中，抑制p53的表達(dá)最終可導(dǎo)致結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展[31]。

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析后，篩選出了威靈仙抗結(jié)直腸癌可能的潛在化合物和靶點(diǎn)，這些潛在化合物可能是通過Apoptosis、p53信號通路調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和凋亡而發(fā)揮作用。