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    一種甘蔗組培苗甘蔗鞭黑粉菌接種方法的建立

    2020-05-08 08:10:06顏梅新張小秋王澤平雷敬超李翔黃冬梅宋修鵬
    廣西糖業(yè) 2020年1期
    關(guān)鍵詞:黑穗病培苗初篩

    顏梅新,張小秋,王澤平,雷敬超,李翔,黃冬梅,宋修鵬

    (廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心/農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530007)

    0 引言

    甘蔗黑穗?。⊿ugarcane smut)是對(duì)廣西乃至全國甘蔗安全生產(chǎn)威脅最大的病害[1],它能夠?qū)е抡崆o產(chǎn)量和蔗糖分的嚴(yán)重降低,一般發(fā)病率為18%,宿根蔗發(fā)病率高達(dá)50%,給我國甘蔗產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。該病害于1877年在南非納塔爾首次報(bào)道[2],之后蔓延至全球所有的甘蔗種植國家。目前,甘蔗黑穗病已成為一種世界重要的甘蔗病害。甘蔗黑穗病最明顯特征是病蔗梢頭具一條向下內(nèi)卷的黑色鞭狀物。該病病原為甘蔗鞭黑粉菌(Sporisorium scitamineum),屬擔(dān)子菌亞門黑粉菌屬,是兩型真菌,在其生活史中,不同遺傳交配型(“+”和“-”)的單倍體細(xì)胞通過有性配合形成雙核菌絲體,在活的寄主組織中侵入寄主甘蔗體內(nèi)發(fā)育,使甘蔗發(fā)?。?]。

    農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗鞭黑粉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系的成功構(gòu)建促進(jìn)了甘蔗鞭黑粉菌致病機(jī)理研究[4-5]。Yan等[6]利用綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白分別標(biāo)記甘蔗鞭黑粉菌(“+”和“-”)菌株,揭示其有性配合、冬孢子形成、冬孢子萌發(fā)等過程。通過對(duì)甘蔗鞭黑粉菌交配型基因a位點(diǎn)和b位點(diǎn)基因的克隆和功能驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)它們的基因結(jié)構(gòu)和功能與玉米黑粉菌(U. maydis)的a位點(diǎn)和b位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)和功能相似[3,7]。Deng等[8]揭示MAP Kinase SsKpp2參與甘蔗鞭黑粉菌的有性配合和菌絲形成過程。Chang等[9]驗(yàn)證了cAMP/PKA 信號(hào)在甘蔗鞭黑粉菌中的功能,該基因通過調(diào)高病菌細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)水平,促使“+”“-”兩性單倍體細(xì)胞融合,形成雙核菌絲侵染寄主。最近,Sun等[10]證實(shí)了Farnesyltransferase β-Subunit Ram1可調(diào)控甘蔗鞭黑粉菌的有性配合和致病性。

    目前甘蔗鞭黑粉菌致病機(jī)理研究需要大量突變體對(duì)甘蔗種苗進(jìn)行致病性測(cè)定,這就需要準(zhǔn)備大量的甘蔗種苗作為接種材料。致病性測(cè)定主要采取“+”“-”菌體混合孢子液注射的人工接種方法[3],但該方法存在缺陷,如前期準(zhǔn)備繁瑣、耗時(shí)、耗人工、致病性測(cè)定周期長(zhǎng)且測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定,限制突變體測(cè)試數(shù)量,從而影響甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突變體的篩選效率,導(dǎo)致甘蔗鞭黑粉菌致病機(jī)理研究進(jìn)度緩慢。為了提高甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突變體的篩選效率,本研究開展了組培苗甘蔗鞭黑粉菌接種技術(shù)研究,形成了一種甘蔗組培苗甘蔗鞭黑粉菌接種方法,省去繁瑣的前期準(zhǔn)備工作,縮短致病性測(cè)試周期,提高甘蔗鞭黑粉菌突變體致病性測(cè)定效率,對(duì)甘蔗鞭黑粉菌致病機(jī)理研究具有重要意義。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    供試品種為桂糖49號(hào),規(guī)格為移栽后高度20~40cm的組培苗。甘蔗黑穗病菌野生型菌株Ss17和Ss18及突變體(突變體為經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系獲得隨機(jī)插入的突變體)由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 甘蔗鞭黑粉菌野生型及突變體孢子懸浮液配制

    將甘蔗鞭黑粉菌野生型“+”“-”菌株Ss17和Ss18及突變體從-80℃冰箱中取出,接種至酵母提取物(yeast extraction)1%,蛋白胨(peptone)2%,蔗糖(sugar)2%,瓊脂(agar)2%的YePSA培養(yǎng)基中進(jìn)行活化,于28℃培養(yǎng)2天。將活化好的甘蔗鞭黑粉菌野生型菌株Ss17和Ss18及突變體分別接種至酵母提取物(yeast extraction)1%,蛋白胨(peptone)2%,蔗糖(sugar)2%的YePS液體培養(yǎng)基,于28℃搖床,200rpm,培養(yǎng)2天,所有菌株孢子懸浮液調(diào)至1×107個(gè)/mL,然后“+”和“-”菌株按1:1混合,具體如:野生型Ss17+Ss18,來源于Ss17菌株的突變體與菌株Ss18混合,來源于Ss18菌株的突變體與菌株Ss17混合。

    1.2.2 甘蔗鞭黑粉菌致病性測(cè)定

    將高度為20~40cm的甘蔗組培苗移栽至長(zhǎng)寬高分別為0.7m、0.45m和0.2m的塑料盆中,30株/盆,見圖1A。采用醫(yī)用1 mL注射器分別吸取上述1.2.1所配好的甘蔗鞭黑粉菌混合孢子懸浮液各1mL,將混合孢子懸浮液注射至甘蔗組培苗植株內(nèi)生長(zhǎng)點(diǎn)處附近,用標(biāo)簽牌做好標(biāo)記,野生型Ss17+Ss18作陽性對(duì)照,接種蒸餾水(ddH2O)為陰性對(duì)照,每處理接種3株;突變體接種每處理1株作為初篩。致病性測(cè)定復(fù)篩時(shí),野生型Ss17+Ss18為陽性對(duì)照,蒸餾水為陰性對(duì)照,對(duì)照和突變體處理均設(shè)5株重復(fù)。

    1.3 甘蔗黑穗病調(diào)查

    自第一株甘蔗黑穗病發(fā)生開始調(diào)查,每隔1天調(diào)查一次;記錄發(fā)病時(shí)間,收集黑穗病樣本于信封中,放置50℃烘箱烘干后,保存4℃冰箱。

    2 結(jié)果

    本研究共測(cè)試209個(gè)甘蔗鞭黑粉菌突變體,甘蔗鞭黑粉菌致病性測(cè)定(初篩)結(jié)果顯示,甘蔗鞭黑粉菌野生型Ss17+Ss18接種后,48~72天內(nèi)發(fā)病,如圖1B、C所示,發(fā)病率為100%,陰性對(duì)照不發(fā)病。而突變體最早發(fā)病時(shí)間為38天,初步獲得比野生型發(fā)病早10天的突變體7個(gè),其中4個(gè)來自出發(fā)菌株Ss17,3個(gè)來自出發(fā)菌株Ss18。發(fā)病時(shí)間在41~90天的突變體有176個(gè),來自出發(fā)菌株Ss17和Ss18的突變體分別為84個(gè)和92個(gè),這類突變體與野生型對(duì)照(CK)發(fā)病時(shí)間比較接近,屬于發(fā)病正常突變體,如圖1D所示。突變體在91~120天內(nèi)發(fā)病,與野生型對(duì)照(CK)處理相比較,發(fā)病比較晚,屬于發(fā)病晚突變體,該類突變體有17個(gè),其中來自出發(fā)菌株Ss17的有10個(gè),來自出發(fā)菌株Ss18的突變體7個(gè)。初步獲得不發(fā)病突變體9個(gè),其中3個(gè)突變體來自出發(fā)菌株Ss17,而來自出發(fā)菌株Ss18的突變體為6個(gè),見表1。

    本研究將致病性缺陷突變體(包括初篩中發(fā)病早、發(fā)病晚和不發(fā)病的突變體)再進(jìn)行二次接種。甘蔗鞭黑粉菌致病性測(cè)定(復(fù)篩)結(jié)果證實(shí),甘蔗鞭黑粉菌野生型Ss17+Ss18接種組培苗,接種后55~70天內(nèi)發(fā)病,發(fā)病率為100%;陰性對(duì)照不發(fā)病,生長(zhǎng)正常。而突變體最早發(fā)病時(shí)間為40天,比野生型發(fā)病早15天的突變體有4個(gè),占突變體總數(shù)(209個(gè))的1.9%,來自出發(fā)菌株Ss17 和Ss18各為2個(gè)。晚發(fā)病的突變體(發(fā)病時(shí)間在91~120天)共有15個(gè),占突變體總數(shù)的7.2%,其中來自出發(fā)菌株Ss17的有9個(gè),來自出發(fā)菌株Ss18的突變體6個(gè)。不發(fā)病突變體1個(gè),來自出發(fā)菌株Ss18,占突變體總數(shù)的0.5%,見表2。而正常發(fā)病的突變體為絕大多數(shù),占突變體總數(shù)89.9%。

    圖1 甘蔗鞭黑粉菌致病性測(cè)定

    表1 甘蔗鞭黑粉菌突變體致病性測(cè)定(初篩)

    表2 甘蔗鞭黑粉菌突變體致病性測(cè)定(復(fù)篩)

    3 討論

    甘蔗黑穗病是我國甘蔗發(fā)生最嚴(yán)重的一種病害,給我國甘蔗產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1]。該病是由甘蔗鞭黑粉菌引起的,屬兩型真菌,在其生活周期中,不同遺傳交配型(“+”和“-”)的單倍體細(xì)胞通過有性配合形成雙核菌絲體,侵入寄主,使甘蔗發(fā)?。?]。

    近年,甘蔗鞭黑粉菌致病機(jī)理研究獲得進(jìn)展,首先農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘蔗鞭黑粉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)體系的成功構(gòu)建,為甘蔗鞭黑粉菌基因功能研究提供了便利[4-5]。另外,甘蔗鞭黑粉菌全基因組序列的測(cè)定為基因功能的鑒定提供了信息[11]。甘蔗鞭黑粉菌交配型基因a位點(diǎn)和b位點(diǎn)基因的克隆和驗(yàn)證,使我們?cè)诜肿铀缴细M(jìn)一步了解與玉米黑粉菌有著相似生活周期的交配型基因結(jié)構(gòu)和功能[3,7]。迄今,已鑒定參與或者調(diào)控甘蔗鞭黑粉有性配合和致病性的基因或者信號(hào)通路有SsKpp2[8]、cAMP/PKA 信號(hào)通路、Ram1[10]、SsAgc1[12]等。

    甘蔗鞭黑粉菌致病機(jī)理研究重要的一個(gè)環(huán)節(jié)是致病性測(cè)定,大量定向敲除突變體或者隨機(jī)插入突變體的致病性測(cè)定需要大量的甘蔗種苗進(jìn)行接種。當(dāng)前的致病性測(cè)定方法[3],存在前期準(zhǔn)備(如砍甘蔗,盆栽,甘蔗發(fā)株等所需時(shí)間至少2個(gè)月)繁瑣、耗時(shí)、耗人工、致病性測(cè)定周期長(zhǎng)且不穩(wěn)定,限制突變體測(cè)試數(shù)量等缺點(diǎn),嚴(yán)重影響甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突變體的測(cè)試效率,導(dǎo)致甘蔗鞭黑粉菌致病機(jī)理研究進(jìn)度緩慢。本研究的甘蔗組培苗甘蔗鞭黑粉菌接種方法,對(duì)209個(gè)突變體進(jìn)行一次初篩和一次復(fù)篩的致病性測(cè)定,在初篩測(cè)試中,每處理只需1個(gè)重復(fù)(1株甘蔗組培苗),而在復(fù)篩中每處理僅需設(shè)5個(gè)重復(fù),甘蔗鞭黑粉菌野生型發(fā)病率為100%,而突變體發(fā)病率也到達(dá)80%以上。發(fā)病早、發(fā)病晚和不發(fā)病的突變體,分別占突變體總數(shù)的1.9%、7.2%和0.5%,而正常發(fā)病的突變體占總突變體總數(shù)的89.9%,該比例符合突變體的分布規(guī)律,達(dá)到了預(yù)期效果。

    本研究的接種方法方便,組培苗盆栽即可進(jìn)行接種,測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定,重復(fù)性好,可操作性強(qiáng),節(jié)約土地、資金和勞動(dòng)力等成本,省去了繁瑣的前期準(zhǔn)備工作,縮短致病性測(cè)試周期,比當(dāng)前的接種方法縮短了至少2個(gè)月時(shí)間,提高甘蔗鞭黑粉菌致病性缺陷突變體篩選和驗(yàn)證效率,為甘蔗鞭黑粉菌致病性相關(guān)基因鑒定及機(jī)理研究提供技術(shù)支持。

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