西花薊馬P450基因在繼代適應(yīng)菜豆植株中的應(yīng)答反應(yīng)

劉 利，郅軍銳，岳文波，謝 文，張 濤

(貴州大學(xué)昆蟲(chóng)研究所，貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲(chóng)害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025)

寄主植物和植食性昆蟲(chóng)在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一種相互對(duì)抗和彼此適應(yīng)的機(jī)制。被昆蟲(chóng)取食后，植物能產(chǎn)生防御反應(yīng)抵御植食性昆蟲(chóng)進(jìn)一步取食為害，植食性昆蟲(chóng)也能通過(guò)反防御機(jī)制適應(yīng)寄主植物的防御，確保種群的生存和繁衍(彭露等，2010；劉勇等，2011；禹海鑫等，2015)。細(xì)胞色素P450是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的超家族蛋白，除與害蟲(chóng)的抗藥性有關(guān)外(Schuler，2011；Mizutani and Masaharu，2012)，在外源有毒物質(zhì)如次生物質(zhì)的解毒以及寄主植物的適應(yīng)性中發(fā)揮著重要的作用(邱星輝，2014；陳澄宇等，2015；Liuetal.,2015a)。如煙粉虱Bemisiatabaci(謝文，2011)、二斑葉螨Tetranychusurticae(戴宇婷等，2012)、B型煙粉虱和Q型煙粉虱(楊金鍵等，2017)在取食不同寄主后，體內(nèi)細(xì)胞色素P450活性發(fā)生改變迅速適應(yīng)不同寄主。Peng等(2016)研究發(fā)現(xiàn)煙蚜Myzuspersicae的P450基因CYP6CY4 和CYP6CY3 的表達(dá)與次生物質(zhì)煙堿密切相關(guān)。Zhu等(2016)發(fā)現(xiàn)馬鈴薯葉甲Leptinotarsadecemlineata取食植物毒素和藥劑處理的馬鈴薯后，P450s基因表達(dá)上調(diào)，參與植物毒素和藥劑的代謝?；ń范舅匾部烧T導(dǎo)美洲棉鈴蟲(chóng)Helicoverpzea體內(nèi)P450s基因CYP6B8 和CYP321A1以及珀鳳蝶PapiliopolyxenesCYP6B1基因的表達(dá)(Petersenetal.,2001；Lietal.,2004)。

西花薊馬Frankliniellaoccidentalis是世界性的重要入侵害蟲(chóng)(Kirk and Terry，2003；Reitzetal.,2011)，除直接取食和產(chǎn)卵危害，還能傳播多種植物病毒，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失(謝永輝等，2013)。西花薊馬于2003年在北京首次報(bào)道其為害(張友軍等，2003)，隨后在中國(guó)各地?cái)U(kuò)散(呂要斌等，2011)，甚至西藏(王海鴻等，2013)、吉林(劉若思等，2015)和內(nèi)蒙古中西部地區(qū)(高振江等，2017)也有其危害的報(bào)道，這可能與其對(duì)環(huán)境和寄主強(qiáng)大的適應(yīng)能力有關(guān)。因此，探討西花薊馬對(duì)寄主植物的適應(yīng)性，對(duì)揭示其入侵、傳播和擴(kuò)散具有重要意義。

西花薊馬寄主植物廣泛，但對(duì)不同寄主的適應(yīng)性不同。菜豆是西花薊馬的嗜食寄主，但菜豆不同部位對(duì)西花薊馬的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖影響不同，西花薊馬對(duì)菜豆豆莢的嗜食性高于菜豆植株葉片(郅軍銳等，2010)。前人對(duì)西花薊馬適應(yīng)寄主植物機(jī)制的報(bào)道主要集中在其取食不同寄主(Jensenetal.,2000；劉建業(yè)等，2017)或不同誘導(dǎo)的寄主植物后蟲(chóng)體生理生化水平的變化(郅軍銳等，2016；蒲恒滸等，2018)，而西花薊馬代謝相關(guān)基因(如P450s)的應(yīng)答機(jī)制，及逐代適應(yīng)的調(diào)控模式尚不明確。本文在前人研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析了西花薊馬從菜豆豆莢轉(zhuǎn)換到菜豆植株適應(yīng)不同世代后，其2齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng)體內(nèi)CYP4基因和CYP6相關(guān)基因表達(dá)量的變化，為深入探討西花薊馬對(duì)寄主植物適應(yīng)機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試?yán)ハx(chóng)：西花薊馬為人工氣候箱中長(zhǎng)期繼代飼養(yǎng)(20代以上)的菜豆豆莢種群。條件為溫度25±1℃，相對(duì)濕度75%±5%，光周期14 h ∶10 h(L ∶D)。

供試植株：矮生菜豆Phaseolusvulgaris品種：金束鹿泰國(guó)地豆王(河北省辛集市盛農(nóng)種子公司)。于人工氣候室內(nèi)種植菜豆植株，條件為溫度25±1℃，相對(duì)濕度75%±5%，光周期14 h ∶10 h(L ∶D)。每營(yíng)養(yǎng)缽(直徑10 cm，高9 cm)培育兩株清潔苗，待菜豆長(zhǎng)至3～4真葉時(shí)，取長(zhǎng)勢(shì)一致的菜豆植株作為供試寄主植物。生長(zhǎng)期間不施用任何農(nóng)藥。

1.2 方法

1.2.1菜豆植株上不同世代西花薊馬的飼養(yǎng)及2齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng)的取樣

選取健康、長(zhǎng)勢(shì)一致的菜豆植株置于人工氣候室的養(yǎng)蟲(chóng)籠(86 cm×45 cm×41 cm)中，取菜豆豆莢上飼養(yǎng)的羽化后3 d并已交配的西花薊馬雌成蟲(chóng)接到菜豆植株上，24 h后剔除所接所有成蟲(chóng)，待西花薊馬產(chǎn)下的卵發(fā)育至2齡若蟲(chóng)階段，每個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)籠取200頭若蟲(chóng)為一個(gè)樣，放入1.5 mL離心管中，記為F1代2齡若蟲(chóng)，并立即用液氮冷凍后保存于-80℃冰箱中備用，同時(shí)保留一定若蟲(chóng)繼續(xù)在植株上飼養(yǎng)，至成蟲(chóng)階段后取成蟲(chóng)150頭放入1.5 mL離心管中，記為F1代成蟲(chóng)。

取F1代已交配的雌成蟲(chóng)，依照F1代相同的方法轉(zhuǎn)換到新的菜豆植株上，待發(fā)育到2齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng)后進(jìn)行取樣，分別記為F2代2齡若蟲(chóng)和F2代成蟲(chóng)。按照以上方法繼續(xù)取F3代2齡若蟲(chóng)和F3代成蟲(chóng)。每一個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)籠的薊馬為1個(gè)重復(fù)，共設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。以取食豆莢的西花薊馬2齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng)為對(duì)照，記為CK。

1.2.2西花薊馬總RNA的提取

參照Eastep? Super總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取西花薊馬2齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng)的總RNA，并保存于-80℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.3cDNA第一條鏈的合成

參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟合成cDNA第一條鏈，-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量(Realtime qPCR)分析

根據(jù)西花薊馬已克隆的5個(gè)CYP4基因(董紅剛等，2015)和EST數(shù)據(jù)庫(kù)中的4個(gè)CYP6基因CYP6-1(GQ290643)、CYP6-2(GQ29064)、CYP6-3(GT298397)和CYP6-4(GT298649)(謝志娟，2013)合成的qPCR特異性引物(見(jiàn)表1)，以西花薊馬EF-1作為內(nèi)參基因(Zhengetal.,2014)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

反應(yīng)在CFX96?實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-rad公司)上進(jìn)行。反應(yīng)體系10 μL：5.0 μL FastStart Essential DNA Green Master，正反向引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，DEPC水3 μL。程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min，95℃變性30 s、60℃退火和延伸30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。每次生物重復(fù)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)完成收集Ct值，分析溶解曲線。

1.3 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果采用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen，2001)進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。用Excel 2016和SPSS 19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，不同世代間差異性分析用Duncan氏多重比較，2齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng)間的差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

表1 RT-qPCR所用特異引物Table 1 Primers used in RT-qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 西花薊馬轉(zhuǎn)換到菜豆植株后體內(nèi)CYP4基因差異表達(dá)分析

對(duì)于CYP4基因，西花薊馬從菜豆豆莢轉(zhuǎn)換到菜豆植株后，2齡若蟲(chóng)體內(nèi)CYP4-1和CYP4-2的表達(dá)量變化相似，均是在F1代顯著升高，分別為對(duì)照的4.37倍和2.31倍，而在F2和F3代其表達(dá)量均下降但仍高于對(duì)照，且F2和F3代間無(wú)顯著差異。2齡若蟲(chóng)CYP4-3的表達(dá)量只有F1代顯著升高，其余世代與對(duì)照則無(wú)顯著差異。CYP4-4表達(dá)量?jī)H在F3代顯著高于對(duì)照，為對(duì)照的13.61倍，其余世代與對(duì)照無(wú)顯著差異；CYP4-5表達(dá)量的變化呈現(xiàn)先下降后上升的變化，在F2代達(dá)到最低值，僅為對(duì)照的44.62%，且F1與F3代表達(dá)量相當(dāng)，顯著低于對(duì)照，分別只有對(duì)照的73.04%和68.18%。

成蟲(chóng)體內(nèi)CYP4-1、CYP4-2和CYP4-3在F1代的表達(dá)量與對(duì)照相比均無(wú)顯著差異；而CYP4-1和CYP4-2的表達(dá)量在F2代顯著下降到最低，到F3代有所上升但仍顯著低于對(duì)照；CYP4-3的表達(dá)量則隨世代的增加逐漸降低；CYP4-4和CYP4-5的表達(dá)量在F1代顯著升高，而F2和F3代與F1代相比均顯著降低，且兩世代間差異不顯著，其中CYP4-4下降到對(duì)照的表達(dá)水平，而CYP4-5的表達(dá)量則顯著低于對(duì)照。

圖1 西花薊馬CYP4基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression levels of CYP4 gene in Frankliniella occidentalis注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，大寫(xiě)字母表示西花薊馬2齡若蟲(chóng)體內(nèi)CYP4基因表達(dá)量在不同世代間顯著差異；小寫(xiě)字母表示西花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)CYP4基因表達(dá)量在不同世代間的差異顯著性(Duncan氏多重比較，P<0.05)。*表示同一世代西花薊馬體內(nèi)CYP4基因的表達(dá)量在2齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng)之間存在顯著差異(t 檢驗(yàn)，P<0.05)。下圖同。Note:Data in the figure are expressed as mean±SE.Capital letters indicate significant differences at the level of 0.05 of gene expression in 2nd instar nymphs among different generations,while lowercase letters indicate significant differences at the level of 0.05 of gene expression in adults among different generations (Duncan’s multiple range test).* indicated that there were significant differences at the level of 0.05 between the 2nd instar nymphs and adults at the same generation (t test).The same for the following figures.

同一個(gè)基因的表達(dá)量在西花薊馬成蟲(chóng)與2齡若蟲(chóng)間不同。取食菜豆豆莢的西花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)CYP4-1和CYP4-2的表達(dá)量顯著高于2齡若蟲(chóng)，而CYP4-3、CYP4-4和CYP4-5的表達(dá)量相反，均顯著低于2齡若蟲(chóng)的。轉(zhuǎn)換到菜豆植株后只有CYP4-2在F1和F3代,以及CYP4-4和CYP4-5在F1代的西花薊馬2齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng)之間無(wú)顯著差異，其余CYP4基因在2齡若蟲(chóng)的表達(dá)量均顯著高于成蟲(chóng)。

2.2 西花薊馬轉(zhuǎn)換到菜豆植株后體內(nèi)CYP6基因差異表達(dá)分析

從豆莢轉(zhuǎn)換到菜豆植株后，西花薊馬2齡若蟲(chóng)體內(nèi)CYP6基因的表達(dá)量在不同世代間的變化不同。CYP6-1的表達(dá)量在取食菜豆植株后只有F2代顯著降低，而CYP6-2表達(dá)量只有在F3代才顯著升高；CYP6-3 的表達(dá)量在取食菜豆植株后均顯著低于對(duì)照，且在F2代最低；而CYP6-4的表達(dá)量只有在F1代才明顯升高。

轉(zhuǎn)換到菜豆植株后，西花薊馬成蟲(chóng)體內(nèi)CYP6-1、CYP6-2和CYP6-3的表達(dá)量變化相似，都是在F1代顯著下降，與對(duì)照相比分別降低了39.55%、39.54%和26.90%，且3個(gè)基因在F2和F3代間的表達(dá)量均無(wú)明顯差異，但均顯著低于F1代，CYP6-4的表達(dá)量在F1代顯著升高，但F2、F3代與對(duì)照無(wú)顯著差異。

西花薊馬從菜豆豆莢轉(zhuǎn)換到菜豆植株后，除CYP6-3的表達(dá)量在F1代的2齡若蟲(chóng)和成蟲(chóng)間差異不顯著外，在其余情況下均是2齡若蟲(chóng)體內(nèi)的表達(dá)量顯著高于成蟲(chóng)。

圖2 西花薊馬CYP6基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expressionlevels of CYP6 gene in Frankliniella occidentalis

3 結(jié)論與討論

細(xì)胞色素P450是一類由CYP基因編碼的多基因超家族酶(Werckreichhart and Feyereisen，2000；Feyereisen，2006)，對(duì)昆蟲(chóng)體內(nèi)多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的氧化代謝起著重要作用，涉及昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)、對(duì)植物毒素的耐受性和對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗藥性等(Scott and Wen，2001；Bonoetal.,2008)。本研究發(fā)現(xiàn)西花薊馬從嗜食性很高的菜豆豆莢轉(zhuǎn)換到嗜食性次之的菜豆植株后，2齡若蟲(chóng)體內(nèi)CYP4-1、CYP4-2、CYP4-3、CYP6-4和成蟲(chóng)體內(nèi)CYP4-4、CYP4-5、CYP6-4的表達(dá)量均在F1代顯著上升，以迅速適應(yīng)新的寄主。這可能是由于西花薊馬轉(zhuǎn)換到菜豆植株后，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生有毒次生物質(zhì)和防御蛋白，對(duì)西花薊馬產(chǎn)生不利影響(田甜等，2014；郅軍銳等，2016；岳文波等，2018)，從而導(dǎo)致其解毒酶基因發(fā)生不同的變化。前人也有類似的結(jié)果，如周新改(2011)發(fā)現(xiàn)煙粉虱轉(zhuǎn)換到新寄主甘藍(lán)后，蟲(chóng)體P450基因表達(dá)量上升。槲皮素、呋喃香豆素和花椒毒素等多種植物次生物質(zhì)也能夠誘導(dǎo)昆蟲(chóng)P450不同基因的表達(dá)(Lietal.,2004；Maoetal.,2009；陳澄宇等，2015)。彭天飛(2016)發(fā)現(xiàn)CYP6CY3 參與代謝次生物質(zhì)煙堿，其表達(dá)量與煙蚜寄主適應(yīng)性相關(guān)。棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera在次生物質(zhì)槲皮素誘導(dǎo)后，CYP337B1 和CYP6B6 表達(dá)量顯著升高(Liuetal.,2015b)。Yang等(2011)研究發(fā)現(xiàn)褐飛虱Nilaparvatalugens取食抗性品種水稻后，CYP6家族基因CYP6CS1和CYP6CW1 被顯著誘導(dǎo)。

西花薊馬2齡若蟲(chóng)體內(nèi)CYP4-1、CYP4-2、CYP4-3、CYP6-4和成蟲(chóng)體內(nèi)CYP4-4、CYP4-5、CYP6-1、CYP6-2、CYP6-3的表達(dá)量均在F2代之后達(dá)到穩(wěn)定，這與煙粉虱寄主轉(zhuǎn)換后體內(nèi)α-NA羧酸酯酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性在F2代基本穩(wěn)定的結(jié)果相呼應(yīng)(周福才等，2010)，這可能是由于昆蟲(chóng)轉(zhuǎn)換到新的寄主或食物后，逐漸適應(yīng)新的取食環(huán)境，致使生理調(diào)控達(dá)到平衡。而桃蚜取食蠶豆后CYP6a13和CYP6a14的表達(dá)量平衡點(diǎn)延遲，分別在第6和7代后才達(dá)到穩(wěn)定(朱經(jīng)云，2017)。P450表達(dá)量變化的差異可能與不同基因、昆蟲(chóng)種類和寄主種類有關(guān)。CYP4-5、CYP6-1、CYP6-3在2齡若蟲(chóng)期的表達(dá)量和CYP4-1、CYP4-2、CYP6-4在成蟲(chóng)期的表達(dá)量變化相似，除CYP6-1在F3代恢復(fù)到對(duì)照水平外，其他基因表達(dá)量在F3代時(shí)均低于對(duì)照，這說(shuō)明昆蟲(chóng)解毒酶基因在適應(yīng)取食新的寄主后，不同基因的表達(dá)存在特異性，彼此協(xié)調(diào)以迅速適應(yīng)新的環(huán)境。

本研究結(jié)果還顯示，西花薊馬轉(zhuǎn)換到菜豆植株除后CYP4-2的表達(dá)量在F1和F3代,以及CYP4-4、CYP4-5和CYP6-3的表達(dá)量在F1代兩個(gè)蟲(chóng)態(tài)間差異不顯著外，其余情況下均是2齡若蟲(chóng)體內(nèi)的表達(dá)量顯著高于成蟲(chóng)的，這可能由于2齡若蟲(chóng)取食量較成蟲(chóng)大，或是由于成蟲(chóng)需要節(jié)約能量進(jìn)行后代繁殖所致。前人的研究也表明P450基因在同一昆蟲(chóng)不同蟲(chóng)態(tài)體內(nèi)的表達(dá)量不同，周興隆等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，二斑葉螨抗性品系中CYP392E10和CYP392A6的表達(dá)量在若螨階段上調(diào)，成螨則不顯著，而CYP392A16的表達(dá)量各個(gè)發(fā)育階段都上調(diào)，CYP392D8則在除若螨外的其他階段都上調(diào)。煙粉虱噻蟲(chóng)嗪抗性品系中P450基因p_06013和p_00988在4齡若蟲(chóng)過(guò)量表達(dá)，而p_05916和p_00478表達(dá)量很低且在成蟲(chóng)期過(guò)量表達(dá)，p_00059和p_00428也在雌成蟲(chóng)階段過(guò)量表達(dá)(楊妮娜等，2016)。可見(jiàn)環(huán)境脅迫能明顯影響昆蟲(chóng)不同發(fā)育階段P450基因的表達(dá)量，并且因基因、蟲(chóng)態(tài)和環(huán)境而異。

本研究探討了P450基因在西花薊馬豆莢種群轉(zhuǎn)換到菜豆植株后逐代適應(yīng)中的作用，為進(jìn)一步研究西花薊馬的適應(yīng)性提供了依據(jù)。但寄主植物和植食性昆蟲(chóng)的相互作用十分復(fù)雜，不同食物的“口感”、營(yíng)養(yǎng)成分以及植物的防御反應(yīng)(植物次生物質(zhì)的種類和濃度等)等都會(huì)對(duì)昆蟲(chóng)造成不同影響，昆蟲(chóng)可通過(guò)取食行為、生長(zhǎng)發(fā)育、生理生化及分子防御等以適應(yīng)不同寄主(彭露等，2015)。因此西花薊馬對(duì)寄主的適應(yīng)機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探討。