基于異源包被的曲安奈德競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法

王英姿,閆劍勇,張世偉

(1.中華人民共和國(guó)江門海關(guān),廣東江門 529000;2.深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院,廣東深圳 518000)

曲安奈德(Triamcinolone acetonide,TCA)是一種常見(jiàn)的糖皮質(zhì)類激素,具有抗炎癥、抗過(guò)敏、抗增生等作用,在臨床上常被用于治療過(guò)敏、皮膚炎癥、哮喘等疾病,但長(zhǎng)時(shí)間過(guò)量使用可能引起嚴(yán)重的副作用,比如引起高血壓、糖尿病、骨質(zhì)疏松、過(guò)敏性皮炎、柯興氏綜合征、永久性皮膚萎縮和膿皰型銀屑病等疾病[1-2]。同時(shí),糖皮質(zhì)類激素還具有促進(jìn)機(jī)體非正常生長(zhǎng)的作用,可大幅提高動(dòng)物的生長(zhǎng)速度,因此常被不法養(yǎng)殖戶大量用于經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的養(yǎng)殖,這些濫用行為會(huì)致使糖皮質(zhì)類激素在動(dòng)物體內(nèi)存在不同程度的殘留,人若長(zhǎng)期食用糖皮質(zhì)類激素殘留的食物可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂。更有一些商販在保健食品或中藥材直接添加糖皮質(zhì)類激素,消費(fèi)者在食用此類保健食品或藥品后短期內(nèi)雖會(huì)出現(xiàn)積極效用,倘若長(zhǎng)期攝入將嚴(yán)重危害消費(fèi)者的健康[3-5]。然而在暴利的驅(qū)使下,非法濫用糖皮質(zhì)激素的情況時(shí)有發(fā)生[6-7]。針對(duì)糖皮質(zhì)類激素濫用的情況,我國(guó)的《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》(農(nóng)業(yè)部2002年235號(hào)公告)[8]中對(duì)動(dòng)物源性食品中各類糖皮質(zhì)類激素殘留最高限量值進(jìn)行了的規(guī)定。

現(xiàn)常用的糖皮質(zhì)類激素檢測(cè)方法主要為氣相色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法[9-11],這些方法均需要大型設(shè)備儀器,不僅對(duì)于食品前處理有一定要求,檢測(cè)的時(shí)效性也缺乏保障,因此建立一種簡(jiǎn)單、可靠的快速檢測(cè)方法來(lái)應(yīng)對(duì)大量樣品檢測(cè)任務(wù)具有重要應(yīng)用價(jià)值。

糖皮質(zhì)類激素的種類較多,常見(jiàn)的包括氫化可的松、可的松、地塞米松、曲安奈德、丙酸氯倍他索、倍他米松、潑尼松和潑尼松龍等,這些糖皮質(zhì)類激素具有類似的母環(huán)結(jié)構(gòu),也具有不同程度但作用相似的抗炎和促進(jìn)非正常生長(zhǎng)等作用。許多研究發(fā)現(xiàn)基于異源策略的酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)可以顯著提高小分子檢測(cè)的靈敏度[12-14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)篩選得到曲安奈德的單克隆抗體,分別采用同源和異源兩種策略間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(indirect competitive ELISA,ic-ELISA)對(duì)所得抗體進(jìn)行靈敏度檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

孔戚血藍(lán)蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)、卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS)、聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG) 美國(guó)Sigma公司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA) 源葉生物公司;免疫佐劑 北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司;糖皮質(zhì)激素標(biāo)準(zhǔn)品:TCA、地塞米松(Dexamethasone,DEX)、可的松(Cortisone,COR)、氫化可的松(Hydrocortisone,HYD)等 百靈威科技有限公司;喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的曲安奈德藥物為醫(yī)用曲安奈德注射液(40 mg/mL) 昆明積大制藥股份有限公司;純牛乳 中國(guó)伊利集團(tuán);PBS(pH7.4,0.2 g/L KH2PO4,2.9 g/L Na2HPO4·H2O,0.2 g/L KCl,8.5 g/L NaCl)、PBS-T(含0.05% Tween20的PBS)、包被液(pH9.6,0.75 g/L Na2CO3,1.46 g/L NaHCO3)、封閉液(5%脫脂奶粉溶解于PBS)、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒 湖南艾佳生物科技;高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(DMEM-GlutaMAX)、胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)、青霉素-鏈霉谷-氨酰胺混合液(Penicillin-Streptomycin-Glutamine,100)、HAT添加劑(50)、HT添加劑(100) 美國(guó)Gibco公司;HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG 美國(guó)Arista Biologicals公司、ELISA酶標(biāo)板 美國(guó)Corning公司;小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0 本實(shí)驗(yàn)室保存;6～8周齡雄性SPF級(jí)Balb/c小鼠 廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心;家雞 當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)。

SynergyH1酶標(biāo)儀、96孔酶聯(lián)免疫洗板機(jī) 美國(guó)Biotek公司;Evolution260紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo公司;1260Infinity高效液相色譜 德國(guó)安捷倫公司;Triple Quad 5500三重四級(jí)桿質(zhì)譜 新加坡AB SCIEX公司;超純水機(jī) 美國(guó)Merck millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 糖皮質(zhì)激素半抗原和抗原的合成 糖皮質(zhì)激素半抗原合成路線如圖1所示。取糖皮質(zhì)激素(曲安奈德、地塞米松、可的松或倍他米松)1 mmol、丁二酸酐1.4 mmol于50 mL圓底燒瓶中,加入無(wú)水吡啶5 mL,混合后在60 ℃下反應(yīng)8 h,停止加熱后冷卻至室溫,將反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至20 mL 10%的HCl冰水浴中,有大量白色沉淀析出,過(guò)濾后用去離子水洗滌數(shù)次,干燥后得半抗原白色固體,產(chǎn)率在65%～80%之間。

圖1 免疫半抗原和包被半抗原的合成

完整抗原參考文獻(xiàn)[15]利用活潑酯法進(jìn)行合成,免疫抗原為曲安奈德半抗原TCA-COOH與KLH的偶聯(lián)物。包被抗原為曲安奈德、地塞米松、可的松或氫化可的松半抗原與BSA的偶聯(lián)物,分別命名為TCA-BSA、DEX-BSA、COR-BSA、HYD-BSA。偶聯(lián)物透析72 h后使用紫外分光光度計(jì)對(duì)抗原進(jìn)行鑒定,掃面波長(zhǎng)190～340 nm,分別以半抗原和載體蛋白作為對(duì)照,觀察最大吸收峰的變化。BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定其濃度后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 單克隆抗體制備 按照《抗體實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》中的方法建立雜交瘤細(xì)胞株[16]。TCA-KLH作為免疫原,經(jīng)小鼠免疫、細(xì)胞融合、篩選能穩(wěn)定分泌曲安奈德單克隆抗體的細(xì)胞株。采用動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)法制備腹水單抗。

1.2.3 ic-ELISA方法 每孔加包被原100 μL 4 ℃孵育過(guò)夜。第二天倒掉包被液,用洗滌液洗一遍,每孔再加200 μL封閉液,37 ℃孵育3 h,倒掉封閉液。每孔加50 μL單克隆抗體和50 μL樣品(或標(biāo)準(zhǔn)溶液),陰性對(duì)照孔用PBS代替,37 ℃反應(yīng)30 min,完后用PBS-T洗3次。再加入100 μL HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG,37 ℃反應(yīng)30 min,之后用PBS-T洗3次。加底物顯色液37 ℃反應(yīng)10 min,稀H2SO4終止反應(yīng)后上酶標(biāo)儀檢測(cè)。以曲安奈德濃度為橫坐標(biāo),B/B0為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(B為樣品或標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值,B0為空白溶液的吸光度值)。同時(shí),采用棋盤法試驗(yàn)優(yōu)化包被抗原和酶標(biāo)抗體的最佳稀釋倍數(shù)。

1.2.4 交叉反應(yīng)測(cè)定 使用25種糖皮質(zhì)激素分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)計(jì)算IC50評(píng)估ELISA方法對(duì)各糖皮質(zhì)激素的交叉反應(yīng)。

1.2.5 添加回收檢測(cè) 首先使用TAYLOR報(bào)道的 HPLC-MS/MS方法確證所選用的豬肝和豬肉樣品不含有曲安奈德[17]。分別在1 g樣品加入曲安奈德標(biāo)液至2和20 μg/kg,4 ℃放置12 h使組織充分吸收所添加的藥物。加入5 mL 20%甲醇水溶液(v/v)。振蕩混勻5 min后4000 r/min離心,取上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。

1.2.6 真實(shí)樣品測(cè)定 在飼料里混入終濃度為10 mg/kg的曲安奈德連續(xù)喂養(yǎng)家雞3 d,宰殺后取肝、腎、肌肉,分別使用本方法和TAYLOR報(bào)道的HPLC-MS/MS方法進(jìn)行比對(duì)檢驗(yàn)[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 7.5 四參數(shù)擬合法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算方法的IC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原的紫外吸收光光譜表證

半抗原、載體蛋白和抗原的吸收光光譜圖如圖2所示。半抗原DEX-COOH和TCA-COOH含共軛雙鍵且不含苯環(huán),紫外最大吸收波長(zhǎng)比載體蛋白偏小20 nm左右,半抗原連接到載體蛋白后形成的全抗原紫外吸收發(fā)生了藍(lán)移,最大吸收波長(zhǎng)大于半抗原而小于載體蛋白,說(shuō)明全抗原偶聯(lián)成功[18]。

圖2 半抗原、載體蛋白和全抗原紫外掃描圖譜

2.2 同源及異源策略ic-ELISA檢測(cè)

ic-ELISA反應(yīng)過(guò)程需要游離的藥物和包被在酶標(biāo)板上的包被原進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng),采用異源包被,降低抗體和包被抗原的親和性,從而可相對(duì)性的提高抗體和游離藥物的結(jié)合能力,使得游離藥物在低濃度下仍然保持競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)[19]。因此,設(shè)計(jì)理想的異源包被抗原,成為提高ic-ELISA靈敏度的有效手段。糖皮質(zhì)激素類藥物結(jié)構(gòu)類似,基本結(jié)構(gòu)特征包括腎上腺皮質(zhì)激素所具有的C3的羰基、Δ4和17β酮醇側(cè)鏈以及糖皮質(zhì)激素獨(dú)有的17α-OH和11β-OH,因此成為研究異源包被的良好對(duì)象[20]。

本研究選用地塞米松、可的松、氫化可的松這三種糖皮質(zhì)激素藥物連接載體蛋白構(gòu)建異源包被原。根據(jù)優(yōu)化后的抗原抗體工作濃度,分別建立曲安奈德同源和異源策略ic-ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果如圖3所示,同源策略的曲安奈德半抑制濃度為5.4 ng/mL;異源策略下的最優(yōu)包被原—地塞米松BSA偶聯(lián)物(DEX-BSA)半抑制濃度為0.53 ng/mL。結(jié)果表明在異源策略中曲安奈德的檢測(cè)靈敏度是同源策略的10倍。

圖3 同源和異源策略ic-ELISA法檢測(cè)曲安奈德標(biāo)準(zhǔn)曲線

地塞米松半抗原與曲安奈德半抗原在遠(yuǎn)離連接臂的3個(gè)六元環(huán)上都完全相同,只是在近連接臂的5元環(huán)側(cè),曲安奈德連接有一個(gè)奈德類藥物典型的二氧戊環(huán),而地塞米松為甲基。這種變化使得藥物和包被原的競(jìng)爭(zhēng)中,更利于抗體選擇與藥物結(jié)合,而沒(méi)有藥物存在時(shí)抗體依然對(duì)包被原保持親和能力。目前,基于最低能量構(gòu)象的高斯計(jì)算和抗原抗體共結(jié)晶可以分別從宏觀和微觀層面闡述抗原和抗體的構(gòu)效關(guān)系,為后續(xù)識(shí)別機(jī)制的研究提供了有利的工具[21]。

2.3 方法的特異性

糖皮質(zhì)激素是一類結(jié)構(gòu)相似的藥物家族,表1展示了該方法檢測(cè)其他糖皮質(zhì)激素的交叉反應(yīng)。由于奈德類藥物在結(jié)構(gòu)上具有較大相似性,該方法和奈德類的藥物具有交叉反應(yīng),不與其他糖皮質(zhì)激素產(chǎn)生交叉反應(yīng),因此該方法可作為奈德類藥物的廣譜篩選方法。圖2表明,該抗體可以結(jié)合地塞米松、氫化可的松和可的松構(gòu)建的包被原,但是在競(jìng)爭(zhēng)模式下,游離的藥物并未產(chǎn)生抑制,說(shuō)明基于地塞米松的固相異源包被原,相比于游離藥物具有較強(qiáng)的親和優(yōu)勢(shì)。這種原因可能在于,該抗體具有對(duì)半抗原連接臂的親和能力,而游離藥物因?yàn)椴痪邆溥B接臂,其結(jié)構(gòu)相似度低于包被原,因此在競(jìng)爭(zhēng)中無(wú)法獲得抑制能力[22]。

表1 與各糖皮質(zhì)激素的交叉反應(yīng)率

2.4 添加回收實(shí)驗(yàn)

糖皮質(zhì)激素屬于脂溶性藥物。目前,對(duì)脂溶性藥物的前處理方法主要采用以下三種方法:一種是直接用與水不互溶的有機(jī)溶劑(如氯仿)提取。由于ELISA反應(yīng)需要在水相中進(jìn)行,因此該方法需要吹干后再用緩沖液復(fù)溶,過(guò)程繁瑣。第二種是用可與水互溶的有機(jī)溶劑(如甲醇)進(jìn)行提取,然后稀釋至無(wú)影響濃度。這種方法比較簡(jiǎn)單,但是需要大比例的稀釋,影響檢測(cè)靈敏度。第三種是使用一定比例的有機(jī)溶劑和水進(jìn)行提取,提取液直接用于檢測(cè),但是有機(jī)溶劑占比過(guò)高,對(duì)ELISA反應(yīng)有影響,占比過(guò)低則影響回收率。本研究探索了使用甲醇水對(duì)含曲安奈德畜肉的提取效果(圖4)。甲醇濃度超過(guò)20%(V/V)后,雖然能得到理想的回收率,但是ELISA吸光度值大幅度降低,說(shuō)明嚴(yán)重影響到抗原抗體結(jié)合。20%的甲醇水提取回收率介于75%～90%,滿足檢測(cè)需求,且對(duì)抗原抗體反應(yīng)干擾較小。

圖4 使用不同濃度甲醇水時(shí)的ELISA吸光度和回收率(n=6)

2.5 方法比對(duì)

本研究采用向動(dòng)物人工喂食曲安奈德藥物的方法獲得曲安奈德陽(yáng)性組織樣品。如表2所示,ELISA方法和液質(zhì)法對(duì)3個(gè)陽(yáng)性樣品和3個(gè)陰性樣品的定性上完全一致。定量上,ELISA方法在檢測(cè)肌肉方面穩(wěn)定性較好,6個(gè)平行樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.6%,檢測(cè)內(nèi)臟的穩(wěn)定性低于肌肉,肝和腎的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為24%和21%。ELISA測(cè)得的數(shù)據(jù)與液質(zhì)法相比,偏離度≤38%。上述結(jié)果說(shuō)明本研究所建立的曲安奈德ELISA方法能有效的應(yīng)用于動(dòng)物組織中曲安奈德的快速篩查。

表2 兩種方法檢測(cè)組織中曲安奈德含量(n=6)

3 結(jié)論

本研究首先合成曲安奈德半抗原TCA和多種異源包被原,分別建立同源及異源策略的曲安奈德ic-ELISA方法,發(fā)現(xiàn)在異源策略下的靈敏度(0.53 ng/mL)是同源(5.4 ng/mL)的10倍。該異源ic-ELISA法能廣譜特異性的檢測(cè)奈德類糖皮質(zhì)激素,而未見(jiàn)和其他糖皮質(zhì)激素存在交叉反應(yīng)。結(jié)合20%甲醇水作為樣品提取劑可有效提取肌肉和肝臟中的曲安奈德,回收率在75%～90%之間。本方法檢測(cè)真實(shí)樣品未發(fā)現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性,定量值與HPLC-MS的偏離度≤38%。由于糖皮質(zhì)激素是結(jié)構(gòu)類似的藥物家族,構(gòu)建異源包被原料選擇范圍廣,因此本研究可為提升其他糖皮質(zhì)激素藥物免疫檢測(cè)靈敏度提供參考。