金鷺,陳傳君,林華,胡濱*,韓國全*,陳世界,張婧,安微,楊苗
1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,四川 雅安,625000)2(成都海關(guān),四川 成都,61000)3(食品安全檢測(cè)四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都,61000)
目前肉類摻假問題頻繁發(fā)生,使得肉類食品的安全狀況令人擔(dān)憂[1]。羊肉作為我國傳統(tǒng)肉食品,富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、肉質(zhì)鮮美,需求量逐年增加。巨大的羊肉消費(fèi)市場(chǎng),高昂的價(jià)格給羊肉摻假帶來了豐厚利潤空間。一些不法商家在利益驅(qū)使下用低價(jià)肉(如馬肉、豬肉、鴨肉等)摻入冒充羊肉,這不僅損害了消費(fèi)者的切身利益,更直接影響消費(fèi)者的健康甚至?xí)婕白诮绦叛龅葐栴}(如在羊肉中摻入豬肉)[2]。因此,為防止羊肉銷售市場(chǎng)上造假行為發(fā)生,對(duì)羊肉的真?zhèn)舞b定具有重要意義。
動(dòng)物品種的鑒定主要是從蛋白質(zhì)(如等電聚焦電泳、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等)和核酸(DNA分子雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等)兩個(gè)方面進(jìn)行。蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)在生鮮肉類的品種鑒別方面應(yīng)用較為成功,但當(dāng)肉類經(jīng)過烹調(diào)加工后會(huì)使肉蛋白質(zhì)變性,導(dǎo)致蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)的可靠性較差[3]。而核酸具有比蛋白質(zhì)更高的熱穩(wěn)定性,基因可以從組織中提取,以物種間基因差異為基礎(chǔ)的分子學(xué)鑒定方法成為研究熱點(diǎn)[4]。DNA分子雜交法程序復(fù)雜,成本昂貴,而且對(duì)于近緣物種并不能很好分辨。EBBEHOJ等[5]通過添加未標(biāo)記雜交物種的DNA,可以減少近緣物種探針和DNA序列之間的雜交,但對(duì)密切相關(guān)物種如綿羊和山羊之間的分化檢測(cè)限僅約為10%,應(yīng)用相對(duì)有限。從TARTAGLIA等[6]首先報(bào)道了將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)技術(shù)用于檢測(cè)飼料中的牛源性成分至今,PCR技術(shù)經(jīng)過不斷發(fā)展與完善,已從只能單一擴(kuò)增檢測(cè),發(fā)展到包括實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,rPCR)、多重PCR、微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)等多種PCR技術(shù)的檢測(cè)分析,其中rPCR具有較高靈敏性和特異性,已成為肉制品種屬鑒別的常用方法[7]。目前現(xiàn)有國家、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)頒布的動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法,均是基于PCR擴(kuò)增的定性篩選,即只能判定樣品中是否含有某種動(dòng)物源DNA成分,結(jié)果以陰性或陽性表示,但無法進(jìn)行精確定量,這也給政府監(jiān)管部門的打假執(zhí)法帶來一定困難[8]。rPCR在羊肉及其制品中動(dòng)物源性成分的摻假檢測(cè)已有一定研究,主要是針對(duì)特定的摻假動(dòng)物成分,如檢測(cè)羊肉中豬肉、雞肉、鴨肉、鼠肉等的含量[9]。但對(duì)于可能混雜多種其他肉類或尚不明確摻入何種涉假肉類情況下,如果逐個(gè)篩查每一種摻假動(dòng)物性成分,不僅耗時(shí)費(fèi)力,還給rPCR定量檢測(cè)帶來困難。因此,建立對(duì)羊肉含量直接定量檢測(cè)方法,以滿足市場(chǎng)監(jiān)管需求具有廣闊前景。
根據(jù)NOH等[10]和K?PPEL等[11]最近研究報(bào)道,肉質(zhì)量與基因拷貝數(shù)之間存在著密切的線性關(guān)系。而近幾年發(fā)展起來的dd PCR方法,是結(jié)合微流控技術(shù)建立在PCR基礎(chǔ)上的新興核酸檢測(cè)技術(shù),不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)樣本,能夠直接測(cè)定出檢測(cè)體系中目的基因的拷貝數(shù)[12]。因此,為實(shí)現(xiàn)對(duì)羊肉的精準(zhǔn)定量,本研究嘗試將rPCR與ddPCR相結(jié)合,利用ddPCR建立拷貝數(shù)和羊肉質(zhì)量的函數(shù)關(guān)系,建立基于rPCR檢測(cè)肉中羊肉含量的方法,以便為摻假肉類的監(jiān)督管理提供技術(shù)參考。
1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
實(shí)驗(yàn)樣品:山羊肉、綿羊肉、鴨肉、水牛肉、黃牛肉、牦牛肉、豬肉、狐貍?cè)?、貂肉、鹿肉、兔肉、雞肉、鴿肉、火雞肉、鵝肉、鱈魚、虹鱒魚、銀鱈魚、大黃魚、大菱鲆等,均由成都海關(guān)技術(shù)中心提供。
引物探針(羊源性引物探針),由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成;質(zhì)粒(pUC57-GH-羊),由北京六合華大基因科技有限公司合成;Droplet Generator DG8 CartndgeDroplet Gene rator,BIO-RAD公司;DG8 GasketPierceable Foil Heat Seal,BIO-RAD公司;Premix Ex Taq(Probe qPCR)預(yù)混液,TaKaRa公司;蛋白酶K(20 mg/mL),拓樣生物有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒Plasmid Mini Kit,QIAGEN生物科技有限公司;ddPCR Supermix for Probes (no Dutp)、ddPCR Droplet Generation Oil、ddPCR Droplet Reader Oil,BIO-RAD有限公司;
1.1.2 儀器與設(shè)備
FastPrep型樣品研磨器,印度MP有限公司;X3R型高速冷凍離心機(jī),美國Thermo Fisher Scientific公司;FastPrep-24 5G型勻漿儀,美國MP Biomedicals生物醫(yī)學(xué)公司;ND-1000 NanoDrop型核酸蛋白測(cè)定儀、CFX96 Real-time PCR 儀、QX100 Droplet Digital PCR系統(tǒng)(微滴生成儀PX1PCR板熱封儀微滴分析儀),美國BIO-RAD公司。
1.2.1 樣品DNA的制備
將新鮮羊肉的肌肉組織絞碎后于100 ℃烘干至恒重,再向研缽中加入液氮,將烘干樣品研磨至粉狀。稱取處理后的羊肉粉100 mg,采用實(shí)驗(yàn)室自制的動(dòng)物組織基因組磁珠法提取試劑盒進(jìn)行DNA提取,所得基因組DNA質(zhì)量通過瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop ND-2000核酸蛋白定量儀評(píng)價(jià)[13]。
1.2.2 羊源性引物探針篩選設(shè)計(jì)與條件優(yōu)化
1.2.2.1 引物探針選擇與設(shè)計(jì)
通過查詢NCBI數(shù)據(jù)庫,選定羊的單拷貝生長激素基因GH(序列號(hào)為NC-019468)設(shè)計(jì)引物探針,設(shè)計(jì)的引物探針由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。
1.2.2.2 特異性驗(yàn)證
為了對(duì)所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行特異性驗(yàn)證,采用磁珠法分別提取1.1.1中所述的山羊肉、綿羊肉等20種動(dòng)物肌肉DNA。同時(shí)設(shè)置用ddH2O代替核酸的陰性對(duì)照(NTC)。若陰性對(duì)照結(jié)果為陰性,整個(gè)試驗(yàn)有效,可進(jìn)一步判定結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每次2個(gè)平行。
1.2.2.3 rPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化
采用TaqMan PCR Master Mix(Bio-Rad)試劑推薦的25 μL體系,對(duì)模板DNA(約50 ng/μL)進(jìn)行rPCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為:Dream Taq PCR Master Mix 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板2 μL,用ddH2O補(bǔ)足25 μL。擴(kuò)增條件確定為:95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,45個(gè)循環(huán)。通過比較rPCR的Ct值和擴(kuò)增曲線等來確定優(yōu)化結(jié)果。每個(gè)樣品每個(gè)處理做2個(gè)平行。
退火溫度優(yōu)化:設(shè)置退火溫度為58、59、60、61、62、63、64和65 ℃共8個(gè)梯度,通過比較分析rPCR的Ct值和擴(kuò)增曲線等來確定羊源性特異性引物和探針的最佳退火溫度。每個(gè)樣品每個(gè)處理做2個(gè)平行。
引物濃度優(yōu)化:設(shè)置rPCR體系中上下游引物濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1 pmol/μL,Dream Taq PCR Master Mix 12.5 μL,探針濃度0.4 pmol/μL 加1 μL,DNA模板2 μL,用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,45個(gè)循環(huán)。通過比較分析rPCR的Ct值和擴(kuò)增曲線等來確定優(yōu)化結(jié)果。每個(gè)樣品每個(gè)處理做3個(gè)平行。
探針濃度優(yōu)化:設(shè)置rPCR體系中探針濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1 pmol/μL,Dream Taq PCR Master Mix 12.5 μL,上、下游引物(濃度0.4 pmol/μL)各1 μL,DNA模板2 μL,用ddH2O補(bǔ)足25 μL。擴(kuò)增條件:95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,45個(gè)循環(huán)。通過比較分析rPCR的Ct值和擴(kuò)增曲線等來確定優(yōu)化的結(jié)果。每個(gè)樣品每個(gè)處理做3個(gè)平行。
1.2.2.4 靈敏度驗(yàn)證
為了驗(yàn)證該方法的靈敏度,將提取的羊的DNA模板按梯度分別稀釋為100、10、1、0.1、0.01、0.001 ng/μL,進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每個(gè)梯度2個(gè)平行。
1.2.3 rPCR定量檢測(cè)方法的建立
1.2.3.1 質(zhì)粒的合成與DNA提取
根據(jù)設(shè)計(jì)羊源性引物探針?biāo)x取的保守區(qū)域合成質(zhì)粒pUC57-GH-羊,委托北京六合華大基因科技有限公司合成。質(zhì)粒的制備按照劉麒等[14]的方法進(jìn)行,質(zhì)粒DNA采用小量抽提試劑盒提取。
1.2.3.2 基于拷貝數(shù)的羊肉質(zhì)量與Ct值函數(shù)關(guān)系的建立
(1)質(zhì)??截悢?shù)與Ct值函數(shù)關(guān)系的建立
用核酸蛋白儀測(cè)定提取的pUC57-GH-羊標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA質(zhì)量濃度,并對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行10倍稀釋,采用qPCR進(jìn)行擴(kuò)增,以lg(重組質(zhì)粒拷貝數(shù))為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)Ct值為縱坐標(biāo)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,其中重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)按公式(1)計(jì)算[15]:
(1)
式中:樣本質(zhì)量濃度為測(cè)定的質(zhì)粒含量(ng/μL),經(jīng)核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定后,羊質(zhì)粒質(zhì)量濃度為240.69 ng/μL;樣本分子質(zhì)量=重組質(zhì)粒長度×660,其中重組質(zhì)粒長度按公式(2)計(jì)算:
重組質(zhì)粒長度=T載體長度+目的片段長度
(2)
式中:T載體長度為2 710 bp,目的片段長度為300 bp。
(2)羊肉質(zhì)量與拷貝數(shù)函數(shù)關(guān)系的建立
將羊肉與豬、鴨肉的干物質(zhì)(總干物質(zhì)100 mg)按一定比例混合后,準(zhǔn)確稱取7 mg干物質(zhì)提取DNA,提取的DNA進(jìn)行ddPCR擴(kuò)增,讀取羊肉基因拷貝數(shù)。以羊肉質(zhì)量為y軸,質(zhì)量對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)為x軸建立羊肉質(zhì)量與基因拷貝數(shù)的函數(shù)關(guān)系。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,每次2個(gè)平行。具體混合比例如表1所示。
1.2.4 rPCR檢測(cè)方法靈敏度驗(yàn)證
為了驗(yàn)證該方法的實(shí)際檢測(cè)靈敏度,將羊肉干物質(zhì)與牛肉、鴨肉、豬肉干物質(zhì)進(jìn)行混合。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次,每次2個(gè)平行。具體混合比例如表2所示。
表1 混合肉樣中的樣品混合比例Table 1 Mixing ratio of samples in mixed meat samples
注:-表示不含有(下同)
表2 rPCR檢測(cè)方法實(shí)際靈敏度實(shí)驗(yàn)的樣品混合比例Table 2 rPCR detection method sample mixing ratio of actual sensitivity experiment
1.2.5 rPCR檢測(cè)方法定量線性范圍的確定
為確定rPCR定量方法線性范圍,將羊肉干物質(zhì)與豬、鴨肉干物質(zhì)混合(總干物質(zhì)10 g),以模擬摻假樣品的檢測(cè)。按照2.2所優(yōu)化的最佳反應(yīng)條件進(jìn)行rPCR擴(kuò)增。每個(gè)比例平行檢測(cè)3次,通過2.3中得到的函數(shù)關(guān)系公式計(jì)算其含量并與實(shí)際樣品含量比較,計(jì)算平行組內(nèi)的平均值、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)誤差,對(duì)檢測(cè)體系的定量準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。具體混合比例如表3所示。
表3 rPCR模擬樣品混合比例Table 3 rPCR simulated sample mixing ratio
1.2.6 市售羊肉樣品含量的檢測(cè)
為了驗(yàn)證本方法在實(shí)際羊肉樣品檢測(cè)中的可行性,對(duì)2018~2019年成都海關(guān)技術(shù)中心保存的四川省內(nèi)超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)隨機(jī)抽取的28個(gè)羊肉及其制品進(jìn)行檢測(cè)。準(zhǔn)確稱取經(jīng)前處理干燥后的1 g待檢樣品,加入100 mg的內(nèi)標(biāo)干物質(zhì)混合均勻后,取7 mg進(jìn)行DNA提取,采用現(xiàn)行定性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2051—2008食品、化妝品和飼料中牛羊源性成分檢測(cè)方法進(jìn)行定性檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果顯示為陽性的樣品再利用本實(shí)驗(yàn)建立方法進(jìn)行定量檢測(cè),進(jìn)一步驗(yàn)證所建方法的準(zhǔn)確性和實(shí)際應(yīng)用能力。
2.1.1 單拷貝基因的篩選
GH基因在整個(gè)基因組里僅在19號(hào)染色體上有1個(gè)拷貝,是單拷貝基因。
2.1.2 引物探針的設(shè)計(jì)
2.1.2.1 序列的篩選
利用序列分析軟件DNA Man 6.0 對(duì)山羊、綿羊、水牛、黃牛、瘤牛的生長激素基因序列進(jìn)行比對(duì)分析,各物種序列比對(duì)結(jié)果如圖1所示,通過選取羊的特異性保守區(qū)域進(jìn)行引物探針的設(shè)計(jì)。
2.2.1.2 引物探針的設(shè)計(jì)
設(shè)計(jì)的羊源性引物探針基本信息如表4所示。
表4 羊源性引物探針基本信息Table 4 Basic information of sheep primers probe
表5為設(shè)計(jì)的羊源性GH基因引物探針的序列。合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后進(jìn)一步瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),最后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast同源性數(shù)據(jù)庫比對(duì)后結(jié)果顯示同源性均在96%以上。
圖1 羊與其他物種GH基因序列比對(duì)Fig.1 Comparison of GH gene sequences between sheep and other species注:左側(cè)序列號(hào)從上到下依次為山羊、綿羊、水牛、黃牛、瘤牛
2.1.3 特異性驗(yàn)證
由圖2可知,在引物特異性實(shí)驗(yàn)中,只有綿羊和山羊的DNA檢測(cè)到了擴(kuò)增信號(hào),平均Ct值分別為24.93和25.77,未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增;而水牛、黃牛、牦牛、豬、鹿、狐貍、鵝、兔、鴿、鱈魚、大黃魚、鴨、火雞、虹鱒魚、貂、雞、銀鱈魚、多寶魚等非目標(biāo)物種DNA的PCR試驗(yàn)未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線,說明本試驗(yàn)所設(shè)計(jì)引物特異性良好且能同時(shí)對(duì)綿羊和山羊成分進(jìn)行檢測(cè)。
圖2 羊源性引物探針rPCR特異性驗(yàn)證Fig.2 rPCR specificity verification of sheep primers
2.1.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化
2.1.4.1 rPCR最佳退火溫度
由圖3可知,將反應(yīng)的退火溫度作為單一變量,當(dāng)退火溫度為60 ℃時(shí),熒光信號(hào)強(qiáng)度最強(qiáng),Ct值為23.01,因此羊源性引物探針rPCR的最佳退火溫度為60 ℃。
圖3 羊源性引物探針rPCR退火溫度優(yōu)化Fig.3 rPCR annealing temperature optimization of sheep primers
2.1.4.2 rPCR最佳引物和探針濃度
當(dāng)rPCR擴(kuò)增體系中引物終濃度為0.2 pmol/μL時(shí)熒光信號(hào)最強(qiáng),Ct值平均值最小為23.286。因此,0.2 pmol/μL為rPCR檢測(cè)羊源性成分的最佳引物濃度。當(dāng)rPCR擴(kuò)增體系中探針終濃度為0.6 pmol/μL時(shí)熒光信號(hào)最強(qiáng),Ct值平均值最小為23.07,因此0.6 pmol/μL為rPCR檢測(cè)羊源性成分的最佳探針濃度。
2.1.5 靈敏度驗(yàn)證
由圖4可看出,當(dāng)DNA質(zhì)量濃度為0.001 ng/μL時(shí),未發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng),而當(dāng)DNA質(zhì)量濃度為0.01 ng/μL時(shí)有擴(kuò)增,Ct值為38.08。因此,在本實(shí)驗(yàn)所建立的方法下,該對(duì)引物在rPCR反應(yīng)體系中檢測(cè)羊DNA的檢測(cè)限為0.01 ng/μL,體系總DNA為0.02 ng。
圖4 rPCR檢測(cè)羊肉DNA的靈敏度驗(yàn)證Fig.4 Sensitivity verification of rPCR for detection of mutton DNA
2.2.1 羊GH基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒DNA合成序列與提取結(jié)果
2.2.1.1 質(zhì)粒合成序列
選擇用于設(shè)計(jì)引物的單拷貝基因保守區(qū)域作為質(zhì)粒的合成序列,具體序列如下:
481 cagccatgtc cttgtccggc ctgtttgcca acgctgtgct ccgggctcag cacctgcatc
541 aactggctgc tgacaccttc aaagagtttg taagctcccc agagatgtgt cctagaggtg
601 gggaggcagg aaggggtgaa tccgcacccc ctccacacaa tggga-gggaa ctgaggacct
661 cagtggtatt ttatccaagt aaggatgtgg tcaggggagt ggaaatgggg gtgtgtgggg
721 tggggagggt tccgaataag gcagtgaggg gaaccccgca ccagctgaga cctgggtggg
781 tgtgttctcc ccccaggagc gcacctacat cccggaggga cagagatact ccatccagaa
2.2.1.2 羊GH基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒DNA的提取質(zhì)量
質(zhì)粒DNA提取的結(jié)果如表6所示,提取的pUC57-GH-羊質(zhì)粒DNA純度A260/A280均在1.8以上,提取的DNA質(zhì)量濃度平均值為240.26 ng/μL,說明提取的質(zhì)粒DNA純度較好,滿足定量檢測(cè)的要求。
表6 羊GH基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒DNA提取質(zhì)量Table 6 Sheep GH gene standard plasmid DNA extraction quality
2.2.2 羊肉質(zhì)量與Ct值函數(shù)關(guān)系的建立
2.2.2.1 Ct值與拷貝數(shù)的函數(shù)關(guān)系
將經(jīng)活化的質(zhì)粒提取DNA,通過10倍稀釋后進(jìn)行rPCR擴(kuò)增,用核酸蛋白儀對(duì)DNA的質(zhì)量測(cè)定,得到羊的質(zhì)粒質(zhì)量濃度為240.26 ng/μL。通過拷貝數(shù)計(jì)算公式得總拷貝數(shù)為:7.27×1010。以lg(重組質(zhì)粒樣品稀釋度)為橫坐標(biāo),以對(duì)應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)作圖得到,羊質(zhì)粒Ct值和拷貝數(shù)線性關(guān)系為y=-3.417 7x+72.797,所建標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(R2)為0.996 4(圖5),這表明其線性關(guān)系好,可用于準(zhǔn)確定量。
圖5 羊肉標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的拷貝數(shù)與Ct值函數(shù)關(guān)系Fig.5 The relationship between the copy number of mutton standard plasmid and Ct value
2.2.2.2 羊肉質(zhì)量與拷貝數(shù)的函數(shù)關(guān)系
以羊肉質(zhì)量為y軸,質(zhì)量對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)為x軸建立函數(shù)關(guān)系。由圖6可知,線性方程為y=0.003x+0.097 8,相關(guān)系數(shù)R2=0.998 4,這表明羊肉的質(zhì)量與基因拷貝數(shù)之間有明顯的線性關(guān)系。
圖6 羊肉質(zhì)量與拷貝數(shù)函數(shù)關(guān)系Fig.6 Sheep quality and copies number function
2.2.2.3 Ct值與羊肉質(zhì)量的函數(shù)關(guān)系
根據(jù)2.2.2.1中拷貝數(shù)與Ct值的函數(shù)關(guān)系y=-3.417 7x+ 72.797,以及2.2.2.2中羊肉質(zhì)量與拷貝數(shù)的函數(shù)關(guān)系y=0.003x+0.097 8相結(jié)合,以基因拷貝數(shù)為中間轉(zhuǎn)化關(guān)系,可以由樣品rPCR擴(kuò)增的Ct值計(jì)算出樣品質(zhì)量。得出羊肉的質(zhì)量與Ct值之間的關(guān)系如公式(3)所示:
(3)
式中:Mb表示基于基因拷貝數(shù)為中間值換算羊肉的質(zhì)量,A表示羊源性成分?jǐn)U增的Ct值。
由圖7可知,當(dāng)羊肉含量為0.25%時(shí),Ct值大于40,視為陰性。即該檢測(cè)方法實(shí)際靈敏度為0.25%,并且隨著羊肉比例增加,Ct 值逐漸減小。
圖7 rPCR定量方法靈敏度驗(yàn)證Fig.7 rPCR quantitative method sensitivity verification
由表7可知,羊肉含量為1%的模擬摻假樣品相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)大于25%,不符合國際食品法典委員會(huì)關(guān)于食品定性和定量檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)中最低定量檢測(cè)限RSD應(yīng)小于25%的規(guī)定[16]。而其余含羊肉5%~70%的模擬摻假樣品RSD值均在14%以內(nèi),滿足定量檢測(cè)要求,所以該方法在羊肉含量為5%以上時(shí)的準(zhǔn)確度和精密度高,因此方法的最低定量檢測(cè)限為5%。
表7 rPCR定量方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性驗(yàn)證結(jié)果Table 7 Repeatability and accuracy verification results of rPCR absolute quantification method
將本實(shí)驗(yàn)建立的定量檢測(cè)方法和現(xiàn)行檢測(cè)方法(SN/T 2051—2008)對(duì)樣品中羊肉含量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果如表8所示。
表8 rPCR對(duì)市售羊肉樣品的檢測(cè)結(jié)果Table 8 Detection of mutton samples by rPCR
由表8可知,由于現(xiàn)行食品中羊肉含量檢測(cè)方法(SN/T 2051—2008)僅能夠檢測(cè)出食品中是否含有羊肉成分,但并不能確定羊肉的具體含量。因此,需要進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)才能確定其含量。由本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)方法可知,來源于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的3個(gè)樣品的羊肉含量不足100%,其中2個(gè)樣品中羊肉含量分別是94.8%和93.5%,這并不能簡單判定為摻假,因?yàn)閾郊俚哪康氖谦@取更大利潤,摻入非羊肉比例太低則無利可圖;而且食品在生產(chǎn)加工、流通過程中,不同原料或產(chǎn)品間均存在著交叉污染的可能。因此,綜合判定這2個(gè)樣品可能是加工或流通過程中被其他動(dòng)物源成分無意污染,而非故意添加。另外一個(gè)樣品中羊肉所占比例僅為58.5%,可確定為摻假,這表明現(xiàn)有的市售樣品存在一定的摻假情況。
為實(shí)現(xiàn)rPCR方法檢測(cè)的可靠性和取樣可比性,本研究首先對(duì)樣品進(jìn)行干燥處理,以保證檢測(cè)同種肉樣間樣品細(xì)胞密度趨于一致。rPCR方法應(yīng)用于肉制品的摻假檢驗(yàn)過程中,物種特異基因的正確選擇是實(shí)現(xiàn)物種鑒定的關(guān)鍵因素。現(xiàn)有鑒定方法多數(shù)將研究的基因位點(diǎn)選擇在線粒體DNA(mt DNA)上,但THALMANN等[17]認(rèn)為mt DNA片段可以整合到基因組中,由于進(jìn)化效率不同,這些整合后的基因可能會(huì)和mt DNA同時(shí)擴(kuò)增,對(duì)結(jié)果分析造成干擾。MURUGAIAH等[18]認(rèn)為由于不同物種細(xì)胞中線粒體的拷貝數(shù)各不相同,以線粒體為靶基因的檢測(cè)結(jié)果很難定量分析出食品中動(dòng)物源性成份的組成比例。FLOREN等[19]研究也表明以線粒體DNA為目標(biāo)進(jìn)行物種量化是并不適宜,因?yàn)榻M織中每個(gè)細(xì)胞mt DNA含量存在至少5倍的差異,這會(huì)導(dǎo)致物種DNA含量被低估或高估。與線粒體基因相比,持家基因?qū)儆趩慰截惢颍哂锌截悢?shù)少且數(shù)量相對(duì)恒定等特點(diǎn),不會(huì)因?yàn)槿硬课徊煌瑢?dǎo)致定量結(jié)果出現(xiàn)偏差,更有利于做定量分析。REN等[20]利用單拷貝基因設(shè)計(jì)特異性引物,定量檢測(cè)了食品中牛、豬等動(dòng)物源性成份,取得了理想效果。因此,為了定量準(zhǔn)確性,本文選擇單拷貝持家基因生長激素(GH)基因作為靶基因來設(shè)計(jì)引物。
此外,對(duì)于深加工的肉制品,DNA受到加熱影響后容易發(fā)生斷裂,無法進(jìn)行PCR的有效擴(kuò)增[21]。EBBEHOJ等[22]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)肉溫加熱到100 ℃時(shí)DNA片段減少到1 100 bp 左右,而加熱到120 ℃時(shí)減少至 600 bp 以下。MARTN等[23]在采用rPCR檢測(cè)食品和飼料中豬源性成分時(shí)也認(rèn)為,肉類經(jīng)過加工后DNA片段會(huì)變短,在利用PCR技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物源性成分檢測(cè)時(shí),引物擴(kuò)增片段要求盡可能較短。本研究中設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增片段長度為83 bp,滿足熱加工肉制品的分析要求。因此,本研究對(duì)18個(gè)常見非目標(biāo)物種DNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè),結(jié)果表明引物與探針僅對(duì)綿羊和山羊的DNA特異,這降低了其在實(shí)際應(yīng)用中出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增風(fēng)險(xiǎn)。
在肉類定量檢測(cè)中,如何有效得到待檢肉類的質(zhì)量百分比值是研究難點(diǎn),建立線性回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線法是目前實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)的有效方法。CAI等[24]利用ddPCR方法檢測(cè)肉制品中豬肉和雞肉質(zhì)量時(shí),發(fā)現(xiàn)肉質(zhì)量與DNA質(zhì)量以及DNA質(zhì)量和DNA拷貝數(shù)之間呈線性關(guān)系,能夠通過DNA拷貝數(shù)建立計(jì)算生肉質(zhì)量的公式。因此,本研究以羊肉為檢測(cè)對(duì)象,借助ddPCR技術(shù),構(gòu)建了拷貝數(shù)與羊質(zhì)粒的Ct值、拷貝數(shù)與羊肉含量之間的函數(shù)關(guān)系,以基因拷貝數(shù)為中間轉(zhuǎn)化關(guān)系,最終構(gòu)建Ct值與羊肉含量的函數(shù)關(guān)系。此外,在rPCR的定量研究中,判定Ct值的檢測(cè)閾值沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),需根據(jù)不同樣品、目的基因及引物探針的特異性來綜合分析并制定檢測(cè)閾值[25]。本試驗(yàn)根據(jù)樣品中羊肉含量為0.25%時(shí)Ct值大于40,將Ct值40作為檢測(cè)閾值,即該檢測(cè)方法實(shí)際靈敏度為0.25%。
為了驗(yàn)證本方法實(shí)際的應(yīng)用能力,將本方法與SN/T 2051—2008食品、化妝品和飼料中牛羊源性成分檢測(cè)方法對(duì)比檢測(cè)市售樣品。結(jié)果表明本方法能夠?qū)悠分?%以上的羊肉進(jìn)行精準(zhǔn)定量,而且不需要每一次檢測(cè)都構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,方法具有較好重復(fù)性和穩(wěn)定性。對(duì)于待檢樣品,僅需要測(cè)定羊源性成分的Ct值就可通過公式得到羊肉含量。
本研究將rPCR與ddPCR相結(jié)合,建立了基于DNA拷貝數(shù)與樣品質(zhì)量間線性關(guān)系對(duì)羊肉含量進(jìn)行定量的方法。通過對(duì)通過模擬摻假樣品和市售樣品進(jìn)行檢測(cè),本方法能夠?qū)悠分?%以上的羊肉進(jìn)行精準(zhǔn)定量,具有良好的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性,能夠?yàn)檠蛉獾膿郊勹b別提供參考。