白及多糖響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝及抑菌活性研究

何曉梅，申 男，朱富成，喬德亮，張珍林，楊 靜

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 六安 237012；3.安徽省中藥資源保護(hù)與持續(xù)利用工程實(shí)驗(yàn)室，安徽 六安 237012)

白及Bletilla striataRchb.f.為蘭科白及屬的多年生草本植物[1]，也稱“白芨”，以干燥塊莖入藥。我國白及主要分布在秦嶺、淮河以南大部分地區(qū)[2]。白及主治功效包括補(bǔ)肺，止血，消腫，生肌，斂瘡[3]。

現(xiàn)代藥理研究表明白及塊莖中含有40%～50%天然水溶性的白及多糖，是白及的主要功效成分。白及多糖具有收斂、延緩皮膚衰老、增稠、助懸、保濕和助乳化等功效，是一種理想的天然日化添加劑和功能性成分；在藥理方面，白及多糖具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力[4]等特點(diǎn)。本文以白及干燥塊莖為實(shí)驗(yàn)材料，通過單因素和響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)確定白及多糖提取最佳條件，采用濾紙片-抑菌圈法研究其抑菌活性。

1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌種：金黃色葡萄球菌(Staphyloccus aureus)，大腸桿菌(Escherichia coli)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，黑曲霉(Aspergillu nigers)由皖西學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

白及粉，采用兩年生干燥白及塊莖置于粉碎機(jī)粉碎，過120目篩。無水乙醇、蒽酮、硫酸、胰蛋白胨、瓊脂等，以上試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 設(shè)備

高速組織搗碎機(jī)(上海凈信實(shí)驗(yàn)設(shè)備科技部)、ZMD-2型電子分析天平、HH-4C型數(shù)顯恒溫水浴鍋、RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、TU1901型紫外分光光度計(jì)、SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水真空泵、LDZX-50KBS型高壓蒸汽滅菌鍋、DHG-9101-1型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、SW-CJ-IBU型超凈工作臺(tái)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

精密稱取2.0000 g白及粉末，按照一定的提取時(shí)間、提取溫度、液料比進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，水浴浸提，取出，離心(4000rpm，15 min)，收集上清液，用0.2%蒽酮-硫酸法測定多糖含量[5]。根據(jù)文獻(xiàn)[6]醇沉、離心、干燥制備白及粗多糖。

2.2 響應(yīng)曲面確定最佳提取條件

采用Box-Behnken試驗(yàn)方法對(duì)A提取時(shí)間(h)、B提取溫度(℃)、C液料比(mL/g)進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)[7]，試驗(yàn)條件見表1。

表1 3因素3水平實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0.6軟件分析。

2.3 白及多糖抑菌活性測定

參照文獻(xiàn)[8-10]，菌種活化成功后，接種環(huán)刮取菌落于無菌水中梯度稀釋成菌懸液OD600nm≈0.8，吸取0.5mL菌懸液，涂布平板。用鑷子取出在白及多糖溶液(40 mg/mL、20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL)和無菌水中浸沒2h的濾紙圓片(直徑9 mm)，均勻平貼于培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)平行培養(yǎng)基。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌置于37±1℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，黑曲霉菌于28±1℃恒溫箱中培養(yǎng)48h。結(jié)果采用十字交叉法測定濾紙片的抑菌圈直徑大小，多次測量取平均值。

2.4 數(shù)據(jù)處理方法

3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理分析

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 浸提次數(shù)對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction times on polysaccharideyield(浸提條件：水提時(shí)間2 h 、水提溫度70℃、液料比40∶1)

圖2 水提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of waterextraction time on polysaccharide yield

圖3 水提溫度對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of waterextraction temperature on polysaccharide yield

圖4 液料比對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of liquid-solidratio on polysaccharide yield

由圖1～4可知，實(shí)驗(yàn)采用一次浸提；在液料比為35：1 mL/g，水浴溫度為70℃的條件下，多糖得率隨著水浴時(shí)間的增加而增加；在水浴時(shí)間2h，液料比為35：1 mL/g的條件下，多糖得率在50℃～70℃的條件下緩慢升高，在80℃～90℃的條件下多糖得率下降；在水浴時(shí)間為2 h，水浴溫度為70℃的條件下，多糖得率隨著液料比的增加而增加，但是在35：1 mL/g～40：1 mL/g時(shí)，多糖得率有所下降。

3.2 響應(yīng)曲面確定最佳提取條件

表2 多糖提取工藝響應(yīng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

由表2可知，以A提取時(shí)間(h)、B提取溫度(℃)、C液料比(mL/g)為自變量，Y(多糖得率)為響應(yīng)值，得出Y對(duì)3因子的擬合回歸方程為：

Y=26.86+3.83A-0.22B+1.77C+0.54AB+0.87AC+0.19BC-4.52A2+1.28B2+2C2

表3 回歸方程模型系數(shù)評(píng)估及其顯著性檢驗(yàn)

分析水提溫度(A)、水提時(shí)間(B)和液料比(C)3因子兩兩交互作用對(duì)水浴提取白及多糖得率的影響，P=0.0039<0.0500表示模型項(xiàng)顯著，實(shí)驗(yàn)具有可靠性。

圖5 Y=F(A，B)的響應(yīng)曲面圖與等值線圖Fig.5 Response surface diagram and contour map of Y=F(A，B)

圖6 Y=F(A，C)的響應(yīng)曲面圖與等值線圖Fig.6 Response surface diagram and contour map of Y=F(A，C)

圖7 Y=F(B，C )的響應(yīng)曲面圖與等值線圖Fig.7 Response surface diagram and contour map of Y=F(B，C)

由統(tǒng)計(jì)性分析及響應(yīng)面圖可知，3因子對(duì)白及多糖得率的影響程度大小排序：水提溫度(A)>液料比(C)>水提時(shí)間(B)。通過軟件分析得出最佳提取條件：水提溫度77℃、水提時(shí)間2.2h、液料比39.27 mL/g時(shí)，軟件預(yù)測白及多糖得率為31.09%，在上述條件下進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，白及多糖得率為30.44%、31.81%、31.54%，平均31.26%，結(jié)果可信。

3.3 白及多糖的抑菌效果

表4 抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4表明，白及多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、黑曲霉菌均有不同程度的抑制作用，隨著白及多糖濃度的增加這種抑制作用呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，白及多糖對(duì)細(xì)菌的抑制作用強(qiáng)于真菌。

4 結(jié)論

單因素和響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)表明白及多糖提取的最佳條件為：水提次數(shù)1次、水提溫度77℃、水提時(shí)間2.2 h、液料比39.27 mL/g，白及多糖得率31.09%。抑菌實(shí)驗(yàn)表明白及多糖能有效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及黑曲霉菌，并隨著白及多糖濃度的增加抑制效果增強(qiáng)，白及多糖對(duì)細(xì)菌的抑制作用強(qiáng)于真菌。