尾巨桉EugNAC007基因的克隆與功能分析

何沙娥，歐陽(yáng)林男，楊嘉麒，鄭嘉琪，陳少雄

尾巨桉基因的克隆與功能分析

何沙娥，歐陽(yáng)林男，楊嘉麒，鄭嘉琪，陳少雄*

（中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院速生樹(shù)木研究所，廣東 湛江 524022）

為挖掘桉樹(shù)木材形成重要NAC轉(zhuǎn)錄因子，以尾巨桉DH32-29的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，克隆了一個(gè)桉樹(shù)NAC基因，并對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究。序列分析表明：編碼序列全長(zhǎng)1 711 bp，預(yù)測(cè)編碼蛋白含569個(gè)氨基酸，分子量為64.32 KD，定位于細(xì)胞核。EugNAC007蛋白在N端具有一個(gè)典型的NAC結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明EugNAC007蛋白與擬南芥中調(diào)控細(xì)胞分裂的AtNTM1親緣關(guān)系較近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示在木質(zhì)部中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。在楊樹(shù)中過(guò)表達(dá)該基因抑制了植株株高生長(zhǎng)。推測(cè)可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞分裂的形式參與木材形成過(guò)程，但具體作用途徑和機(jī)制待進(jìn)步一研究。該研究為深入挖掘桉樹(shù)木材形成相關(guān)重要NAC轉(zhuǎn)錄因子提供參考。

桉樹(shù)；NAC轉(zhuǎn)錄因子；基因克??；基因功能

木材（次生木質(zhì)部）是十分重要的可再生資源。轉(zhuǎn)錄因子在木材形成過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，鑒定和揭示木材形成相關(guān)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子具有重要意義。NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其命名取自矮牽牛（）轉(zhuǎn)錄因子NAM（NO APICAL MERISTEM）和擬南芥（）轉(zhuǎn)錄因子ATAF1（ARABIDOPSIS TRANSCRIPTION ACTIVATOR FACTOR 1）、ATAF2以及CUC2（CUP-SHAPED COTYLEDON 2）的首寫(xiě)字母，其N-末端含有一個(gè)高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域，約150 ～ 160個(gè)氨基酸殘基，C-末端含有高度多樣性的轉(zhuǎn)錄激活功能域[1-2]。NAC轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育以及植物次生生長(zhǎng)等過(guò)程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。

迄今已經(jīng)克隆了多個(gè)木材形成相關(guān)的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，它們廣泛參與了形成層細(xì)胞分裂、木質(zhì)部細(xì)胞分化及次生壁合成等木材形成相關(guān)事件的發(fā)生。YANG等[3]發(fā)現(xiàn)，擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子X(jué)VP（PRECOCIOUS XYLEM DIFFERENTIATION AND ALTERED VASCULAR PATTERNING）控制木質(zhì)部細(xì)胞分化和形成層細(xì)胞分裂的平衡。由韌皮部產(chǎn)生的短肽分子TDIF（TRACHEARY ELEMENT DIFFERENTIATION INHIBITORY FACTOR）轉(zhuǎn)移到形成層區(qū)域后與受體PXY（PHLOEM INTERCALATED WITH XYLEM）結(jié)合，上調(diào)下游轉(zhuǎn)錄因子（）基因的表達(dá)水平，促進(jìn)形成層細(xì)胞分裂[4]，而XVP能與TDIF共受體BAK1（BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1- ASSOCIATED KINASE1）結(jié)合，抑制TDIF-PXY信號(hào)輸出，使基因表達(dá)水平降低，減少形成層細(xì)胞分裂，同時(shí)上調(diào)次生壁合成NAC轉(zhuǎn)錄因子（）的表達(dá)水平，促進(jìn)木質(zhì)部形成[3]。

目前認(rèn)為木質(zhì)部細(xì)胞次生壁合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在維管植物中相對(duì)保守[5]。在這個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，次生壁合成NAC（Secondary wall-associated NAC, SWN）轉(zhuǎn)錄因子是整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的頂層開(kāi)關(guān)元件。以CHEN等[6]報(bào)道的毛果楊（）細(xì)胞壁合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為例，包含了4個(gè)層級(jí)，由18個(gè)轉(zhuǎn)錄因子和27個(gè)細(xì)胞壁成分合成基因組成，木質(zhì)部發(fā)育相關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子（Wood-associated NAC transcription factor, WND）（）位于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)最上層，是該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的主控開(kāi)關(guān)，、、和位于第三層級(jí)，其中可直接調(diào)控下游的木質(zhì)素單體合成基因。其他樹(shù)種中木質(zhì)部發(fā)育相關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子如桉樹(shù)（spp.）中的云杉（）中的-也已被鑒定[5,7]。雖然多數(shù)報(bào)道顯示木質(zhì)部形成轉(zhuǎn)錄調(diào)控在不同物種中表現(xiàn)保守，但仍存在差別。如巨桉（）在木材形成過(guò)程中作為正調(diào)控因子參與木質(zhì)素的合成，而其在擬南芥中的同源基因則是負(fù)調(diào)控葉片衰老，且并未參與木質(zhì)部發(fā)育調(diào)控[8]。

桉樹(shù)生長(zhǎng)迅速，是紙漿、造紙、膠合板、生物質(zhì)能源及其他木質(zhì)纖維素原材料的主要來(lái)源，為我國(guó)木材資源供給做出了重要貢獻(xiàn)[9]。HUSSEY等[10]對(duì)巨桉（）基因組分析獲得了189個(gè)Cs，組織表達(dá)分析表明、、、和可能參與了木質(zhì)化過(guò)程，但是這些成員并非已報(bào)道的擬南芥木質(zhì)化過(guò)程相關(guān)基因（如、、、及）的同源基因，說(shuō)明桉樹(shù)可能存在一些與擬南芥中功能不同的木材形成相關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子成員。為獲得更多重要的桉樹(shù)木材形成相關(guān)NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，本課題組通過(guò)對(duì)不同種植密度下尾巨桉（×）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)水平在主莖生長(zhǎng)量顯著增加的木質(zhì)部中明顯升高。本研究克隆了該基因，并通過(guò)生物信息學(xué)分析、組織表達(dá)及轉(zhuǎn)基因開(kāi)展基因功能研究，以期為深入挖掘桉樹(shù)木材形成相關(guān)重要NAC轉(zhuǎn)錄因子提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

本試驗(yàn)所用植物材料為盆栽3月齡尾巨桉DH32-29無(wú)性系苗，平均直徑6.84 mm（于主莖基部10 cm處測(cè)量），平均株高65.72 mm。分別取頂端、第一節(jié)間至第七節(jié)間的木質(zhì)部，迅速置于液氮凍存。每個(gè)樣本由5個(gè)植株混樣組成。使用EASYspin/EASYspin Plus植物RNA提取試劑盒提取RNA（北京愛(ài)博森生物科技有限公司）；采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TRUEscript RT MasterMix（北京愛(ài)博森生物科技有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 基因克隆與載體構(gòu)建

根據(jù)三代測(cè)序數(shù)據(jù)獲得的轉(zhuǎn)錄本序列，設(shè)計(jì)基因特異引物（表1），利用Q5高保真DNA聚合酶（New England Biolabs，M0491）從尾巨桉DH32-29無(wú)性系木質(zhì)部cDNA中擴(kuò)增目標(biāo)基因序列。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為50 μL，其中滅菌水18.5 μL，5 × Q5反應(yīng)緩沖液10 μL，5 × Q5 High GC Enhancer 10 μL，Q5 超保真DNA聚合酶0.5 μL，正、反向引物各2.5 μL（10 mM），dNTPs（10 mM）1 μL，cDNA模板5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性30 s，98 ℃變性10 s，65 ℃復(fù)性15 s，72 ℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。

表1 引物信息表

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后純化回收（天根DNA純化膠回收試劑盒DP214）。使用Hieff Clone Plus One Step Cloning Kit（上海翊圣生物科技有限公司）通過(guò)無(wú)縫克隆的方法將純化后的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)由Nco1和Pml1消化的pCAMBIA1305.1載體中，得到35S∶∶Gene的表達(dá)載體。陽(yáng)性細(xì)菌克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。

1.3 基因序列分析

使用Ex-pasy protparam（https://web.expasy.org/ protparam/）在線分析編碼蛋白的氨基酸數(shù)目、理化性質(zhì)。通過(guò)NCBI CDD分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi）。通過(guò)Cell-PLoc網(wǎng)站（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/ bioinf/plant-multi/）分析蛋白亞細(xì)胞定位。從https://www.arabidopsis.org/下載擬南芥基因和蛋白序列，從http://www.phytozome.net/poplar release 3.1下載毛果楊基因和蛋白序列。利用MEGA 6.06軟件的Clustal W工具對(duì)3個(gè)物種的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，選擇鄰近結(jié)合法（Neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap為1 000。

1.4 組織表達(dá)分析

以克隆的基因序列為模板設(shè)計(jì)基因特異引物，以不同節(jié)間的木質(zhì)部cDNA為模板，通過(guò)基因特異性引物和內(nèi)參基因（）（表1）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)目標(biāo)基因在木材形成組織中的表達(dá)情況。熒光定量檢測(cè)所用試劑盒為2 × SybrGreen qPCR Mix熒光定量試劑盒（愛(ài)博森生物公司）。反應(yīng)體系和運(yùn)行程序按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。每個(gè)組織樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 84k楊遺傳轉(zhuǎn)化與分析

質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后進(jìn)行84k楊樹(shù)的遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化流程主要參照AN等[11]和ZHOU等[12]的方法，使用潮霉素（Hygromycin）按正常流程篩選。轉(zhuǎn)化基本過(guò)程如下：從莖尖往下取4周無(wú)菌苗的第3 ～ 5片葉作為農(nóng)桿菌侵染的外植體，用解剖刀沿中脈切3 ～ 4個(gè)傷口，預(yù)培養(yǎng)2 d。侵染前1 d，準(zhǔn)備農(nóng)桿菌，培養(yǎng)過(guò)夜。在侵染當(dāng)天，當(dāng)農(nóng)桿菌菌液的OD600達(dá)到0.5左右時(shí)，侵染葉外植體，之后在黑暗中共培養(yǎng)3 d。將外植體移至芽再生培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選和芽再生后直接移至生根培養(yǎng)基獲得轉(zhuǎn)基因苗。分別提取轉(zhuǎn)基因苗和野生型負(fù)對(duì)照植株的基因組DNA，利用載體的潮霉素抗性基因引物（表1）擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因苗。將轉(zhuǎn)基因苗和野生型負(fù)對(duì)照植株移栽至花盆中進(jìn)行培養(yǎng)，統(tǒng)一水肥管理，觀察植株生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 EugNAC007基因克隆與序列分析

對(duì)尾巨桉DH32-29三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子基因MIX-PB_transcript_70069（長(zhǎng)度 1 974 bp）的表達(dá)量在主莖生長(zhǎng)量顯著增大的木質(zhì)部樣本中顯著升高[12]。根據(jù)其序列設(shè)計(jì)引物，以尾巨桉DH32-29主莖木質(zhì)部cDNA為模板，擴(kuò)增目的基因編碼區(qū)，獲得長(zhǎng)度約2 000 bp的單一條帶（圖1A）。經(jīng)克隆測(cè)序，獲得長(zhǎng)度為1 711 bp的編碼序列。序列分析預(yù)測(cè)其編碼一個(gè)含569個(gè)氨基酸殘基的蛋白，在N-末端第29位氨基酸至156位氨基酸含有一個(gè)保守的NAC結(jié)構(gòu)域，包含5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域（圖1B）；蛋白預(yù)測(cè)相對(duì)分子量為64.32 KD，等電點(diǎn)pI為5.09，屬酸性蛋白；亞細(xì)胞定位分析顯示該蛋白定位于細(xì)胞核。

A：從尾巨桉DH32-29主莖木質(zhì)部中擴(kuò)增的EugNAC007瓊脂糖電泳檢測(cè)；M，全式金Trans2K Plus DNA Marker（條帶自上到下：5 Kb，3 Kb，2 Kb，1 Kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp）；B：EugNAC007編碼的氨基酸序列；下劃線部分表示NAC結(jié)構(gòu)域，粗體字部分代表5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域。A, Agarose gel electrophoresis of EugNAC007 gene amplified from stem xylem of E. urophylla × E. grandis DH32-29; M, Trans2K Plus DNA Marker (the fragments size from top to bottom are 5 Kb, 3 Kb, 2 Kb, 1 Kb, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp); B: Amino acid sequence of EugNAC007; Underline indicates the NAC domain, bold indicates the five subdomains.

HUSSEY等[10]系統(tǒng)分析了巨桉NAC轉(zhuǎn)錄因子家族，獲得了189個(gè)巨桉NAC成員，并將之與擬南芥中105個(gè)NAC成員、楊樹(shù)中163個(gè)NAC成員等做了進(jìn)化分析。為明確本研究所獲得的尾巨桉NAC轉(zhuǎn)錄因子基因與巨桉、擬南芥、楊樹(shù)NAC成員之間的關(guān)系，課題組前期將MIX-PB_transcript_70069蛋白序列與上述3個(gè)物種的NAC成員構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)MIX-PB_transcript_70069與擬南芥ANAC003（XVP，AT1G02220.1）、ANAC005（AT1G02250.1）、ANAC068（AtNTM1，AT4G01540.1）等成員在同一個(gè)分枝[13]，這些成員已被證實(shí)參與形成層細(xì)胞分裂或木質(zhì)部發(fā)育調(diào)控[3, 14-15]。本研究選取該分枝部分成員進(jìn)一步簡(jiǎn)化了系統(tǒng)關(guān)系樹(shù)（圖2），結(jié)果顯示：MIX-PB_transcript_70069與巨桉EgrNAC007（Eucgr.G01047）的親緣關(guān)系最近，與擬南芥AtNTM1以及楊樹(shù)3個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系較近。其中，擬南芥AtNTM1的功能已知，為調(diào)控細(xì)胞分裂[14]。本研究將獲得的命名為。

2.2 EugNAC007基因組織表達(dá)分析

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，在主莖生長(zhǎng)量大的植株木質(zhì)部中，的表達(dá)量也顯著上調(diào)。為了進(jìn)一步明確在不同發(fā)育程度木質(zhì)部中的表達(dá)變化，本研究以葉片為參照，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量方法對(duì)該基因在不同莖節(jié)中的表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果顯示該基因在不同發(fā)育程度木質(zhì)部中的表達(dá)水平顯著高于葉片。比較不同莖節(jié)中的基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)該基因在第三節(jié)間中的表達(dá)水平最高，其次是第七節(jié)間，但是各節(jié)間的表達(dá)水平差異不顯著。

圖2 尾巨桉EugNAC007（MIX-PB_transcript_70069）與其他物種NAC轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

圖3 尾巨桉EugNAC007在不同節(jié)間木質(zhì)部和葉片中的表達(dá)水平

2.3 轉(zhuǎn)基因植株鑒定與分析

為了證明基因參與木材形成過(guò)程的調(diào)控，本研究構(gòu)建了過(guò)量表達(dá)載體并遺傳轉(zhuǎn)化84K楊，利用載體的潮霉素抗性基因引物擴(kuò)增鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。結(jié)果顯示，在12個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中，11個(gè)株系擴(kuò)增出目的片段，野生型植株（WT）無(wú)擴(kuò)增帶（圖4）。對(duì)野生型和過(guò)表達(dá)植株進(jìn)行盆栽培養(yǎng)，保持生長(zhǎng)條件一致并觀察生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)植株的株高明顯低于野生型的，表明過(guò)表達(dá)影響了植株正常生長(zhǎng)（圖5）。

M，全式金Trans2K Plus DNA Marker（條帶自上到下：5 Kb，3 Kb，2 Kb，1 Kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp）；WT，野生型植株。M，Trans2K Plus DNA Marker (the fragments size from top to bottom are 5 Kb, 3 Kb, 2 Kb, 1 Kb, 750 bp, 500 bp, 250 bp, 100 bp); WT, wild type.

WT：野生型植株；OE：EugNAC007過(guò)表達(dá)植株。WT, wild type; OE, EugNAC007 overexpression plants.

3 討論與結(jié)論

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子大家族，廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育多方面的調(diào)控。木材形成是植株正常生長(zhǎng)以及生物量積累的重要生物學(xué)過(guò)程，一些NAC轉(zhuǎn)錄因子在木材形成過(guò)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[16-19]。研究表明，擬南芥中含有105個(gè)NAC成員，楊樹(shù)中含有163個(gè)NAC成員[10]，它們中一些成員在形成層細(xì)胞分裂、木質(zhì)部細(xì)胞分化、次生壁加厚等木材形成相關(guān)生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮了關(guān)鍵調(diào)控作用[16]。在擬南芥中，NAC轉(zhuǎn)錄因子SND1是次生壁合成的關(guān)鍵調(diào)控因子，雙突變體植株不能直立生長(zhǎng)；而在擬南芥中表達(dá)在楊樹(shù)中的同源基因以及桉樹(shù)中的同源均能夠恢復(fù)互補(bǔ)雙突變體纖維的垂莖表型（Pendent Stem），并且激活次生壁合成基因的表達(dá)[16]。巨桉中含有189個(gè)NAC成員，但它們?cè)谀静男纬芍械墓δ艿玫津?yàn)證的極少。SUN等[8]發(fā)現(xiàn)在擬南芥中過(guò)表達(dá)巨桉基因后植株的木質(zhì)素含量和木質(zhì)部面積均增加，木質(zhì)素合成基因的表達(dá)水平也升高，說(shuō)明作為正調(diào)控因子參與了木材形成過(guò)程中木質(zhì)素的合成，但在擬南芥中的同源基因?yàn)?，其功能是?fù)調(diào)控葉片衰老。由此可見(jiàn)，發(fā)揮了與其擬南芥同源基因不同的功能。為了獲得更多的參與桉樹(shù)木材形成的NAC轉(zhuǎn)錄因子，本研究從尾巨桉中克隆了一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子，其編碼蛋白N端含有一個(gè)保守的NAC結(jié)構(gòu)域，包含5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示與EugNAC007親緣關(guān)系較近的巨桉、楊樹(shù)中的成員的功能尚不明確，但與之關(guān)系較近的擬南芥的功能已知，其功能為調(diào)控細(xì)胞分裂[14]。因此，本研究推測(cè)可能參與調(diào)控木材形成過(guò)程中細(xì)胞分裂過(guò)程，但需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

木本植物的生長(zhǎng)包括初生生長(zhǎng)（縱向生長(zhǎng)）和次生生長(zhǎng)（徑向生長(zhǎng)）兩個(gè)部分。初生生長(zhǎng)來(lái)源于頂端分生組織（Shoot Apical Meristem, SAM）和原形成層，促使根與枝條增長(zhǎng)，次生生長(zhǎng)則使植株周長(zhǎng)增加，形成木材（次生木質(zhì)部）。植株主莖從頂端到基部反應(yīng)了植株由初生生長(zhǎng)向次生生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)變。為了驗(yàn)證該基因在木材形成中發(fā)揮功能，本研究檢測(cè)了在主莖不同節(jié)間的木質(zhì)部中的表達(dá)變化。以葉片為參照，該基因在不同發(fā)育程度木質(zhì)部中的表達(dá)水平顯著升高，表明該基因主要在木材形成組織中發(fā)揮功能。比較不同節(jié)間的基因表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)該基因在第三節(jié)間的表達(dá)水平最高，但是各節(jié)間的表達(dá)水平差異不顯著。在第三節(jié)間表達(dá)水平最高的原因可能是由于該節(jié)間處于由初生生長(zhǎng)向次生生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變的過(guò)程，但需要進(jìn)一步通過(guò)解剖結(jié)構(gòu)觀察驗(yàn)證。

為了明確基因表達(dá)對(duì)植株生長(zhǎng)的影響，本研究構(gòu)建了基因過(guò)表達(dá)的84K楊轉(zhuǎn)基因遺傳材料。發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)后轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)受到影響，主要表現(xiàn)為植株株高顯著低于野生型，這可能是由于過(guò)表達(dá)后擾亂了植株細(xì)胞的正常分裂，使植株生長(zhǎng)受限。本研究暫未發(fā)現(xiàn)植株直徑生長(zhǎng)受到明顯影響，這可能是由于觀察時(shí)間較短，植株在次生生長(zhǎng)上的差異尚不顯著。綜上所述，本研究獲得了一個(gè)桉樹(shù)轉(zhuǎn)錄因子基因，其表達(dá)水平對(duì)植株株高生長(zhǎng)產(chǎn)生了一定影響，可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞分裂的形式參與木材形成過(guò)程，但具體作用途徑和機(jī)制待進(jìn)步一研究。

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Cloning and Preliminary Functional Analysis of theGene in×

HE Shae, OUYANG Linnan, YANG Jiaqi, ZHENG Jiaqi, CHEN Shaoxiong*

(Research Institute of Fast-growing Trees, Chinese Academy of Forestry, Zhanjiang 524022, Guangdong, China)

To identify key NAC transcription factors involved in wood formation, a NAC transcription factor geneof the clone DH32-29 of×was cloned based on RNA sequencing data and its function analyzed. The coding DNA sequence length of thegene was found to be 1 711 bp and encodes an acidic protein with 569 amino acid residuesofmolecular weight of 64.32 KD. The EugNAC007 protein contained a typical NAC domain at the N terminus and shared relatively high homology with theNAC with TRANSMEMBRANE MOTIF1 (AtNTM1) that regulates cell division. The results of RT-qPCR showed thatwas predominantly expressed in xylem tissues. Overexpression ofin poplar suppressed growth of tree height. These results indicated that themay participate in the processes of wood formation through the regulation of cell division, but the regulation mechanism is still unclear. This study advanced deep excavation of NAC transcription factors involved in wood formation processes in.

; NAC transcription factor; gene cloning; gene function

10.13987/j.cnki.askj.2023.04.001

Q785

A

廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金聯(lián)合基金（2020A1515110931）；中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（CAFYBB2021MA010）

何沙娥（1983— ），女，博士，主要從事林木遺傳改良研究。E-mail: cerchese@caf.ac.cn

陳少雄（1965— ），男，博士，研究員，主要從事人工林定向培育技術(shù)研究。E-mail: sxchen01@163.com