超高壓和熱處理對果蔬中四種香氣合成酶活性與結(jié)構(gòu)的影響

劉德講,陳計巒,裴龍英

(1.信陽市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗測試中心,河南信陽 464000;2.石河子大學(xué),新疆石河子 832003;3.新疆理工學(xué)院,新疆阿克蘇 843000)

在近些年的食品加工中,傳統(tǒng)的熱處理方式對熱敏性食品以及食品中的酶、營養(yǎng)物質(zhì)影響較大,非熱加工技術(shù)日漸應(yīng)用到食品生產(chǎn)中。尤其是超高壓技術(shù),相比與其他的非熱加工技術(shù),其商業(yè)化程度更高且應(yīng)用最廣的一種技術(shù)。超高壓加工的草莓醬可以保留95%的氨基酸,而熱加工處理的草莓醬營養(yǎng)物質(zhì)損失嚴(yán)重且有異味[1]。Liu等[2]研究了高壓(300～600 MPa)和高溫瞬時(110 ℃/8.6 s)對芒果中抗氧化能力、糖類、有機(jī)酸、顏色等的影響,發(fā)現(xiàn)高壓處理的芒果中維生素C、抗氧化能力、顏色等均比高溫瞬時處理的樣品接近新鮮芒果。在過去十幾年中,美國、日本、法國、德國和英國等國家系統(tǒng)地研究了超高壓處理對食品材料的性質(zhì)、酶、風(fēng)味、顏色和微生物的影響。

超高壓可使酶被激活或者鈍化,從而影響酶在香氣合成途徑中的作用,進(jìn)而影響前體物質(zhì)在香氣物質(zhì)之間的轉(zhuǎn)化,最后使得果蔬整體的香氣物質(zhì)含量種類發(fā)生改變,從而改善風(fēng)味[3]。揮發(fā)性成分的代謝途徑復(fù)雜,主要以氨基酸代謝和脂肪酸代謝為主,新鮮水果和蔬菜的主要代謝風(fēng)味物質(zhì)是酯類、醇類和醛類等。在氨基酸代謝和脂肪酸代謝過程中主要的酶有氫過氧化物裂解酶(HPL)、磷脂酶(PLA)、脂氧合酶(LOX)、乙醇脫氫酶(ADH)、?；D(zhuǎn)移酶(AAT)等。LOX酶主要參與以脂肪酸為前體的直鏈酯的合成[4];ADH和AAT主要將醛轉(zhuǎn)化為醇以及醇轉(zhuǎn)化成酯,同時,這種反應(yīng)是可逆的反應(yīng)[5-7]。磷脂酶是一類將非水合磷脂水解成脂肪酸和水合磷脂的酶,也是脂肪酶的一種。在不同的條件加工過程中,酶活性、底物的結(jié)構(gòu)和濃度、pH、溫度均會發(fā)生改變,不同處理條件下香氣成分和風(fēng)味酶的變化有其本身的特點和規(guī)律。Lambadarios等[8]報道在超高壓過程中或解壓以后殘存酶活對實際果實系統(tǒng)可能有一個促進(jìn)影響。

本文分析350～500 MPa壓力的超高壓處理、熱處理(微波處理MW、高溫處理TP)、空白組(CK)對果蔬中四種香氣合成相關(guān)酶(脂氧合酶(LOX)、乙醇脫氫酶(ADH)、磷脂酶A2(PLA2)、?；D(zhuǎn)移酶(AAT))的活性、結(jié)構(gòu)(一級、二級和三級)以及之間相關(guān)性的影響,以期為以后改善香氣和加工方式提供理論依據(jù),同時使加工過程中原有風(fēng)味得到最大限度的保留,提高商品價值,對精深產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

耐高壓塑料包裝袋、ELISA檢測試劑盒、MES、Tris、NADH、磷酸鉀、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)、丙烯酰胺、β-巰基乙醇、溴酚藍(lán)、甘氨酸等試劑 均為分析純,購于沃德生物有限責(zé)任公司;脂肪氧合酶(LOX,5 kU)、?；D(zhuǎn)移酶(AAT,15 kU)、乙醇脫氫酶(ADH,15 kU)、磷脂酶A2(PLA2,1.5 kU)和亞油酸(LA) 美國sigma公司。

CBM-20A紫外分光光度計 日本島津公司;Bio-rad Powerpac Universal SDS-PAGE電泳儀 美國Bio-Rad公司;MOS-450圓二色譜儀 法國MOS公司;HITACHIF-3500熒光分光光度計 日本日立公司;M1-L213B微波爐 美的集團(tuán);HH-42恒溫油浴鍋 常州國華電器有限公司;HPP.L.2-600/0.6超高壓設(shè)備 天津市華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司;PHSJ-4F pH計 山東晨拓科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

1.2.1.1 酶液的制備 LOX用0.05 mol/L pH9.0硼酸緩沖液配成0.10 mg/mL的酶液;AAT用0.20 mol/L pH7.0的Tris-HCl緩沖液配成0.10 mg/mL的酶液;ADH用0.20 mol/L pH8.0的Tris-HCl緩沖液配成0.10 mg/mL的酶液;PLA2用0.20 mol/L pH7.4的Tris-HCl緩沖液配成0.10 mg/mL的酶液。

1.2.1.2 樣品的處理 微波處理(MW)[9]:將30 mL 1.2.1.1制備好的各酶液放入滅菌的錐形瓶中并密封,采用微波功率600 W加熱45 s后取出,迅速用流動自來水冷卻到室溫。

高溫處理(TP)[10]:將1.2.1.1中制備的30 mL酶液置于帶塞試管中,在121 ℃恒溫油浴鍋中加熱45 s,迅速用流動自來水冷卻至室溫。

超高壓處理[11]:將30 mL 1.2.1.1酶液放入真空包裝袋中,真空包裝機(jī)真空密封。超高壓處理設(shè)定4個壓力梯度:350、400、450、500 MPa;溫度:45 ℃;保壓時間:15 min,水為傳壓介質(zhì)。通過循環(huán)泵將壓力釜和水的溫度加熱到45 ℃。將樣品置于高壓釜內(nèi),調(diào)整高壓釜內(nèi)水位,開始處理。所有處理好的樣品均放入冰箱中冷藏備用,放置時間小于4 h。

1.2.2 酶活性的測定

1.2.2.1 LOX的測定 參照宋麗軍[12]的方法有稍微的改動。制備LOX底物亞油酸溶液:60 μL亞油酸,120 μL吐溫20,4 mL蒸餾水,混勻后再加入60 μL 5.00 mol/L氫氧化鈉溶液,充分搖勻至溶液澄清,定容至25.00 mL,置于冰箱冷藏備用。

活性測定:2.88 mL 0.05 mol/L pH9.0硼酸緩沖液,0.10 mL亞油酸溶液,最后加入0.02 mL酶液并混合均勻后。以硼酸緩沖液作對照。室溫下在234 nm的波長處測定吸光度的變化(每隔20秒記錄一次,共記錄3 min),重復(fù)實驗3次。

1.2.2.2 ADH的測定 根據(jù)Ke等[13]描述的方法稍加改動。3.00 mL反應(yīng)體系中包含2.40 mL 0.10 mol/L MES-Tris緩沖液(pH6.5),0.15 mL 1.60 mmol/L NADH,0.15 mL 80.00 mmol/L乙醛,0.30 mL酶液,MES-Tris緩沖液作為對照,室溫下于340 nm波長處測定OD值變化,加酶液15 s后開始計時,記錄1 min內(nèi)數(shù)值的變化,重復(fù)3次。

1.2.2.3 AAT和PLA2的測定 AAT和PLA2使用ELISA檢測試劑盒(Shangle,Shanghai,China)按照制造商的說明進(jìn)行測定活性。

酶活性定義:單位時間內(nèi),1.00 mL酶液吸光度變化0.001定義為1個酶活性單位(U)。

1.2.3 一級結(jié)構(gòu)的測定 采用SDS-PAGE檢測酶的一級結(jié)構(gòu)。

10%分離膠配制:5.90 mL去離子水;5.00 mL丙烯酰胺貯備液;3.80 mL分離膠緩沖液;0.15 mL 10% SDS;0.15 mL 10%過硫酸銨;0.006 mL TEMED;總體積15 mL。

5%濃縮膠配制:3.40 mL去離子水;0.83 mL丙烯酰胺貯備液;0.63 mL濃縮膠緩沖液;0.05 mL 10% SDS;0.05 mL 10%過硫酸銨;0.005 mL TEMED;總體積5 mL。

注入10%的分離膠,待分離膠聚合后,在其上方注入5%的濃縮膠。按預(yù)定順序加樣,每孔上樣量20 μL,開始電泳。電泳時濃縮膠電壓為60 V,分離膠電壓為80 V。電泳結(jié)束后取出膠片,采用考馬斯亮藍(lán)染液進(jìn)行染色,室溫下染色時間1～1.5 h。染色后取出膠片置于甲醇-冰醋酸脫色液中脫色10～12 h至凝膠背景清楚,其間更換多次脫色液。

1.2.4 二級結(jié)構(gòu)的測定 利用圓二色譜測定二級結(jié)構(gòu)。四種酶液的光譜掃描波長范圍全采用全波長掃描,在室溫下進(jìn)行四次重復(fù)掃描。圖譜經(jīng)過儀器本底消除和溶液空白差減。掃描速度為20 nm/min,時間常數(shù)為2.0 s,帶寬為1.0 nm。每種酶液的緩沖液分別作為空白校正數(shù)據(jù)。圓二色性以平均摩爾橢圓率(θ,deg·cm2/mol)表示。CD光譜采用K2D軟件來分析所有酶的二級結(jié)構(gòu)組成。

1.2.5 三級結(jié)構(gòu)的測定 采用熒光光譜法檢測酶的三級結(jié)構(gòu)。先用蒸餾水進(jìn)行儀器校準(zhǔn),LOX酶的激發(fā)波長λex=285 nm,掃描范圍200～400 nm,靈敏度為6,狹縫為10 nm。AAT酶的激發(fā)波長λex=412 nm,掃描范圍300～600 nm,靈敏度為5,狹縫為10 nm。ADH酶的激發(fā)波長λex=295 nm,掃描范圍300～500 nm,靈敏度為2,狹縫為10 nm。PLA2酶的激發(fā)波長λex=280 nm,掃描范圍290～450 nm,靈敏度為4,狹縫為10 nm。四種酶均在室溫下測定,重復(fù)掃描三次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPASS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,且所有實驗均有三組平行試驗。繪圖采用Origin 8.5。熱圖和相關(guān)性分析采用R語言中Complex Heatmap包。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓和熱處理對LOX的影響

2.1.1 超高壓和熱處理對LOX活性的影響 由圖1可以看出,經(jīng)過不同壓力和熱處理后LOX活性均顯著降低(P<0.05),且在超高壓組內(nèi)隨著壓力的增加呈降低的趨勢,450和500 MPa處理的樣品間的酶活性差異不顯著(P>0.05)。兩種熱處理的LOX活性均顯著低于超高壓處理,TP組比空白組下降了61%。

圖1 不同處理方式下LOX活性的變化

Rodrigo等[14]通過對番茄汁中的LOX酶研究發(fā)現(xiàn),除高溫失活外,在較高壓力下例如550 MPa/12 min或600 MPa/10 min,LOX會失去更多活性,這與本實驗結(jié)果類似。Apichartsrangkoon等[15]發(fā)現(xiàn)LOX在300～500 MPa壓力下活性會降低。在對超高壓處理的哈密瓜汁研究中有類似結(jié)果,壓力大于300 MPa時LOX酶活性被抑制[12]。

2.1.2 超高壓和熱處理對LOX一級結(jié)構(gòu)的影響 LOX酶一級結(jié)構(gòu)變化如圖2所示,經(jīng)過不同條件處理的LOX酶均只有一條條帶,說明四種超高壓處理和兩種熱處理均沒有導(dǎo)致LOX分子肽鏈的斷裂,也就是說LOX的一級結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化。該結(jié)果與多種研究[12,16-17]相同,通過不同壓力和溫度對LOX進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),壓力和溫度都沒有改變LOX酶的一級結(jié)構(gòu)。

圖2 不同處理后LOX的SDS-PAGE電泳圖

2.1.3 超高壓和熱處理對LOX二級結(jié)構(gòu)的影響 從表1可以看出,與空白組對比,經(jīng)過不同處理后,α-螺旋的含量均減少,500 MPa樣品下降最顯著(P<0.05)。與空白組對比,隨著壓力的增加β-折疊含量呈顯著增加的趨勢,而微波處理的樣品β-折疊含量顯著下降(P<0.05)。除了400 MPa樣品中無規(guī)則卷曲的含量有輕微的下降,經(jīng)過不同處理后β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲的含量均出現(xiàn)增加趨勢,其中微波處理增加最顯著(P<0.05)。

表1 不同處理后LOX二級結(jié)構(gòu)含量的變化

王幫國[16]研究了超高壓對LOX酶二級結(jié)構(gòu)的影響,結(jié)果顯示壓力從150 MPa以50 MPa為梯度增加到400 MPa時,α-螺旋、β-折疊含量明顯下降,并且隨著壓力增加,二級結(jié)構(gòu)變化顯著。與本實驗結(jié)果有所差異的原因,可能是原材料和壓力的取值不同。

2.1.4 超高壓和熱處理對LOX三級結(jié)構(gòu)的影響 從圖3中可以看出,空白組的熒光值最低,經(jīng)過不同處理后熒光值均有所增加;超高壓處理組隨著壓力的增加熒光強(qiáng)度呈增加的趨勢,350與500 MPa相比峰向長波方向偏移,500 MPa樣品在312 nm出現(xiàn)最高峰,峰值為496.64;TP處理在所有處理中熒光值最大,為569.09。以上可知,不同處理方式對LOX分子熒光強(qiáng)度的影響不同,造成這種現(xiàn)象的原因可能是壓力和溫度對一些芳香族殘基例如色氨酸、酪氨酸有一定影響,使得這些氨基酸不斷由分子內(nèi)非極性環(huán)境中暴露在外部極性環(huán)境中,造成熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。宋麗軍[12]研究發(fā)現(xiàn),不同壓力和溫度對LOX酶的熒光強(qiáng)度有影響,熒光強(qiáng)度隨著壓力的增加逐步增加,且溫度對LOX酶的熒光強(qiáng)度也有顯著影響，與本結(jié)論相似。

圖3 不同處理后LOX的熒光光譜圖

2.2 超高壓和熱處理對ADH酶的影響

2.2.1 超高壓和熱處理對ADH酶活性的影響 由圖4可知,經(jīng)過超高壓和熱處理后,ADH酶的活力有不同程度的增加(超高壓500 MPa除外)。其中,TP樣品增加最顯著,達(dá)到了23.8 U/mL(P<0.05)。酶的活化原因可能是:第一,酶構(gòu)象的可逆性或發(fā)生酶促反應(yīng)的活性位點發(fā)生重排[18];第二,在增加壓力后,距離基質(zhì)近的酶的靈敏度可能增加;第三,在高壓力條件下,溶劑被壓縮使得反應(yīng)速率增快,底物濃度可能會增大[19]。高壓組內(nèi),隨著壓力的增大,400和500 MPa樣品ADH的活力呈下降趨勢,350和450 MPa樣品間酶活力變化不顯著(P>0.05),但500 MPa樣品的活性急劇下降,值為12.7 U/mL,急劇下降的原因可能是壓力達(dá)到了較高水平。

圖4 不同處理方式下ADH活性的變化

酶活性的變化不僅與壓力、溫度、作用時間等外界環(huán)境密切相關(guān),與其本身特性和內(nèi)在原因也有較大關(guān)系,例如香蕉中乙烯含量與ADH活性成正相關(guān)[20],甜柿成熟前期可溶性單寧含量增加,ADH活性增加,果實脫澀后,ADH活性又出現(xiàn)降低現(xiàn)象[21]。

2.2.2 超高壓和熱處理對ADH一級結(jié)構(gòu)的影響 從圖5可以看,經(jīng)過不同條件處理的ADH有且只有一條條帶,說明4種超高壓處理和2種熱處理都沒有導(dǎo)致ADH分子肽鏈的斷裂,即超高壓處理和熱處理的ADH酶一級結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變。

圖5 不同處理后ADH的SDS-PAGE電泳圖

2.2.3 超高壓和熱處理對ADH二級結(jié)構(gòu)的影響 由表2可以看出不同處理條件下ADH的二級結(jié)構(gòu)的變化?？瞻捉M中α-螺旋的含量為9.1%,400 MPa時,α-螺旋的含量急劇降到了0.2%。TP處理中α-螺旋的含量恰好相反,出現(xiàn)顯著的增加,在所有處理中α-螺旋的含量最高,可能是較高溫度所導(dǎo)致的。超高壓組的β-折疊的變化與α-螺旋的變化趨勢相似。超高壓組β-轉(zhuǎn)角的變化與空白相比,350和500 MPa樣品的含量均有所增加,而450 MPa變化不顯著(P>0.05)。隨著壓力增加,與空白組對比,β-轉(zhuǎn)角有不同程度的增加(450 MPa除外)。在微波處理中β-轉(zhuǎn)角的含量只有2%,是所有處理中最低。無規(guī)則卷曲的變化比較多樣,微波加熱中無規(guī)則卷曲的含量最高,達(dá)到了90%。推測可能是較高的溫度導(dǎo)致維持ADH酶分子立體構(gòu)象的部分次級鍵斷裂或者不穩(wěn)定,導(dǎo)致其構(gòu)象進(jìn)一步崩潰。

表2 不同處理后ADH的二級結(jié)構(gòu)含量變化

2.2.4 超高壓和熱處理對ADH三級結(jié)構(gòu)的影響 圖6是ADH酶經(jīng)過不同處理后的熒光光譜圖，經(jīng)過不同方式處理后ADH的熒光強(qiáng)度均有所降低。CK組的熒光峰值最大,為238.23,其次是微波處理;超高壓處理組中,500 MPa熒光峰值最大,其次是350、450、400 MPa,且峰位有不同程度的偏移,其中350 MPa處理的樣品與400和450 MPa樣品比較,出現(xiàn)了341～351 nm處向右10 nm的最大偏移。出現(xiàn)偏移主要是因為壓力和溫度的存在,與蛋白質(zhì)濃度無關(guān)[22]。超高壓處理與熱處理對比發(fā)現(xiàn),兩種加熱處理的ADH酶熒光強(qiáng)度高于350～450 MPa的熒光強(qiáng)度。

圖6 不同處理后ADH的熒光光譜圖

2.3 不同超高壓和熱處理對AAT的影響

2.3.1 不同超高壓和熱處理對AAT活性的影響 由圖7可以看出,空白組樣品的AAT酶活力最高,為27.93 U/mL。經(jīng)過不同壓力和熱處理后AAT酶活力均出現(xiàn)不同程度的降低。超高壓組中,400 MPa樣品的活力最大達(dá)到了25.5 U/mL,其后依次是350、500、450 MPa的酶活。熱處理組中TP樣品的AAT活性顯著降低(P<0.05)。

圖7 不同處理方式下AAT活性的變化

2.3.2 超高壓和熱處理對AAT一級結(jié)構(gòu)的影響 從圖8中可以看,經(jīng)過不同條件處理的AAT酶有且只有一條條帶,說明4種超高壓處理和2種熱處理均沒有導(dǎo)致AAT分子肽鏈的斷裂,也就是說不同壓力的超高壓處理和不同的熱處理方式均沒有改變AAT酶的一級結(jié)構(gòu)。

圖8 不同處理后AAT的SDS-PAGE電泳圖

2.3.3 超高壓和熱處理對AAT二級結(jié)構(gòu)的影響 由表3可知,與空白組相比,350、400、500 MPa和TP處理中α-螺旋含量有顯著提高(P<0.05),450 MPa和MW處理中α-螺旋含量有顯著減少(P<0.05),MW樣品中α-螺旋含量最少僅有2.8%。β-折疊的變化與空白組相比,450 MPa和微波處理中β-折疊有顯著增加,含量分別為45.9%和49.0%,而TP處理下降最明顯,含量僅有0.3%。無規(guī)則卷曲經(jīng)過不同處理后均有不同的降低。從整體來看,350、500 MPa以及TP處理的變化主要以α-螺旋為主,而450 MPa和MW處理主要以β-折疊的為主。

表3 不同處理后AAT的二級結(jié)構(gòu)含量變化

2.3.4 超高壓和熱處理對AAT三級結(jié)構(gòu)的影響 由圖9可以看出,以空白組為分界線,超高壓處理組的熒光光譜均在空白組之上,兩種熱處理均在空白組之下,即經(jīng)過不同高壓處理增強(qiáng)了AAT酶的熒光強(qiáng)度,且峰位均向左有不同程度的偏移,而經(jīng)過熱處理后減弱了AAT酶的熒光強(qiáng)度,但峰位沒有發(fā)生偏移。原因可能是,超高壓處理破壞了酶分子中鍵的連接模式,拉遠(yuǎn)了酶分子中的色氨酸殘基和酪氨酸殘基等氨基酸之間的距離,使酪氨酸無法再把其能量通過共振形式傳遞給色氨酸,從而使熒光強(qiáng)度改變[23]。

圖9 不同處理后AAT的熒光光譜圖

2.4 不同超高壓和熱處理對PLA2的影響

2.4.1 不同超高壓和熱處理對PLA2活性的影響 從圖10可以看出,經(jīng)過超高壓和加熱處理后,PLA2活力呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(P<0.05)。在超高壓組中,隨著壓力的增加整體也呈現(xiàn)降低的趨勢,熱處理組中TP樣品在所有處理中酶活性最低(P<0.05)。Suladze等[24]使用傅里葉紅外光譜分析了PLA2的活性,結(jié)果與本實驗相似,均表明較大壓力會降低PLA2酶的活性,其原因分析可能是較強(qiáng)的壓力使酶與底物結(jié)合的狀態(tài)受到破壞導(dǎo)致的。

圖10 不同處理方式下PLA2活性的變化

2.4.2 超高壓和熱處理對PLA2一級結(jié)構(gòu)的影響 如圖11是PLA2在7種條件下的SDS-PAGE電泳圖,經(jīng)過不同條件處理的PLA2酶液有且只有一條條帶,說明無論是超高壓處理還是熱處理均沒有使PLA2分子肽鏈斷裂,也就說明超高壓處理和熱處理均沒有改變PLA2酶的一級結(jié)構(gòu)。通常,通過幾次共價相互作用構(gòu)建的酶的一級結(jié)構(gòu)在加壓時不受影響。高壓通過改變靜電和疏水相互作用以及氫鍵影響酶的三級和四級結(jié)構(gòu)[25]。Hayakawa等[26]通過其β-螺旋含量和示差掃描量熱法(DSC)吸熱焓的降低來證實,壓力處理只有構(gòu)象變化,因為沒有觀察到PAGE圖譜的變化。

圖11 超高壓和熱處理處理后PLA2的SDS-PAGE電泳圖

2.4.3 超高壓和熱處理對PLA2二級結(jié)構(gòu)的影響 由表4可知,空白組中80%都是α-螺旋和β-折疊這兩種結(jié)構(gòu)。經(jīng)過不同壓力和熱處理處理后,α-螺旋和β-折疊含量均顯著降低(P<0.05)。β-轉(zhuǎn)角的變化與α-螺旋和β-折疊的變化相反,經(jīng)過高壓和熱處理后β-轉(zhuǎn)角的含量都有不同程度的升高,其中MW處理后β-轉(zhuǎn)角的含量在所有處理中最高,達(dá)到了30.7%。無規(guī)則卷曲的變化與β-轉(zhuǎn)角變化相似,經(jīng)過高壓和熱處理后β-轉(zhuǎn)角的含量都有不同程度的升高。Suladze等[24]使用高壓停流熒光光譜研究高壓對PLA2的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,結(jié)果顯示PLA2與生物膜的結(jié)合不受壓力的顯著影響,但可以鈍化酶的活性,α-螺旋結(jié)構(gòu)隨著壓力增加而減少。

表4 不同處理后PLA2的二級結(jié)構(gòu)的變化

2.4.4 超高壓和熱處理對PLA2三級結(jié)構(gòu)的影響 圖12是PLA2酶經(jīng)過不同的方式處理后的熒光光譜圖,不同的處理方式PLA2酶的熒光強(qiáng)度和峰位都發(fā)生了不同程度的改變,但是峰型沒有變化?？瞻捉M在336 nm處有熒光最大值為830.93,經(jīng)過不同高壓處理和熱處理后熒光強(qiáng)度都有所降低,且熱處理組均低于超高壓處理組。在超高壓處理組中,壓力350～450 MPa熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)降低的趨勢,且隨著壓力升高，出現(xiàn)了向短波方向偏移的現(xiàn)象。推測其原因可能是超高壓增強(qiáng)了色氨酸殘基和酪氨酸殘基的疏水特性,出現(xiàn)向短波方向偏移現(xiàn)象[27]。

圖12 不同處理后PLA2的熒光光譜圖

2.5 超高壓和熱處理條件下四種酶活性與結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析

由表5可以看出,經(jīng)過超高壓和熱處理后,LOX和PLA2活性均與α-螺旋呈顯著正相關(guān);超高壓組的LOX與熱處理組的ADH均與β-折疊呈顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別是0.935(P<0.01)、0.851(P<0.05);熱處理組的LOX和超高壓處理組的AAT與β-轉(zhuǎn)角相關(guān)較強(qiáng)(P<0.01),相關(guān)系數(shù)分別是-0.960、0.776;超高壓組的LOX與熱處理組的PLA2均與無規(guī)則卷曲有顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05);不同處理的LOX、PLA2以及超高壓處理的ADH均與熒光強(qiáng)度有顯著相關(guān)。

表5 不同處理中四種酶活性與結(jié)構(gòu)的相關(guān)性分析

酶是大分子，通常具有多級結(jié)構(gòu),分子結(jié)構(gòu)的變化與活性的關(guān)系密切相關(guān)[28]。超高壓處理是一種高強(qiáng)度動力作用,可能會破壞酶分子的高級結(jié)構(gòu)并影響到活性。在對草莓汁的研究中也得出類似結(jié)論,酶空間結(jié)構(gòu)的改變對酶活性有較大影響[29]。鐘葵等[30]采用高壓脈沖電場對LOX酶構(gòu)象的研究發(fā)現(xiàn),隨著電場強(qiáng)度的增強(qiáng),LOX酶分子中α-螺旋含量及酶活性降低,β-折疊含量增加,且與α-螺旋及β-折疊的含量呈良好的線性關(guān)系(R2>0.900)。Dallet等[31]發(fā)現(xiàn)酵母醇脫氫酶(YADH)的活性通過壓力的增加而持續(xù)被抑制,同時不同壓力對酶熒光強(qiáng)度有一定影響,進(jìn)而對活性產(chǎn)生正面或負(fù)面影響。邱春江[17]發(fā)現(xiàn)溫度大于70 ℃,LOX的α-螺旋、β-折疊含量降低,逐漸變成松散狀態(tài),進(jìn)一步導(dǎo)致LOX變性,酶活降低,這與本實驗結(jié)論類似。胡國洲[32]研究微波處理后活性與β-折疊含量又較強(qiáng)相關(guān)性。涂宗財?shù)萚33]研究得出蛋白質(zhì)的微觀結(jié)構(gòu)與加工壓力有關(guān),圓二色譜顯示了卵清蛋白在經(jīng)過不同壓力加工后α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲之間發(fā)生相互轉(zhuǎn)化,且與活性有較大的相關(guān)性。

3 結(jié)論

超高壓處理和熱處理對LOX、ADH、AAT、PLA2酶的活性與二、三級結(jié)構(gòu)有較大影響。其中隨著壓力的增加和不同的熱處理LOX、AAT、PLA2酶活性降低,ADH活性升高;LOX經(jīng)過超高壓處理后α-螺旋含量明顯降低,但熒光強(qiáng)度均高于對照組,活性與結(jié)構(gòu)相關(guān)性分析中也顯示α-螺旋、熒光強(qiáng)度均與LOX活性有強(qiáng)相關(guān);ADH酶的熒光強(qiáng)度均低于對照組,活性與熒光強(qiáng)度有較大負(fù)相關(guān);超高壓處理后AAT的熒光強(qiáng)度均高于對照組,熱處理組中AAT的熒光強(qiáng)度均低于對照組;經(jīng)過超高壓和熱處理后PLA2酶α-螺旋含量有不同程度的降低,活性主要與α-螺旋、熒光強(qiáng)度有強(qiáng)烈相關(guān)性。