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    冬蟲夏草與產(chǎn)地植物及土壤的重金屬含量測定

    2020-05-11 10:04:40丘雪紅韓日疇
    環(huán)境昆蟲學(xué)報 2020年2期
    關(guān)鍵詞:冬蟲夏草菌液金屬元素

    丘雪紅,曹 莉,韓日疇

    (廣東省生物資源應(yīng)用研究所,廣東省動物保護(hù)與資源利用重點實驗室,廣東省野生動物保護(hù)與利用公共實驗室,廣州 510260)

    冬蟲夏草Ophiocordycepssinensis是冬蟲夏草菌侵染蝙蝠蛾科昆蟲的幼蟲而形成的幼蟲尸體與真菌子座的復(fù)合體(Sungetal.,2007);是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材,我國傳承千年、滋補一生的藥食兩用佳品,與人參、鹿茸并稱“中藥三大寶”?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)證明,冬蟲夏草富含生物活性成分,包括核苷類、多糖類、糖醇類、蟲草甾醇類等(Cohenetal.,2014;Zhaoetal.,2014;Liuetal.,2015b;Zhangetal.,2017;Chenetal.,2018);對實驗動物安全(Fungetal.,2017);具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂等功效(Maetal.,2018;Sheuetal.,2018;Wangetal.,2018;Yangetal.,2018);在醫(yī)藥、食品以及現(xiàn)代生物技術(shù)等方面具有廣泛的應(yīng)用。同時,冬蟲夏草又是許多珍貴藥用活性成分的重要原料庫(Esteban,2007;張姝等,2013;Lietal.,2019)。野生冬蟲夏草已被列為國家二級保護(hù)植物(CITES Management Authority of China and China Customers,2000)。為了保護(hù)青藏高原生態(tài)及冬蟲夏草野生資源,同時又能讓冬蟲夏草更好地為人類健康服務(wù),目前采用兩條途徑:一是研發(fā)替代品,如冬蟲夏草菌和蛹蟲草菌絲培養(yǎng)物;二是冬蟲夏草子實體甚至蟲菌復(fù)合體的人工培養(yǎng)(丘雪紅等,2016;Lietal.,2019)。目前,等同野生的人工培育冬蟲夏草技術(shù)業(yè)已建立(Caoetal.,2015;丘雪紅等,2016;Lietal.,2019)。

    過量的重金屬危害生態(tài)環(huán)境,并通過食物鏈積累于人體,威脅健康。近年來冬蟲夏草的重金屬含量一直備受關(guān)注,業(yè)已報道了冬蟲夏草重金屬的測定方法(陳輝,2010)、化學(xué)形態(tài)(陳煒等,2015)、不同部位的分布情況(周利等,2017)、不同產(chǎn)地冬蟲夏草重金屬含量比較(陳蓉等,2018b)、人工與野生冬蟲夏草重金屬含量比較(劉杰等,2016)、砷種類及其風(fēng)險評估(孫鵬飛等,2017;Guoetal.,2018;Zhouetal.,2018;Zuoetal.,2018)以及產(chǎn)地土壤重金屬分析(陳蓉等,2018a)。不同產(chǎn)地和培養(yǎng)系統(tǒng)的冬蟲夏草或冬蟲夏草菌重金屬含量有別。顯然,這些差別也與產(chǎn)地植物、產(chǎn)地土壤有關(guān)。

    本文測定了野生采集和人工培育冬蟲夏草、人工培育冬蟲夏草子實體、冬蟲夏草發(fā)酵菌液、冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾昆蟲食物(蕨麻Potentillaanserine塊根和珠芽蓼Polygonumviviparum種子),以及野生冬蟲夏草產(chǎn)地土壤中5種重金屬元素(銅Cu、鉛Pb、砷As、鎘Cd、汞Hg)的含量,以期更全面地確定影響冬蟲夏草重金屬含量的因素。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    野生冬蟲夏草購于四川省康定市產(chǎn)地,樣品由蟲體與子座組成;蟲體似蠶,呈黃棕色,分頭部、胸節(jié)和腹節(jié),頭部呈紅棕色;子座呈灰棕色;樣品的形狀、大小和顏色等與參考文獻(xiàn)基本一致(陳小秋等,2011;Auetal.,2012;康帥等,2013),符合標(biāo)準(zhǔn)冬蟲夏草特征;樣品子座部分以ITS序列(internal transcribed spacer)(Liuetal.,2002)、蟲體部分以COI序列(cytochrome coxidase)和Cytb序列(cytochrome b)(Zhangetal.,2014)進(jìn)行分子鑒定后進(jìn)一步確定為冬蟲夏草。人工培育的冬蟲夏草(即以冬蟲夏草菌人工感染蝠蛾幼蟲形成的蟲菌子實體)由本實驗室培育(曹莉等,2014a)。冬蟲夏草子實體于人工培養(yǎng)基上培育獲得(曹莉等,2014b),其培養(yǎng)基組分如大米和小麥購自廣州勝佳超市,蠶蛹粉購自廣東信達(dá)繭絲綢股份有限公司。冬蟲夏草液體發(fā)酵菌液以PPDA(添加10克蛋白胨的PDA培養(yǎng)基)培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)獲得。冬蟲夏草寄主蝙蝠蛾昆蟲的食物蕨麻塊根、珠芽蓼種子購買于冬蟲夏草產(chǎn)地四川省康定市。產(chǎn)地土壤采集于四川省康定市、青海省貴德縣、青海省河南縣。

    1.2 樣品處理

    野生采集和人工培育冬蟲夏草、人工培育冬蟲夏草子實體、冬蟲夏草發(fā)酵菌液于真空冷凍干燥儀(Alpha 1-2 LD plus,德國)中冷凍干燥至恒重。用軟毛刷盡量去除野生冬蟲夏草與人工冬蟲夏草表面的土壤或雜質(zhì)。干燥后的冬蟲夏草樣品以高通量球磨儀GT100(1 000 rpm,3 min)在冷凍條件下研磨成粉,密封保存于-80℃。

    蕨麻塊根、珠芽蓼種子從產(chǎn)地采集回來后保存于4℃,實驗前于45℃干燥至恒重,去除表面泥土或雜質(zhì)后研磨至粉狀,過60目篩(孔徑300 μm)后密封保存于-20℃。

    產(chǎn)地土壤于45℃干燥至恒重,去除石子、動植物殘體等異物后研磨至粉狀,過60目篩(孔徑300 μm)后密封保存于-20℃。

    1.3 重金屬含量測定

    野生冬蟲夏草、人工培育冬蟲夏草、人工培育冬蟲夏草子實體、冬蟲夏草發(fā)酵菌液、寄主昆蟲食物(蕨麻塊根、珠芽蓼種子)的5種重金屬元素(銅Cu、鉛Pb、砷As、鎘Cd、汞Hg)含量及培養(yǎng)基原料大米、小麥、蠶蛹粉的鎘、銅含量均采用微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)測定(Zhouetal.,2018)。產(chǎn)地土壤的銅、鉛、鎘含量采用ICP-MS方法測定(陳蓉等,2018a),砷、汞含量采用原子熒光光度法測定(劉成等,2016)。所有測定均委托廣東省測試分析研究所(中國廣州測試中心)完成。每樣品每元素含量測定重復(fù)3次。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 冬蟲夏草樣品及寄主昆蟲食物的重金屬元素含量

    野生冬蟲夏草、人工培育冬蟲夏草、人工培育冬蟲夏草子實體、冬蟲夏草發(fā)酵菌液、寄主昆蟲食物(蕨麻塊根、珠芽蓼種子)的5種重金屬元素含量見表1。結(jié)果顯示,人工冬蟲夏草、人工培育冬蟲夏草子實體、冬蟲夏草發(fā)酵菌液、蕨麻塊根、珠芽蓼種子所測定的5種重金屬元素含量符合《中醫(yī)藥-中藥材重金屬限量》ISO國際標(biāo)準(zhǔn);而野生冬蟲夏草,除砷含量(6.170 mg/kg)超標(biāo)外,銅、鉛、鎘、汞元素含量均符合要求。

    表1 冬蟲夏草及其寄主昆蟲食物的重金屬元素含量Table 1 The content of heavy metals in Ophiocordyceps sinensis and the natural food of its host insect

    按《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》,除野生冬蟲夏草砷含量(6.170 mg/kg),冬蟲夏草菌子實體鎘含量(0.390 mg/kg)超標(biāo)外,其余測定值均符合要求。人工培育冬蟲夏草與冬蟲夏草發(fā)酵菌液的5種金屬元素含量均低于野生冬蟲夏草;人工培育冬蟲夏草子實體除銅、鎘含量高于野生冬蟲夏草外,其余3種元素含量均低于野生冬蟲夏草。人工培育冬蟲夏草中未檢測出鉛元素,冬蟲夏草發(fā)酵菌液中未檢測出汞元素。

    2.2 冬蟲夏草產(chǎn)地土壤的重金屬元素含量

    冬蟲夏草產(chǎn)地土壤的金屬元素含量見表2。結(jié)果顯示,按國家標(biāo)準(zhǔn)《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險管控標(biāo)準(zhǔn)(試行)》(GB 1516-2018),四川產(chǎn)地土壤KDX與青海貴德縣產(chǎn)地土壤GD、河南縣產(chǎn)地土壤HN的5種重金屬含量均低于農(nóng)用土壤污染風(fēng)險篩選值;而四川產(chǎn)地土壤KDT,除鎘含量(0.923 mg/kg)高于風(fēng)險篩選值而低于風(fēng)險管制值外,其余4種元素含量均低于風(fēng)險篩選值。按原《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 1516-1995),青海省河南縣土壤的5種金屬元素含量符合一級標(biāo)準(zhǔn);四川康定土壤KDX除鎘含量符合二級標(biāo)準(zhǔn)外,其余4種元素符合一級標(biāo)準(zhǔn);四川康定土壤KDT的銅、砷、汞含量符合一級標(biāo)準(zhǔn),鉛含量符合二級標(biāo)準(zhǔn),鎘含量則符合三級標(biāo)準(zhǔn);青海省貴德縣土壤的銅、鉛、砷含量符合一級標(biāo)準(zhǔn),鎘、汞含量符合二級標(biāo)準(zhǔn)。

    對比4個產(chǎn)地土壤的重金屬含量,鉛、鎘含量最高的樣品均為四川康定土壤KDT,分別為61.833 mg/kg與0.923 mg/kg;而銅、砷、汞含量最高的樣品均為青海省貴德縣土壤,分別為28.067 mg/kg、8.847 mg/kg、0.215 mg/kg;青海省兩個產(chǎn)地土壤的砷、銅含量高于四川康定的兩個土壤。

    表2 冬蟲夏草產(chǎn)地土壤重金屬含量Table 2 The content of heavy metals in habitat soil of natural Ophiocordyceps sinensis

    2.3 冬蟲夏草培養(yǎng)材料的鎘、銅含量

    冬蟲夏草培養(yǎng)材料大米、小麥、蠶蛹粉的鎘、銅含量見表3。結(jié)果顯示,3種培養(yǎng)原料的鎘含量均較低,大米與小的麥的銅含量分別為2.210、1.800 mg/kg,而蠶蛹粉的銅含量則相對較高(10.600 mg/kg)。

    表3 冬蟲夏草培養(yǎng)材料(大米、小麥、蠶蛹粉)的鎘和銅含量Table 3 The content of Cd and Cu in culture materials of Ophiocordyceps sinensis (rice,wheat,silkworm pupa powder)

    3 結(jié)論與討論

    按《中醫(yī)藥-中藥材重金屬限量》ISO國際標(biāo)準(zhǔn),野生冬蟲夏草大多存在砷超標(biāo)問題。劉杰等(2016)所測的26批野生冬蟲夏草中20批砷超標(biāo),砷含量均值6.877 mg/kg;周利等(2017)所測的17批冬蟲夏草砷超標(biāo)率88.24%;盧恒等(2017)所測的北京市售的15批來源不同共45個冬蟲夏草樣品中,砷含量超標(biāo)率100%;如按《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》,則以上樣品砷超標(biāo)率100%。除砷含量超標(biāo)外,野生冬蟲夏草的銅、鉛、砷、鎘、汞含量一般符合要求。本文所測定的野生冬蟲夏草同樣存在砷含量超標(biāo)問題,砷含量達(dá)6.170 mg/kg,而其他4種元素均低于標(biāo)準(zhǔn)的限量值。

    相對于野生冬蟲夏草,人工培育冬蟲夏草或冬蟲夏草發(fā)酵物在重金屬方面的安全性容易控制。本研究測定的人工冬蟲夏草、冬蟲夏草發(fā)酵菌液的銅、鉛、砷、鎘、汞含量均明顯低于野生冬蟲夏草;冬蟲夏草子實體除銅、鎘含量高于野生冬蟲夏草外,其余3種元素含量均低于野生冬蟲夏草。在人工冬蟲夏草未檢測出鉛元素,在冬蟲夏草發(fā)酵菌液未檢測出汞元素。鑒于野生冬蟲夏草與人工冬蟲夏草的砷含量差異,砷含量可作為鑒定野生冬蟲夏草與人工冬蟲夏草的標(biāo)記物(Guoetal.,2018a)。本研究發(fā)現(xiàn)寄主蝙蝠蛾昆蟲的天然食物蕨麻塊根、珠芽蓼種子的重金屬含量均較低。由此推測野生冬蟲夏草的砷可能非來源于寄主昆蟲的食物,而可能來源于其生存環(huán)境如土壤;野生冬蟲夏草砷含量高也可能與其自身的砷富集特性相關(guān)。前面的研究也表明野生冬蟲夏草中的砷含量與其產(chǎn)區(qū)土壤的砷含量呈正相關(guān)關(guān)系(Zuoetal.,2013)。

    野生冬蟲夏草砷含量超標(biāo)問題引起了研究者的廣大關(guān)注。近年來,研究者對冬蟲夏草中的砷元素種類、形態(tài)、可能的來源、潛在的風(fēng)險等方面展開了研究。研究表明,野生冬蟲夏草的砷主要集中在蟲體部分(周利等,2017;Zhouetal.,2018);砷主要以未知有機砷(91.7%~94.0%)為主,含少量無機砷(砷甜菜堿AsB:1.4%~2.9%;砷酸鹽AsV:1.3%~3.2%;亞砷酸鹽AsIII:4.1%~6.0%),未檢測到有機砷:一甲基砷(MMAV)和二甲基砷(DMAV);未知有機砷具有毒性的可能性不大(Guoetal.,2018b)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,在合理的食用量下,野生冬蟲夏草的重金屬不會對人類健康造成明顯的風(fēng)險(Zhouetal.,2018;Guoetal.,2018b);但也有學(xué)者卻認(rèn)為,野生冬蟲夏草含無機砷和其他未知危險性的砷化合物,當(dāng)每年食用時間大于3個月時存在致癌風(fēng)險,建議每年野生冬蟲夏草的食用時間為2個月(Zouetal.,2018)。因此,冬蟲夏草砷的來源、未知砷種類以及動物毒性仍是急需探明的問題。

    本研究發(fā)現(xiàn),冬蟲夏草子實體的鎘含量達(dá)0.390 mg/kg,銅含量19.733 mg/kg,盡管均符合《中醫(yī)藥-中藥材重金屬限量》國際標(biāo)準(zhǔn),但鎘含量超出了《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》的限量值0.3 mg/kg,銅含量也接近綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)限量值20 mg/kg。為探究這兩元素的來源,本文測定了培養(yǎng)材料大米、小麥、蠶蛹粉的銅、鎘含量。結(jié)果顯示,除蠶蛹粉的銅含量較高外,其余測定值均較低,說明冬蟲夏草子實體對銅、鎘的富集能力較強。大型真菌包括許多食用菌普遍具有富集重金屬的特性,重金屬的積累受到環(huán)境(如生長基質(zhì)中的金屬含量、酸度、有機質(zhì)含量等)和真菌自身因素的影響(Garciaetal.,1998;Melgaretal.,2016)。為避免食用菌在重金屬方面給人類健康帶來風(fēng)險,在食用菌栽培時我們應(yīng)該選用無重金屬污染的培養(yǎng)原材料及重金屬富集能力弱的菌株。

    本文研究了不同來源冬蟲夏草、冬蟲夏草產(chǎn)地植物、產(chǎn)地土壤及培養(yǎng)材料的重金屬含量,為全面確定冬蟲夏草重金屬含量的影響因素和人工培育冬蟲夏草的質(zhì)量控制提供了參考。

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