牛肉鹵制過(guò)程中蛋白質(zhì)組分的變化及其對(duì)品質(zhì)的影響

李湘鑾，劉巧瑜，趙文紅，楊娟，白衛(wèi)東*，胡松青

1(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院，廣東 廣州，510225)2(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州，510640)3(廣州市廣式傳統(tǒng)食品加工與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510225)

鹵制品是我國(guó)特色加工肉制品，其消費(fèi)呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)。鹵制品特征鮮明，具有濃郁的鹵汁香味、悠長(zhǎng)的回味、軟爛的質(zhì)地口感，常用作開(kāi)胃菜、冷菜和即食休閑食品，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。牛肉是鹵制品加工常用的原料。

蛋白質(zhì)是牛肉中最主要的成分，具有廣泛的功能特性，可形成網(wǎng)絡(luò)與結(jié)構(gòu)，可與其它成分協(xié)同，在肉制品質(zhì)地、滋味與營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的形成中發(fā)揮重要作用[1-3]。肌原纖維蛋白不僅對(duì)肉制品持水性具有重要的影響[4]，也和骨架蛋白決定肉的肌原纖維強(qiáng)度[5]。水是食品體系中最重要的成分，對(duì)食品的加工變化、產(chǎn)品品質(zhì)和儲(chǔ)存穩(wěn)定性具有重要的影響[6]。牛肉中大部分水因毛細(xì)管的束縛存在于肌原纖維中。水的運(yùn)動(dòng)性對(duì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性具有關(guān)鍵的影響。核磁共振(nuclear magnetic，NMR)是一種無(wú)損檢測(cè)方法，可用于分析水質(zhì)子的運(yùn)動(dòng)性和分布[7-8]。

牛肉鹵制過(guò)程中，一方面蛋白質(zhì)受熱變性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)-水相互作用的變化以及肌肉纖維橫縱向的收縮變化，使其水結(jié)合能力下降[9-10]，從而改變鹵牛肉質(zhì)地特性和水分分布，有助于肉制品品質(zhì)的形成。另一方面，蛋白質(zhì)降解生成游離氨基酸和肽。這些降解產(chǎn)物是風(fēng)味化合物的前體物質(zhì)，對(duì)鹵牛肉的滋味具有一定影響[11]。蛋白質(zhì)占鹵牛肉干重的55% 以上，但關(guān)于牛肉在鹵制過(guò)程中蛋白質(zhì)組分的變化情況，以及是否影響鹵牛肉品質(zhì)的研究較少，且作用機(jī)理尚不清楚。

為探討蛋白質(zhì)在鹵牛肉滋味、水分分布和品質(zhì)形成中的作用，本文研究了牛肉鹵制過(guò)程中蛋白質(zhì)組分的變化，并分析其對(duì)鹵牛肉理化特性的影響，以期為優(yōu)化牛肉鹵制工藝提供一定的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛后腿肉：魯西黃牛(18月齡)，廣東清遠(yuǎn)牧原養(yǎng)牛場(chǎng)。

NaCl、Na2HPO4、KH2PO4、KCl、NaOH、三氯乙酸(TCA)、甲醇，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)有限公司。

生姜、洋蔥、花椒、二鍋頭(酒精度為46%)、食鹽均為食品級(jí)，市購(gòu)。

1.2 儀器與設(shè)備

Eppendorf 5418高速冷凍離心機(jī)，艾本德中國(guó)有限公司；Agilent 1200型高效液相色譜，美國(guó)安捷倫科技有限公司；K9860型全自動(dòng)凱式定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；TA-XTPlus質(zhì)構(gòu)儀，英國(guó)Stable Micro Systems公司;MesoMR23-040H-I核磁共振成像分析儀，蘇州紐邁分析儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牛肉鹵制方法

將100 g生姜汁、100 g洋蔥汁、10 g花椒、200 g二鍋頭和300 g食鹽拌和均勻，制得腌制劑。牛肉切成10 cm×10 cm×3 cm的規(guī)格，用10%腌制劑(質(zhì)量分?jǐn)?shù))0～4 ℃腌制24 h，然后放入1.8倍體積的鹵汁中于95 ℃分別鹵制60、90、120、150和180min。

1.3.2 各蛋白質(zhì)組分的分離提取與測(cè)定

參考VISESSANGUAN的方法[12]，并稍作修改。4.00 g樣品加入10倍體積的提取液A(15.6 mmol/L Na2HPO4、3.5 mmol/L KH2PO4，pH 7.5)，9 500 r/min均質(zhì)1 min，10 000 r/min離心20 min。上清液加入冷卻的50% TCA至最終濃度為10%，10 000 r/min離心15 min，上清液和沉淀分別為非蛋白氮和水溶蛋白。沉淀中加入10倍體積的提取液B(0.45 mmol/L KCl、15.6 mmol/L KH2PO4、3.5 mmol/L Na2HPO4，pH 7.5)，9 500 r/min均質(zhì)1min，然后10 000 r/min離心15 min，重復(fù)離心2次。上清液為鹽溶蛋白。沉淀加入10倍體積0.1 mol/L NaOH，10 000 r/min離心15 min，所得上清液和最終的沉淀分別為堿溶蛋白和堿不溶蛋白。蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用凱氏定氮法(GB5009—2010)。

1.3.3 游離氨基酸分析方法

參照CEYLAN的方法并適當(dāng)調(diào)整[13]，采用HPLC測(cè)定。精準(zhǔn)稱取4.00 g樣品加入三氯乙酸40 mL，9 500 r/min勻質(zhì)1 min，再用雙層濾紙過(guò)濾。濾液于4 ℃條件下10 000 r/min離心30 min，然后取1 μL上清液進(jìn)樣分析。

HPLC測(cè)定條件：色譜柱為ODS HYPERSIL柱(4.6 mm×250 mm×5 μm)；采用鄰苯二甲醛和9-甲基氯甲酸酯進(jìn)行柱前衍生化處理；流動(dòng)相A：20 mmol/L醋酸-醋酸鈉溶液(pH 7.2)，流動(dòng)相B：V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1。流動(dòng)相流速1 mL/min，柱溫40℃。

1.3.4 水分含量測(cè)定

按照GB 5009.3—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定中的直接干燥法[14]。

1.3.5 LF-NMR橫向弛豫時(shí)間(T2)測(cè)定

整塊樣品放入60 mm的檢測(cè)線圈內(nèi)在室溫下測(cè)定NMR弛豫時(shí)間波譜，采用CPMG序列采集。操作條件：TR=500 ms，NS=4，Echo Time=100 μs，Echo Count=2 500。數(shù)據(jù)采用PQ001軟件分析。

1.3.6 質(zhì)構(gòu)分析(TPA)

鹵牛肉自然冷卻至室溫，切成3 cm×3 cm×3 cm的方塊。采用TA-XTPlus質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定樣品的質(zhì)構(gòu)。測(cè)定參數(shù)：探頭P5，測(cè)試前速度3 mm/s，測(cè)試后速度2 mm/s，測(cè)定間隔時(shí)間20 s，探頭距離20 mm。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)做3次，取3次平行測(cè)定的平均值，采用SPSS 11.0軟件分析數(shù)據(jù)間的顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛肉鹵制過(guò)程中蛋白質(zhì)組分的變化

根據(jù)蛋白質(zhì)溶解性的不同，牛肉中的蛋白質(zhì)可分成NPN、水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、堿溶蛋白和堿不溶蛋白。NPN主要由氨基酸和肽組成。水溶蛋白主要由肌漿蛋白組成，包括磷酸化酶、肌酸激酶以及磷酸甘油激酶[15]。鹽溶蛋白主要由肌球蛋白重鏈、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白等多種肌原纖維蛋白組成。堿溶蛋白主要包括變性的肌動(dòng)球蛋白和膠原蛋白的降解物[16]。堿不溶蛋白由膠原蛋白和彈性蛋白等大分子質(zhì)量基質(zhì)蛋白組成。

如圖1所示，牛肉在鹵制過(guò)程中，NPN含量逐漸增大(P<0.05)。由于蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生肽和游離氨基酸，導(dǎo)致NPN含量增大。而水溶蛋白、鹽溶蛋白以及堿溶蛋白均顯著下降(P<0.05)，表明這部分蛋白質(zhì)在熱的作用下大量降解并部分地溶于鹵汁中。堿溶蛋白是牛肉中的最主要蛋白質(zhì)組分。鹽溶蛋白在加熱過(guò)程中部分舒張并形成網(wǎng)絡(luò)，部分親水性基團(tuán)可能暴露于蛋白質(zhì)的表面，從而提高牛肉的持水能力。蛋白質(zhì)總量的下降是水溶蛋白、鹽溶蛋白和堿溶蛋白的共同下降的結(jié)果。堿不溶蛋白的含量高于其它蛋白質(zhì)組分，且不溶于鹵汁，故其下降速率緩慢(P>0.05)。

圖1 牛肉鹵制過(guò)程中蛋白質(zhì)組分的含量Fig.1 Contents of protein fractions during processing of beef marinating注：不同指標(biāo)小寫(xiě)字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

2.2 牛肉鹵制過(guò)程中游離氨基酸的變化

鹵制過(guò)程中，游離氨基酸總量在60 min時(shí)顯著增大(P<0.05)，90 min時(shí)明顯減少(P<0.05)，隨后顯著增大(P<0.05)(表1)。游離氨基酸總量從2 677.4 mg/kg顯著增加到3 370.3 mg/kg，這是由于蛋白質(zhì)的降解和鹵汁中的氨基酸擴(kuò)散到牛肉中。

鹵牛肉滋味的鮮味程度與肌肉中呈味氨基酸的含量和組成有關(guān)[17]。鮮味氨基酸主要為谷氨酸和天冬氨酸。鹵制過(guò)程中，谷氨酸的含量明顯地連續(xù)增大(P<0.05)，由此導(dǎo)致游離氨基酸總量的增加。鹵牛肉中增加的谷氨酸主要來(lái)自于鹵汁中味精和醬油的添加，它們的主要成分為谷氨酸鈉。丙氨酸含量顯著地連續(xù)下降(P<0.05)，導(dǎo)致甜味氨基酸總量的下降。這表明大量的氨基酸溶于鹵汁中或降解。而苦味氨基酸總量變化不明顯，其中甲硫氨酸和半胱氨酸是肉味風(fēng)味的前提物質(zhì)，在鹵制過(guò)程中經(jīng)Strecher降解生成不同的含硫化合物，從而產(chǎn)生含硫的揮發(fā)性前體物質(zhì)。因此鹵制過(guò)程中谷氨酸和游離氨基酸總量的增加有助于鹵牛肉滋味的形成。

游離氨基酸的相互作用有助于形成肉品特有的滋味[18-19]。纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸可明顯加強(qiáng)滋味的強(qiáng)度[20-21]。游離的賴氨酸、酪氨酸和天冬氨酸與肉的老化滋味具有明顯關(guān)系[22]。

表1 牛肉鹵制過(guò)程中游離氨基酸的含量 單位：mg/kgTable 1 The content of free amino acids during processing of beef marinating

注：同一行中上標(biāo)字母不同表示彼此間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.3 牛肉鹵制過(guò)程中水分含量的變化

鹵制過(guò)程中，牛肉中的水分含量呈逐漸下降趨勢(shì)(P<0.05)(表2)。牛肉中的大部分水因毛細(xì)管的束縛存在于肌纖維中。熱誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)的變性和結(jié)構(gòu)性收縮降低蛋白質(zhì)的持水能力。肌球蛋白約占肌原纖維蛋白總量45%，是熱穩(wěn)定性最低的結(jié)構(gòu)蛋白，在 40～60 ℃便開(kāi)始變性[23]。蛋白質(zhì)含量的變化(圖1)顯示，鹵制過(guò)程中牛肉中的蛋白質(zhì)逐漸變性、降解、溶于鹵汁中，導(dǎo)致牛肉中的水分大量析出。

表2 牛肉鹵制過(guò)程中水分含量的變化Table 2 The change of moisture content during processing of beef marinating

2.4 牛肉鹵制過(guò)程中水分分布的變化

2.4.1 牛肉鹵制過(guò)程中橫向弛豫時(shí)間T2的變化

根據(jù)水分存在的狀態(tài)，依次可分為結(jié)合水(T21)、不易流動(dòng)水(T22)和自由水(T23)。如圖2所示，未鹵制牛肉的圖譜中只有2個(gè)峰，鹵牛肉的圖譜中出現(xiàn)3個(gè)峰，表明未鹵制牛肉中水分的存在狀態(tài)不同于鹵牛肉的。T22信號(hào)強(qiáng)度和峰面積最大，說(shuō)明牛肉中的水分主要為不易流動(dòng)水。

圖2 牛肉鹵制過(guò)程中弛豫時(shí)間T2分布圖Fig.2 Distribution of transverse relation time T2 during processing of beef marinating

橫向弛豫時(shí)間T2可以反映水分的自由度，T2越大，水分自由度越大。如表3所示，牛肉鹵制過(guò)程中，T21的弛豫時(shí)間無(wú)明顯差別(P<0.05)，說(shuō)明這部分結(jié)合水很穩(wěn)定，不受蛋白質(zhì)降解的影響。T22在初始的90 min顯著地下降(P<0.05)，隨后保持不變。鹵制過(guò)程中，一方面鹽溶蛋白部分舒張并形成網(wǎng)絡(luò)，部分親水性基團(tuán)暴露于蛋白質(zhì)的表面，從而降低不易流動(dòng)水的自由度。另一方面因蛋白質(zhì)的降解，肽和氨基酸濃度增大，由此提高了細(xì)胞內(nèi)滲透壓，增強(qiáng)牛肉的持水能力。T23在60～90 min與120～180 min均保持不變，但隨著鹵制時(shí)間的增加，自由水的水分活度增強(qiáng) (P<0.05)。自由水主要存在于毛細(xì)管中。重建的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)形成新的毛細(xì)管，部分不易流動(dòng)水轉(zhuǎn)變成自由水并存在于新產(chǎn)生的毛細(xì)管中，導(dǎo)致蛋白質(zhì)持水能力的下降。鮮牛肉中未檢測(cè)出自由水，這是由于為去除牛肉中的血水，牛肉鹵制前進(jìn)行出水處理。出水過(guò)程中，由于蛋白質(zhì)的變性及結(jié)構(gòu)收縮，牛肉中的自由水完全析出。

表3 牛肉鹵制過(guò)程中橫向弛豫時(shí)間T2Table 3 Transverse relaxation times T2 during processing of beef marinating

注：ND表示未檢出；同一列中上標(biāo)字母不同表示彼此間差異顯著(P<0.05)(下同)

2.4.2 牛肉鹵制過(guò)程中水分分布的變化

根據(jù)峰面積變化可以得到鹵制過(guò)程中不同狀態(tài)水分含量及遷移情況[24]。牛肉中水的總峰面積連續(xù)地顯著變小(P<0.05)，這與T22峰面積的變化趨勢(shì)一致(表4)。不易流動(dòng)水占牛肉中總水分含量的90%，所以總峰面積受T22峰面積的影響。鹵牛肉中結(jié)合水T21的峰面積明顯地高于未鹵制牛肉的(P<0.05)，鹵牛肉間結(jié)合水的峰面積幾乎無(wú)差異(P>0.05)。因蛋白質(zhì)水解而新暴露的親水基團(tuán)與新產(chǎn)生的肽促進(jìn)蛋白質(zhì)的水化作用[24]，導(dǎo)致牛肉中結(jié)合水的含量增大。T22的峰面積逐漸下降(P<0.05)，由于不易流動(dòng)水存在肌原纖維內(nèi)，牛肉中肌纖維蛋白在40～75 ℃時(shí)開(kāi)始變性，熱收縮導(dǎo)致肌纖維間距的減少，導(dǎo)致不易流動(dòng)水含量下降，蛋白質(zhì)持水能力的下降。T23的峰面積明顯地波動(dòng)(P<0.05)，150 min時(shí)達(dá)到最大值。不同狀態(tài)的水的比例因蛋白質(zhì)數(shù)量與性質(zhì)的不同而不同，導(dǎo)致鹵制過(guò)程中牛肉中結(jié)合水、不易流動(dòng)水和自由水的相對(duì)含量出現(xiàn)不規(guī)則變化，以及相對(duì)含量的變化趨勢(shì)有別于峰面積的變化。

2.5 牛肉鹵制過(guò)程中質(zhì)構(gòu)的變化

質(zhì)構(gòu)是表征牛肉的嫩度指標(biāo)之一。如表4所示，鹵制過(guò)程中牛肉的剪切力和硬度逐漸減小且差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明牛肉的嫩度越高。加熱使膠原蛋白的溶解度增大，肌束膜的膠原纖維受熱發(fā)生變性，破壞肌束膜結(jié)構(gòu)的完整性，結(jié)締組織被破壞，從而提高牛肉的嫩度。牛肉的黏性顯著性下降(P<0.05)。牛肉的黏性與強(qiáng)度隨著肌原纖維蛋白含量的降低而下降。牛肉的彈性和黏聚性略降低(P>0.05)。牛肉蛋白質(zhì)組分變化顯著影響肉的質(zhì)地。牛肉中結(jié)構(gòu)性蛋白主要為膠原蛋白、肌原纖維蛋白和肌球蛋白，蛋白質(zhì)的熱變性和降解改變其結(jié)構(gòu)，從而降低肌纖維的機(jī)械強(qiáng)度和的凝膠能力，導(dǎo)致肉的剪切力、硬度、黏性和黏聚性下降[25]。這些變化也形成鹵牛肉軟爛質(zhì)地口感。

表4 鹵制過(guò)程中牛肉水分的分布(mean±SD，n=3)Table 4 Corresponding relative populations during processing of beef marinating

表5 牛肉鹵制過(guò)程中質(zhì)構(gòu)變化Table 5 Change of texture during processing of beef marinating

注：同一列中上標(biāo)字母不同表示彼此間差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

蛋白質(zhì)的變性及降解使其含量與持水能力的下降，導(dǎo)致鹵制過(guò)程中牛肉中大量的水分析出到鹵汁中(P<0.05)。牛肉在鹵制過(guò)程中，NPN含量逐漸增大(P<0.05)，而水溶蛋白、鹽溶蛋白、堿溶蛋白及蛋白總量均顯著下降，與蛋白質(zhì)在熱的作用下大量降解產(chǎn)生肽和游離氨基酸并部分地溶于鹵汁中有關(guān)。鹵汁中的谷氨酸大量擴(kuò)散到牛肉中導(dǎo)致鹵牛肉中谷氨酸含量及游離氨基酸總量的顯著增大(P<0.05)。鹵制過(guò)程中，牛肉中的水分含量逐漸下降(P<0.05)。水分以結(jié)合水、不易流動(dòng)水和自由水的狀態(tài)在鹵牛肉均勻分布，不易流動(dòng)的水分自由度明顯高于結(jié)合水的(P<0.05)。鹵制過(guò)程中結(jié)合水緩慢下降(P>0.05)；不易流動(dòng)水的含量快速下降(P<0.05)，自由水的含量明顯地波動(dòng)(P<0.05)。鹵制后，牛肉的剪切力、硬度、黏性均明顯下降(P<0.05)，彈性和黏聚性均略下降(p>0.05)。這些變化促進(jìn)鹵制過(guò)程中鹵牛肉滋味、質(zhì)地特征的形成。