5株發(fā)酵食品源乳酸菌的抗藥性分析

黃曉棠,姚妞妞,周 璇,郭潤(rùn)芳,于宏偉

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,河北保定 071000)

乳酸菌是發(fā)酵食品生產(chǎn)中一類(lèi)重要的微生物,它們能改善發(fā)酵食品的風(fēng)味和質(zhì)地,提高發(fā)酵食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,而且能產(chǎn)生一些特殊物質(zhì)來(lái)抑制食物腐敗細(xì)菌的生長(zhǎng),對(duì)調(diào)節(jié)免疫、維持腸道平衡和健康具有重要作用[1-3],因此乳酸菌膳食補(bǔ)充劑以及乳酸菌發(fā)酵食品越來(lái)越得到人們的青睞。乳酸菌是從傳統(tǒng)發(fā)酵食品或動(dòng)物腸道中分離而來(lái),是安全性菌株(Generally recognized as safe,GRAS),因此人們更多關(guān)注的是乳酸菌的益生功能和健康應(yīng)用。

隨著抗生素的濫用,乳酸菌的抗藥性也逐漸成為公眾關(guān)注的安全問(wèn)題,并引起了全世界專(zhuān)業(yè)學(xué)者的研究與重視,尤其是抗藥性的增加以及抗性基因?qū)χ虏【蚍侵虏【臐撛谵D(zhuǎn)移[4]。近年來(lái),關(guān)于發(fā)酵食品中乳酸菌抗藥性的報(bào)道層出不窮,研究也取得了一定的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn),大部分乳酸菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、多粘菌素B等抗革蘭陰性菌的抗生素有抗性[5],Li等[6]報(bào)道了19種乳酸菌對(duì)喹諾酮類(lèi)抗生素的抗性,結(jié)果表明所有菌株均對(duì)諾氟沙星和環(huán)丙沙星有抗性,且喹諾酮抗性的遺傳基礎(chǔ)可能與gyrA基因的突變密切相關(guān)。Nawaz等[7]報(bào)道了分離自發(fā)酵食品中的乳酸菌攜帶ermB和tetM抗性基因,且可通過(guò)過(guò)濾器成功轉(zhuǎn)移到糞腸球菌中?？剐曰蛟诰曛g的相互傳遞具有一定的危害性[8],例如某些耐藥基因可能會(huì)以某種方式在腸道內(nèi)微生物菌群之間相互傳遞,從而導(dǎo)致某些致病菌也獲得了耐藥性[9]。

作為益生菌,植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和保加利亞乳桿菌因優(yōu)良發(fā)酵特性及多種益生作用被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)、食品發(fā)酵及醫(yī)療保健等領(lǐng)域[10-13],除了益生功能研究外,其耐藥性的相關(guān)研究也逐年增多[14-16]。本研究前期從自制混合發(fā)酵果蔬汁和樹(shù)莓酵素中分到2株植物乳桿菌,從奶制品中分離到干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和保加利亞乳桿菌,并發(fā)現(xiàn)這些菌株對(duì)果蔬有良好的發(fā)酵特性[17]。因此,本文以這5株菌為研究對(duì)象,采用平板藥敏紙片擴(kuò)散法、PCR及RT-PCR技術(shù)從表型、耐藥基因定位及基因表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)的分析,為全面評(píng)價(jià)5株菌的安全性及其應(yīng)用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌S(LactobacillusplantarumS) 分離自蘋(píng)果、梨、香蕉混合發(fā)酵果蔬,命名為Z1,河北農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室;植物乳桿菌WD(L.plantarumWD) 分離自樹(shù)莓酵素,命名為Z2;保加利亞乳桿菌LB-DR(L.bulgaricusLB-DR)、鼠李糖乳桿菌Lr-05-281(L.rhamnosusLr-05-281)、干酪乳桿菌D-400(L.caseiD-400) 分離自不同奶制品,分別命名為B1、L1、G1,河北農(nóng)業(yè)大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室;MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司;27種藥敏紙片:氨基糖苷類(lèi)(阿米卡星、卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素)、喹諾酮類(lèi)(諾氟沙星、氧氟沙星、左氟沙星、環(huán)丙沙星)、糖肽類(lèi)(萬(wàn)古霉素)、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)(紅霉素)、四環(huán)素類(lèi)(四環(huán)素)、β-內(nèi)酰胺類(lèi)(頭孢呋辛、頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢噻肟、頭孢曲松、頭孢他啶、哌拉西啉、氨芐西林、苯唑西林、青霉素G、氨曲南)、磺胺類(lèi)(復(fù)方新諾明)、其他(呋喃妥因、氯霉素、多粘菌素B、克林霉素) 杭州濱和微生物試劑有限公司;6×Loading Buffer、DL2000 DNA Marker 保定寶生物有限公司;Quick-RNA真菌/細(xì)菌Microprep試劑盒 ZYMO RESEARCH生物公司;HiFiScript快速去基因組cDNA第一鏈合成試劑盒 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

CP214型電子天平 上海奧豪斯儀器有限公司;SW-CJ-1FD型潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;LS-35HD型立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司;ABI-2720型PCR擴(kuò)增儀 賽默飛世爾科技有限公司;SPX-250S-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;JY600C型電泳儀、JY04S-3E型電泳凝膠成像分析系統(tǒng) 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化 從-20 ℃凍存管中取2%菌液接種于MRS液體培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)12 h,傳代2～3次,保證菌種活力。

1.2.2 藥敏試驗(yàn) 采用藥敏紙片擴(kuò)散法檢測(cè)5株乳酸菌對(duì)27種抗生素的敏感性,抗性判定參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)最新版手冊(cè)[18]進(jìn)行。

1.2.3 菌株基因組DNA的提取 采用傳統(tǒng)酚-氯仿的方法[19]提取5株乳酸菌的基因組DNA。

1.2.4 菌株質(zhì)粒的提取 采用張波等[20]高效提取乳酸菌質(zhì)粒的方法提取5株乳酸菌的質(zhì)粒。

1.2.5 抗藥基因的PCR檢測(cè) 根據(jù)乳酸菌抗藥性表型結(jié)果,NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)查找并下載抗性基因全序列,使用DNAMAN 5.0軟件(美國(guó)Lynnon Biosoft公司)進(jìn)行比對(duì),選取同源性高的片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì),共自行設(shè)計(jì)9對(duì)引物:卡那霉素抗性基因aph、慶大霉素抗性基因aacⅠ和aacⅡ、鏈霉素抗性基因ant(6)、四環(huán)素抗性基因tet、紅霉素抗性基因erm、萬(wàn)古霉素耐藥基因vanⅠ和vanⅡ、β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性基因blaⅠ;而β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性基因blaⅡ、磺胺類(lèi)抗性基因sul、喹諾酮類(lèi)抗性基因qnr引自參考文獻(xiàn)[21-23]。設(shè)計(jì)的引物由北京華大基因公司合成,序列及退火溫度見(jiàn)表1。

表1 抗性基因引物序列及條件

分別以5株菌的基因組DNA和質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性45 s,相應(yīng)退火溫度45 s,72 ℃延伸45 s,72 ℃終延伸3 min,30次循環(huán)。擴(kuò)增體系為:DNA模板1 μL,上下引物(10 μmol/L)各1 μL,2×ES taq Master Mix 12.5 μL,ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠(1.0%)點(diǎn)樣孔,120 V電泳40 min,電泳結(jié)束后紫外燈下觀察并拍照記錄。

1.2.6 抗性基因的表達(dá)分析 5株菌分別采用MRS和添加抗生素的MRS兩種培養(yǎng)基培養(yǎng),然后用Quick-RNA真菌/細(xì)菌Microprep試劑盒提取各菌株的總RNA,HiFiScript試劑盒對(duì)提取到的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增以檢測(cè)抗性基因是否表達(dá);RT-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件同上。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 5株乳酸菌的藥敏反應(yīng)

由表2可見(jiàn),5株菌的抑菌圈均在合理范圍之內(nèi),試驗(yàn)結(jié)果可靠。5株菌均表現(xiàn)為多重抗藥性,包括對(duì)氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、糖肽類(lèi)抗生素和多粘菌素B的抗性;但對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)抗生素和呋喃妥因敏感,有較為相似的耐藥譜,而對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素表現(xiàn)出不同程度的抗性,可見(jiàn)不同菌株的抗藥性是有差異的。

表2 5株菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

已有研究報(bào)道,Zhou等[24]檢測(cè)了4種益生乳酸菌的抗藥性,發(fā)現(xiàn)3株鼠李糖乳桿菌均對(duì)萬(wàn)古霉素有抗性,對(duì)紅霉素、四環(huán)素敏感,與本研究一致。呂耀龍等[25]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古達(dá)茂旗牧區(qū)牛乳中植物乳桿菌均對(duì)紅霉素敏感,而本研究中2株植物乳桿菌對(duì)紅霉素有不同的抗藥性,Z1對(duì)紅霉素表現(xiàn)為中介,Z2對(duì)紅霉素表現(xiàn)為敏感,由此可見(jiàn),同種菌的不同菌株對(duì)同種抗生素的抗藥性不同,這可能由于菌株來(lái)源不同,所以其抗藥性也有差異。藥敏紙片擴(kuò)散法操作簡(jiǎn)單、省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用,但影響結(jié)果的因素較多,如抗生素紙片的含藥量不同、培養(yǎng)基不同、菌體生長(zhǎng)情況不同等。菌株對(duì)于同類(lèi)抗生素的抗藥表型與攜帶的抗藥基因有一定的關(guān)聯(lián),因此,乳酸菌抗藥性的檢測(cè)還常常借助于特異性引物PCR方法。

2.2 抗性基因的遺傳定位

為了確定抗性基因是存在于基因組上,還是質(zhì)粒上,亦或者是二者均有,本試驗(yàn)分別以基因組DNA和質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1?；蚪M上共檢測(cè)到6個(gè)抗性基因(erm、aph、vanⅠ、blaⅡ、aacⅠ和aacⅡ),質(zhì)粒上共檢測(cè)到4個(gè)基因(erm、aph、vanⅠ和aacⅠ),其它供試抗性基因(qnr、sul、ant(6)、tet、vanⅡ、blaⅠ)均未檢測(cè)到。對(duì)這5株菌而言,基因組上都檢測(cè)到erm、aph、vanⅠ、blaⅡ,B1、G1和L1這3株菌同時(shí)檢測(cè)到aacⅠ,L1還檢測(cè)到aacⅡ;至于aph基因擴(kuò)增片段大小不同,原因是不同的菌抗性基因本身大小不同所致。

圖1 5株菌的抗性基因PCR電泳圖譜

抗性基因在質(zhì)粒上的分布也不一致,其中菌株Z2質(zhì)粒上只檢測(cè)到vanⅠ,而L1質(zhì)粒上4種抗性基因都檢測(cè)到,另外3株菌質(zhì)粒上也分別有2～3種抗性基因。已有文獻(xiàn)表明,乳酸菌中存在接合質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子,接合作用被認(rèn)為是乳酸菌獲得抗性基因的主要方式[26]。目前許多研究者都證實(shí)乳酸菌上的幾種抗性基因會(huì)在乳酸菌與同種菌株或其他菌株之間發(fā)生轉(zhuǎn)移[27],因此有待進(jìn)一步研究質(zhì)粒上的抗性基因是否會(huì)轉(zhuǎn)移到其他菌株上。如果僅在基因組DNA上檢測(cè)到,在質(zhì)粒上卻未檢測(cè)到,說(shuō)明這個(gè)抗性基因可能是固有耐藥基因,不會(huì)發(fā)生水平轉(zhuǎn)移;但只要有抗性質(zhì)粒,就存在抗性質(zhì)粒水平轉(zhuǎn)移的可能性,因此,相較于其它供試菌株,Z2菌株在抗藥性方面更具安全性。

2.3 抗性基因與表型的關(guān)系

表3總結(jié)了抗生素抗性與相關(guān)抗性基因之間的關(guān)系,菌株攜帶的抗藥基因與抗藥表型之間有一定關(guān)聯(lián)。如5株菌對(duì)卡那霉素、萬(wàn)古霉素有抗性,且檢測(cè)到aph、vanⅠ,5株菌對(duì)復(fù)方新諾明敏感,且未檢測(cè)到sul,表型與基因型結(jié)果一致。

表3 抗生素抗性與相關(guān)抗性基因之間的關(guān)系

然而,在部分抗藥菌株中并沒(méi)有檢測(cè)到相應(yīng)的抗藥基因,本研究中5株菌對(duì)喹諾酮類(lèi)抗生素、鏈霉素有抗性,卻未檢測(cè)到相應(yīng)的抗性基因,分析產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是5株菌對(duì)鏈霉素或喹諾酮類(lèi)抗生素的抗性可能是抗性基因檢測(cè)不夠全面,有其他或新的抗性基因?qū)е戮昃哂锌顾幮?還可能是這個(gè)抗性基因在某種特定條件下才會(huì)表達(dá)等其他原因。類(lèi)似的結(jié)果之前也有文獻(xiàn)報(bào)道,Hummel等[28]研究了45種乳酸菌的抗藥性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌BFE 7440對(duì)氯霉素有抗性,卻未檢測(cè)到氯霉素抗性基因cat;Rojo-Bezares等[29]研究了酒中乳酸菌的耐藥性,研究表明植物乳桿菌C709對(duì)萬(wàn)古霉素有抗性,也未檢測(cè)到相關(guān)抗性基因。另外,表型敏感的菌株也可能攜帶抗性基因,本研究中4株菌對(duì)紅霉素敏感,卻都檢測(cè)到紅霉素抗性基因erm。秦宇軒等[30]檢測(cè)了酸奶中分離出的乳酸菌的抗藥性,研究表明干酪乳桿菌對(duì)四環(huán)素敏感,但在干酪乳桿菌中檢測(cè)到四環(huán)素抗性基因tetK、tetM。這可能是因?yàn)槠鋽y帶的抗性基因沉默所致。

5株菌對(duì)不同的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素有不同的敏感性,對(duì)頭孢菌素類(lèi)抗生素、哌拉西林、氨芐西林有較高的敏感性,對(duì)苯唑西林、青霉素G、氨曲南有較高的抗性,5株菌均檢測(cè)到β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗性基因blaⅡ而未檢測(cè)到blaⅠ,分析原因可能是抗性基因blaⅡ?qū)е戮甑目顾幮浴?/p>

2.4 抗性基因的表達(dá)分析

抗性基因能否表達(dá)也是其評(píng)價(jià)指標(biāo)之一,針對(duì)檢測(cè)到的6種抗性基因進(jìn)行了RT-PCR。試驗(yàn)采用了MRS培養(yǎng)和抗生素誘導(dǎo)培養(yǎng)兩種方式,從而進(jìn)一步證明抗性基因的表達(dá)條件。氨基糖苷類(lèi)抗生素選取慶大霉素、卡那霉素,糖肽類(lèi)抗生素用萬(wàn)古霉素,大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)用紅霉素,β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素用青霉素G。除了紅霉素誘導(dǎo)不長(zhǎng)菌之外,其余抗生素誘導(dǎo)都長(zhǎng)菌。

由表4可見(jiàn),對(duì)aph抗性基因來(lái)說(shuō),植物乳桿菌Z2菌株與其它四種菌表現(xiàn)不同,用MRS培養(yǎng)基上卡那霉素抗性基因aph表達(dá),用添加卡那霉素后其aph基因不表達(dá);對(duì)vanⅠ、blaⅡ、aacⅠ和aacⅡ4種抗性基因而言,5株菌在MRS培養(yǎng)基和添加抗生素的MRS培養(yǎng)基中的表達(dá)情況一致,表達(dá)的仍舊表達(dá),不表達(dá)的依然不表達(dá),由此說(shuō)明沉默的抗性基因在誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件下依然沉默,這些沉默的抗性基因可能在特定的條件下才能被激活表達(dá),這個(gè)特定的表達(dá)條件有待進(jìn)一步研究。

表4 抗性基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

5株菌均表現(xiàn)出對(duì)氨基糖苷類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、糖肽類(lèi)抗生素和多粘菌素B的多重抗藥性。其耐藥基因型分別為:Z1和Z2為ermr、aphr、vanⅠr、blaⅡr,B1和G1為ermr、aphr、vanⅠr、blaⅡr、aacⅠr,L1為ermr、aphr、vanⅠr、blaⅡr、aacⅠr、aacⅡr。5株菌質(zhì)粒上所含的抗藥基因數(shù)量不同,Z2菌株質(zhì)粒上因只含一種vanⅠ抗性基因,其應(yīng)用安全性較好。

另外,質(zhì)粒上的抗性基因可能存在轉(zhuǎn)移到其他菌株的風(fēng)險(xiǎn)。目前關(guān)于乳酸菌耐藥性的研究多在耐藥表型、耐藥基因檢測(cè)及耐藥機(jī)制等方面,我們也應(yīng)多研究如何消除耐藥基因及消除耐藥基因后乳酸菌益生性能有無(wú)變化。因此,要加強(qiáng)對(duì)乳酸菌抗藥性的研究,進(jìn)一步研究消除耐藥基因后乳酸菌的益生性變化,從而保障發(fā)酵食品的質(zhì)量安全,同時(shí)為發(fā)酵食品企業(yè)評(píng)估菌株的抗藥性提供理論基礎(chǔ)。