仙靈骨葆同方提取物的肝細(xì)胞毒性研究

藺紅偉，江春霞，陸文銓，樸淑娟

(海軍軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200003)

仙靈骨葆膠囊的處方由淫羊藿、續(xù)斷、丹參、知母、補(bǔ)骨脂、地黃共6味中藥材組成[1]。該制劑是一味相對成熟的中藥成方制劑。近年來國內(nèi)出現(xiàn)多起仙靈骨葆膠囊導(dǎo)致急性肝損傷的藥品不良反應(yīng)事件，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受到嚴(yán)重影響[2-4]，故針對該藥的肝毒性研究具有重要臨床意義。為了篩查出該藥導(dǎo)致急性肝損傷的主要成分，不僅需要全方的膠囊制劑，更需要針對不同組成的缺方或單方制劑進(jìn)行研究。故在仙靈骨葆膠囊企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的指導(dǎo)下[5-6]，作者所在的研究室制備了仙靈骨葆相同處方相同提取工藝的全方、缺方和各單方提取物，以肝細(xì)胞毒性為指標(biāo)，評價(jià)該方劑及其中各種成分藥對肝細(xì)胞的增殖抑制，初步闡釋毒性成分，以期為前瞻性地發(fā)現(xiàn)其肝毒性和其他藥品不良反應(yīng)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；超凈臺(上海上凈凈化設(shè)備有限公司)；取樣槍(美國Gilson公司)；培養(yǎng)皿和試管(美國Corning公司)；顯微鏡(重慶重光實(shí)業(yè)有限公司)；離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；高壓滅菌鍋(日本Tomy Digital Biology公司)；96孔板(美國Corning Costar公司)；酶標(biāo)儀(美國 BioTek公司)。

1.2 藥品和試劑 淫羊藿(批號20140301)、續(xù)斷(批號20140907)、丹參(批號20141010)、知母(批號20140701)、補(bǔ)骨脂(批號20140407)、生地黃(批號20140608)均購自河南銅陵和田中藥飲片有限公司；人肝癌Hep3B細(xì)胞(中國科學(xué)院上海研究院細(xì)胞庫)；專用培養(yǎng)基(MEM-1X，批號1616033)、0.25%胰酶沖洗液(Trypsin-EDTA-1X，批號20601113)、10%胎牛血清(批號1614021)、CCK-8試劑盒(批號1610023)均購自美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(pH 7.4，批號E40205，上海博光生物科技有限公司)； FCCP(純度>98%，批號370-86-5，美國Sigma公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 樣品的制備 依照仙靈骨葆膠囊的處方配比，精密稱取淫羊藿583.5 g、續(xù)斷83.5 g、丹參41.5 g、知母41.5 g、補(bǔ)骨脂41.5 g、地黃41.5 g，制備全方提取物。(1)丹參藥材粉碎成細(xì)粉，過篩，備用。(2)將淫羊藿、續(xù)斷、知母、補(bǔ)骨脂藥材粉碎成粗粉，地黃切成薄片。加水煎煮3次，第1次3 h，第2次2 h，第3次1 h，合并煎液，濾過，將濾液濃縮至相對密度為1．20(50 ℃)的清膏。(3)加入丹參細(xì)粉，混勻，干燥，得干膏。其他缺方和單方提取物，除丹參藥材直接磨成細(xì)粉，過篩備用外，均按照上述(2)項(xiàng)方法分別制備。

2.2 溶液的配制 (1)全方或缺方樣品溶液：分別精密稱取全方提取物72.46 mg、缺淫羊藿提取物76.30 mg、缺續(xù)斷提取物76.74 mg、缺丹參提取物76.78 mg、缺知母提取物77.94 mg、缺補(bǔ)骨脂提取物72.57 mg、缺地黃提取物77.56 mg，加10% 二甲亞砜(DMSO) 5 ml，超聲提取60 min，分別用配制好的培養(yǎng)液稀釋成梯度濃度的全方或缺方樣品溶液。(2)單方樣品溶液：精密稱取淫羊藿提取物64.11 mg、續(xù)斷提取物51.73 mg、丹參提取物113.69 mg、知母提取物63.41 mg、補(bǔ)骨脂提取物16.02 mg、地黃提取物40.26 mg，分別置10 ml離心管中，各加10%DMSO 1 ml，超聲提取60 min，用配制好的培養(yǎng)液稀釋成5 ml溶液，再分別用培養(yǎng)液稀釋成梯度濃度的單方樣品溶液。(3)陽性對照樣品溶液：精密稱取陽性對照藥FCCP 0.74 mg，置10 ml容量瓶中，加1 ml DMSO溶解，再用配制好的培養(yǎng)液稀釋至刻度，于4 ℃儲存。

2.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的Hep3B細(xì)胞[7]，以1×105個(gè)/孔(每孔100 μl)接種于96孔板上，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待24 h細(xì)胞完全貼壁。按照樣品組、空白對照組、溶媒組和陽性對照組分別加入相應(yīng)的樣品溶液各10 μl，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔分別加入CCK-8試劑10 μl，再放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm下測定吸光度(A)。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=(A樣品-A空白對照)/(A溶媒-A空白對照)×100%。用GraphPad Prism 6軟件計(jì)算細(xì)胞毒性體外模型的半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

2.4 全方和各缺方提取物的IC50值 本研究得到全方和各缺方提取物作用下的細(xì)胞存活率,見表1。進(jìn)一步通過陽性對照藥物FCCP[7]驗(yàn)證該細(xì)胞模型并獲得量效參考值，測得全方提取物、缺淫羊藿提取物、缺續(xù)斷提取物、缺丹參提取物、缺知母提取物、缺補(bǔ)骨脂提取物和缺地黃提取物的IC50值分別為153.2、312.2、217.1、256.5、229.6、246.9和259.4 μg/ml。由此可見，全方提取物的IC50值明顯較低，表明該處方在臨床應(yīng)用階段表現(xiàn)出來的肝毒性是有一定的物質(zhì)基礎(chǔ)的，同時(shí)也提示該制劑中存在可能導(dǎo)致肝毒性的成分，有必要對其進(jìn)行篩選。各缺方提取物IC50差異不顯著，但是和溶媒組進(jìn)行對比，已表現(xiàn)出非常明確的細(xì)胞毒性，需要通過對各單方提取物的細(xì)胞毒性進(jìn)一步確認(rèn)，才可以明確仙靈骨葆的肝毒性物質(zhì)。

2.5 各單方提取物的IC50值 本研究進(jìn)一步考察了各單方提取物作用下的細(xì)胞存活率，見表2，并計(jì)算相應(yīng)的IC50值。測得淫羊藿提取物、續(xù)斷提取物、丹參提取物、知母提取物、補(bǔ)骨脂提取物和地黃提取物的IC50值分別為91.77、179.0、410.6、307.9、73.22和180.2 μg/ml。結(jié)果表明，淫羊藿提取物和補(bǔ)骨脂提取物的IC50值明顯低于其他成分提取物，說明仙靈骨葆處方中這兩味藥是引發(fā)肝毒性的主要成分，需要針對這兩味藥的肝毒性做進(jìn)一步研究，明確了后續(xù)研究的方向。

表1 不同濃度的仙靈骨葆全方和缺方提取物的肝細(xì)胞毒性Table 1 Hepatotoxicity in different concentrations of Xianling Gubao extract and its ingredients omission extracts (n=6，±s)

3 討 論

本研究從細(xì)胞層面對仙靈骨葆全方、各缺方和相應(yīng)單方的肝毒性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)淫羊藿和補(bǔ)骨脂是仙靈骨葆產(chǎn)生肝細(xì)胞毒性的主要成分。這為后續(xù)仙靈骨葆處方中毒性物質(zhì)的篩選明確了方向，可以針對淫羊藿和補(bǔ)骨脂這兩個(gè)單方提取物進(jìn)行深入研究。關(guān)于補(bǔ)骨脂造成肝損傷的案例已有相關(guān)報(bào)道[8]，并且也有了大量相關(guān)的肝毒性研究。周昆等[9]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂的主要活性成分異補(bǔ)骨脂素作用于HepG2 細(xì)胞24 h 后，其IC50值為118.1 μmol/L，證實(shí)了補(bǔ)骨脂的肝細(xì)胞毒性。但是關(guān)于淫羊藿肝細(xì)胞毒性的相關(guān)數(shù)據(jù)尚未得到大量的文獻(xiàn)支持，仍需更多的實(shí)驗(yàn)加以確證。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)篩選出仙靈骨葆處方中的主要毒性成分，為后續(xù)的體內(nèi)藥物毒性研究打下了基礎(chǔ)，也為指導(dǎo)仙靈骨葆膠囊的臨床合理用藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

表2 不同濃度的仙靈骨葆各單方提取物的肝細(xì)胞毒性Table 2 Hepatotoxicity in different concentrations of each single extract of Xianling Gubao (n=6，±s)