裂葉蕁麻體外降糖活性化學(xué)成分

楊文娟,胡 媛,毛跟年,何亞娟,侯景龍,馬養(yǎng)民

(1.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,陜西西安 710021;2.陜西科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,教育部輕化工助劑化學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710021)

裂葉蕁麻(UrticafissaE. Pritz.)為蕁麻科蕁麻屬多年生草本植物,始載于《本草圖經(jīng)》,是常用的民族藥和民間藥[1],又叫蜇人草、蝎子草等,在我國(guó)西北、西南等地分布十分廣泛[2],具有祛風(fēng)除濕、活血止痛、降血糖等功能,其莖皮纖維可供紡織用,葉和嫩枝煮后可作為飼料[3]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于蕁麻屬植物的根、莖、葉、種子等不同部位的化學(xué)成分有較多研究,王夢(mèng)月等[4-6]研究了裂葉蕁麻根、葉的化學(xué)成分,Zhang等[7]研究了裂葉蕁麻種子中具有細(xì)胞毒性的化學(xué)成分,何斌[8]用HPLC法檢測(cè)了異株蕁麻莖中的綠原酸和黃酮類(lèi)化合物等,表明蕁麻屬植物含有黃酮、木脂素、有機(jī)酸、甾體、揮發(fā)油、多糖類(lèi)等化合物[9-12]。此外,蕁麻屬植物具有良好的抑制良性前列腺增生、抗風(fēng)濕、降血糖、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抗氧化等藥理活性[13-16],蕁麻屬植物降血糖活性成為近年來(lái)的主要研究熱點(diǎn)之一,Mehri等[17]從多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出21篇文章,分析了蕁麻水提物或醇提物在治療糖尿病中的療效和安全性,表明使用蕁麻可顯著降低血糖和糖尿病并發(fā)癥。裂葉蕁麻乙醇提取物對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病小鼠的肝臟、腎臟損傷的作用,發(fā)現(xiàn)其保護(hù)作用與抗氧化活性相關(guān)[18-19]。

糖尿病是一種慢性?xún)?nèi)分泌代謝紊亂疾病,發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體長(zhǎng)期的高血糖會(huì)引起糖尿病腎病、糖尿病足、糖尿病性腦血管病等并發(fā)癥,而避免和控制糖尿病并發(fā)癥的最佳方式就是控制血糖,控制血糖有多種途徑,減少體內(nèi)淀粉類(lèi)物質(zhì)分解為單糖的速度、降低餐后血糖就是臨床常用方法之一[20]。α-葡萄糖苷酶在食物碳水化合物的代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,它能促進(jìn)淀粉、蔗糖、麥芽糖等分解為單糖,抑制α-葡萄糖苷酶能夠減少單糖的產(chǎn)生,從而降低餐后血糖[21-22]。因此,對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用的研究為評(píng)價(jià)體外降糖活性的常用研究方法。從中藥或天然植物中篩選降糖活性成分如小檗堿、葛根素、黃芪多糖等具有明確的調(diào)節(jié)血糖血脂作用,臨床用于緩解糖尿病及其并發(fā)癥[23-25]。除了從傳統(tǒng)中藥篩選外,其他天然植物如木樨欖葉、鷹嘴豆、綠蘿花等也進(jìn)行了化學(xué)成分及降糖活性研究[26-28]。

目前蕁麻主要集中于水提物或醇提物的降糖活性研究[29-30],而其降糖的物質(zhì)基礎(chǔ)鮮有報(bào)道。因此,本研究以α-葡萄糖苷酶的抑制作用為追蹤手段,篩選裂葉蕁麻體外降糖活性部位,并分離鑒定其化學(xué)成分,明確具有體外降糖活性的化合物。以期為闡明裂葉蕁麻治療糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ),也為開(kāi)發(fā)該植物資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

裂葉蕁麻 采自陜西省旬陽(yáng)縣,經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)顏永剛教授鑒定為蕁麻科蕁麻屬植物裂葉蕁麻(UrticafissaE.Pritz.);α-葡萄糖苷酶(23.5 U/kg)、阿卡波糖、對(duì)硝基苯酚(pNP)、對(duì)硝基苯-α-D葡萄糖吡喃苷(pNPG) 上海源葉生物科技有限公司;二甲基亞砜(DMSO) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;柱層析色譜硅膠 青島海浪硅膠干燥劑有限公司;其他試劑 均為分析純。

全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀 賽默飛世爾科技有限公司;BrukeravanceⅢ-400MHz超導(dǎo)核磁共振儀 瑞士Bruker公司;XW-80A渦旋混合儀 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司;XT5顯微熔點(diǎn)分析儀 北京市科儀電光儀器廠;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市江南儀器廠;JA26038電子天平 上海天美天平儀器有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱(chēng)取0.0014 g pNP標(biāo)準(zhǔn)品,用PBS(磷酸鹽緩沖溶液,0.1mol/L,pH=6.7)溶液超聲溶解,定容至10 mL容量瓶中,得濃度為0.001 mmol/L的pNP母液,將其稀釋成一系列濃度為1.000、0.500、0.250、0.125、0.063、0.031、0.016 mmol/L的溶液。分別取以上不同濃度的pNP溶液各100 μL加入96孔板,再加入1 mol/L的Na2CO3溶液100 μL,振蕩10 s后,在波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定其吸光度,每組濃度平行測(cè)定三次,求其平均值。以吸光度為縱坐標(biāo),以pNP摩爾濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 裂葉蕁麻提取部位的篩選 將裂葉蕁麻植株分為根、莖、葉三部分,陰干使其含水量在5%之內(nèi),取根、莖、葉各200 g,粉碎,過(guò)60目篩,用10倍量70%乙醇浸提3次,每次2 h,合并提取液,在0.1 MPa,65 ℃下減壓濃縮成浸膏,65 ℃干燥至恒重,備用。分別精密稱(chēng)取根、莖、葉干浸膏0.1000 g,用DMSO溶解配成10 mg/mL的母液,并分別稀釋成一系列濃度為1、2、4、6、8、10 mg/mL的溶液,陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖與樣品配制成相同的濃度梯度,并檢測(cè)α-葡萄糖苷酶抑制率。

1.2.3 裂葉蕁麻乙醇提取物不同溶劑萃取相的篩選 選擇體外活性較高的裂葉蕁麻部位進(jìn)行化學(xué)成分的初步分離,取其粗粉3 kg,用10倍量70%乙醇浸提3次,每次48 h,每隔8 h攪拌一次,合并提取液,在0.1 MPa 65 ℃下減壓濃縮成浸膏,65 ℃干燥至恒重,得到醇提物干浸膏260.58g,然后將其懸浮于水中,依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,分別減壓回收溶劑,得到石油醚相浸膏20.00 g,乙酸乙酯相浸膏13.63 g,正丁醇相浸膏127.50 g,水相(萃余部分)浸膏76.37 g。分別精密稱(chēng)取以上四相浸膏0.1000 g,用DMSO溶解配成10 mg/mL的母液,并分別稀釋成一系列濃度為1、2、4、6、8、10 mg/mL的溶液,陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖與樣品配制成相同的濃度梯度,并檢測(cè)α-葡萄糖苷酶抑制率。

1.2.4 化學(xué)成分的分離及結(jié)構(gòu)鑒定 選擇體外活性較高的萃取相進(jìn)行化學(xué)成分分離,取該萃取相濃縮后的浸膏13.00 g,用90 mL甲醇溶解,25.00 g硅膠拌樣,在80 ℃的烘箱中放置24 h至恒重,經(jīng)硅膠柱層析,石油醚-乙酸乙酯(100∶0、100∶10、100∶20、100∶50、100∶100)、乙酸乙酯-甲醇(100∶0、100∶10、100∶20、100∶50、0∶100)梯度洗脫,每個(gè)梯度設(shè)置6個(gè)洗脫體積,采用重結(jié)晶來(lái)進(jìn)行分離純化,石油醚∶乙酸乙酯=100∶10的第5個(gè)洗脫體積經(jīng)重結(jié)晶得到化合物1(15.4 mg)、石油醚∶乙酸乙酯=100∶20的第1個(gè)洗脫體積經(jīng)重結(jié)晶得到化合物2(7.7 mg)、石油醚∶乙酸乙酯=100∶20的第2個(gè)洗脫體積經(jīng)重結(jié)晶得到化合物3(13.34 mg)和4(20.50 mg)、石油醚∶乙酸乙酯=100∶20的第2個(gè)洗脫體積經(jīng)重結(jié)晶得到化合物5(10.23 mg),乙酸乙酯洗脫梯度的第6個(gè)洗脫體積經(jīng)重結(jié)晶得到化合物6(20.39 mg),結(jié)合理化性質(zhì),通過(guò)1H-NMR、13C-NMR等方法對(duì)所得化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

1.2.5 化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率 分別精密稱(chēng)取6個(gè)化合物0.0050 g,DMSO溶解配成1 mg/mL的母液,并分別稀釋成一系列濃度為1、2、4、6、8、10 mg/mL的溶液,陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖與樣品配制成相同的濃度梯度,并檢測(cè)α-葡萄糖苷酶抑制率。

1.2.6α-葡萄糖苷酶抑制率的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)參照J(rèn)eon等[31]的方法,選定200 μL的反應(yīng)體系,首先在96微孔板中加入10 μL的樣品溶液,再加入40 μLα-葡萄糖苷酶(0.5 U/mL),迅速放入37 ℃微孔板恒溫振蕩器中孵化10 min,然后在反應(yīng)混合物中加入50 μL的底物溶液(pNPG),迅速放入37 ℃微孔板恒溫振蕩器中反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束后加入100 μL終止液來(lái)終止反應(yīng),于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照,加樣方法如表所示(表1),每組3孔,按式1計(jì)算α-葡萄糖苷酶的抑制率,并計(jì)算其半數(shù)抑制濃度(IC50)。

表1 α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定的加樣量(μL)

隨著我國(guó)社會(huì)的不斷發(fā)展，我國(guó)經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)的速度越來(lái)越快。在過(guò)去的發(fā)展歷程中，我國(guó)很多經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)是以環(huán)境的破壞為代價(jià)而取得的，在近些年，環(huán)境保護(hù)已經(jīng)成為了我國(guó)新的發(fā)展重心。隨著我國(guó)對(duì)于環(huán)境保護(hù)和生態(tài)建設(shè)的重視度越來(lái)越高，林業(yè)發(fā)展成為了人們關(guān)注的重點(diǎn)，本文針對(duì)林木種苗的現(xiàn)現(xiàn)狀進(jìn)行了闡述，并對(duì)其培育技術(shù)和管護(hù)要點(diǎn)進(jìn)行了分析。

式中:A1為樣品組的吸光度;A2為樣品背景組的吸光度;A3為空白對(duì)照組的吸光度;A2為空白對(duì)照背景組的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用Origin 8.0及SPSS 24.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線

pNP的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1,得到回歸方程為y=0.0009x+0.0552,R2=0.998,說(shuō)明pNP在0.016～1.000 mmol/L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖1 pNP標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 裂葉蕁麻提取部位的降糖活性篩選

由α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定結(jié)果可知(圖2),裂葉蕁麻不同部位對(duì)α-葡萄糖苷酶均有一定抑制作用,但作用強(qiáng)度有差別,根、莖、葉的IC50值分別為11.809、12.402、20.169 mg/mL,由此可見(jiàn),其抑制活性強(qiáng)弱順序?yàn)楦?莖>葉,裂葉蕁麻根的抑制作用最強(qiáng),因此,后續(xù)研究對(duì)裂葉蕁麻根進(jìn)行體外活性部位的篩選。

圖2 裂葉蕁麻不同部位對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率

2.3 裂葉蕁麻乙醇提取物不同溶劑萃取相的降糖活性篩選

由α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定結(jié)果可知(圖3),裂葉蕁麻根不同極性部位對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用有明顯差別,其中,石油醚相對(duì)α-葡萄糖苷酶幾乎沒(méi)有抑制作用,乙酸乙酯相、正丁醇相和水相對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值分別為8.499、13.241、19.774 mg/mL,由此可知,萃取相對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性強(qiáng)弱順序?yàn)橐宜嵋阴ハ?正丁醇相>水相>石油醚相,乙酸乙酯相的抑制作用最強(qiáng),因此,對(duì)裂葉蕁麻根乙酸乙酯相的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分離及活性成分鑒定。

圖3 裂葉蕁麻根不同極性部位對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率

2.4 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1:白色針狀結(jié)晶,ESI-HR-MS:576.43518[M+H]+,分子式為C35H60O6,mp297～299 ℃,1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δH:5.34(1H,d,J=5.0 Hz,H-6),3.52(1H,s,H-3),1.01(3H,s,H-19),0.92(3H,s,H-21),0.70(3H,d,J=6.4 Hz,H-18),13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δC:140.37(C-5),121.76(C-6),71.83(C-3),56.75(C-14)、56.01(C-17)、50.10(C-9)、45.79(C-24)、42.27(C-13)、40.56(C-4)、37.24(C-12)、36.51(C-1)、36.16(C-10)、33.92(C-20)、31.89(C-22)、31.64(C-8)、29.09(C-7)、28.28(C-2)、24.32(C-23)、27.23(C-25)、25.98(C-16)、23.01(C-15)、21.08(C-28)、19.86(C-11)、19.43(C-26)、19.43(C-27),19.03(C-19)、18.79(C-21)、12.00(C-18)、11.88(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[32]報(bào)道基本一致,故鑒定為對(duì)β-谷甾醇。

化合物2:白色粉末,ESI-HR-MS:179.07028[M+H]+,分子式為C10H10O3,mp 216～218 ℃,1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δH:7.67(1H,d,J=15.9 Hz,H-β),7.46(2H,d,J=8.2Hz,H-2,H-6),6.88(2H,d,J=8.2 Hz,H-3,H-5),6.33(1H,d,J=15.9 Hz,H-α),3.83(1H,S,-OCH3)。13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δC:168.03(C=O)、157.70(C-4)、144.67(C-β)、130.02(C-3、C-5)、127.19(C-1)、115.89(C-2、C-6)、115.18(C-α)、51.75(-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[33]報(bào)道基本一致,故鑒定為對(duì)羥基桂皮酸甲酯。

化合物4:白色粉末,ESI-HR-MS:137.05972[M+H]+,分子式為C8H8O2,mp-2～-1 ℃,1H-NMR(400 MHz,CDCl3)δH:7.81(2H,d,J=8.5Hz,H-2,H-6),6.97(2H,d,J=8.2Hz,H-3,H-5),3.81(3H,s,H-OCH3),9.84(1H,s,H-CHO)。13C-NMR(100 MHz,CDCl3)δC:191.54(C-1)、162.68(C-4)、132.57(C-2、C-6)、130.01(C-CHO)、116.07(C-3、C-5),51.78(C-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[35]基本一致,故鑒定為對(duì)甲氧基苯甲醛。

化合物5:白色粉末,ESI-HR-MS:165.05449[M+H]+,分子式為C9H8O3,mp 210～212 ℃,1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δH:7.53(2H,d,J=5.0Hz,H-2,H-6),6.79(2H,d,J=5.0 Hz,H-3,H-5),6.30(1H,d,J=15.9 Hz,H-α),7.50(1H,d,J=12.3Hz,H-β),根據(jù)耦合常數(shù)判斷為反式雙鍵,并且該雙鍵和吸電子基團(tuán)相連。13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δC:168.46(COOH)、125.70(C-1)、144.68(C-β)、160.05(C-4)、115.75(C-α)116.19(C-3、C-5)、130.59(C-2,C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[36]報(bào)道基本一致,故鑒定為反式-對(duì)羥基肉桂酸。

化合物6:白色粉末,ESI-HR-MS:576.43518[M+H]+,分子式為C35H60O6,mp 297～299 ℃,1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6),δH:5.34(1H,m,H-6),4.91(1H,H-1′),4.47(2H,t,J=11.50 Hz,H-6′),4.21(1H,d,J=7.70 Hz,H-4′),3.09(1H,m,H-3),0.99(3H,H-21),0.96(3H,H-19),0.91(3H,d,J=6.30 Hz,H-4′),0.84(3H,H-29),0.81(3H,H-27),0.68(3H,s,H-18)。13C-NMR(100 MHz,DMSO-d6)δC:140.37(C-5)、121.76(C-6)、99.98(C-1′)、77.36(C-3)、77.04(C-3′)、76.72(C-5′)、73.50(C-2′)、71.83(C-4′)、56.85(C-6′)、56.75(C-14)、56.01(C-17)、51.25(C-9)、45.79(C-24)、40.56(C-13)、39.76(C-12)、37.24(C-4)、36.58(C-20)、36.16(C-1)、35.89(C-10)、33.70(C-22)、31.91(C-7)、31.64(C-8)、28.97(C-2)、28.22(C-25)、27.23(C-16)、25.45(C-15)、24.32(C-18)、23.04(C-18)、21.24(C-11)、19.86(C-26)、19.43(C-19)、18.79(C-21)、18.27(C-27)、12.31(C-18)、12.06(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[37]報(bào)道基本一致,故鑒定為對(duì)胡蘿卜苷。

2.5 化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由α-葡萄糖苷酶抑制活性測(cè)定結(jié)果可知(圖4),裂葉蕁麻根乙酸乙酯相分離的6種化合物對(duì)對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用有明顯差別,其中,β-谷甾醇和對(duì)甲氧基苯甲醛對(duì)α-葡萄糖苷酶幾乎沒(méi)有抑制作用,對(duì)羥基桂皮酸甲酯、正十六烷酸、反式-對(duì)羥基肉桂酸、胡蘿卜苷均有一定的體外活性,其IC50值分別為10.239、10.657、5.234、1.693 mg/mL,由此可知其活性強(qiáng)弱順序?yàn)楹}卜苷>反式-對(duì)羥基肉桂酸>對(duì)羥基桂皮酸甲酯>正十六烷酸>對(duì)甲氧基苯甲醛>β-谷甾醇,胡蘿卜苷對(duì)α-葡萄糖苷酶具有很強(qiáng)的抑制作用,并且強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖(IC50=4.254 mg/mL)。

圖4 化合物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率

3 討論與結(jié)論

本研究以體外α-葡萄糖苷酶抑制率為降糖活性評(píng)價(jià)方法,對(duì)裂葉蕁麻植物的根、莖、葉等不同部位進(jìn)行考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),裂葉蕁麻各部位均具有體外降糖作用,其中根對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性最強(qiáng),這一結(jié)果與前期體內(nèi)活性研究結(jié)果一致[19]。由裂葉蕁麻根不同極性部位活性測(cè)定結(jié)果可知,除石油醚相外,水相、正丁醇相及乙酸乙酯相均有一定體外降糖活性,其中乙酸乙酯相作用最強(qiáng),IC50值為8.499 mg/mL,這一結(jié)果應(yīng)該與乙酸乙酯相存在豐富的化學(xué)成分有關(guān)[38-39]。從裂葉蕁麻根的乙酸乙酯相中鑒定了6個(gè)化合物,其中對(duì)羥基桂皮肉桂酸甲酯、正十六烷酸、反式-對(duì)羥基肉桂酸、胡蘿卜苷對(duì)α-葡萄糖苷酶均有抑制作用,胡蘿卜苷和反式-對(duì)羥基肉桂酸抑制作用較強(qiáng),IC50值分別為1.693、5.234 mg/mL,接近或超過(guò)陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖的抑制作用(IC50=4.254 mg/mL),由此推測(cè)這些化合物是裂葉蕁麻根發(fā)揮體外降糖活性的物質(zhì)基礎(chǔ)之一,但由于本研究中各化合物的收率較低,并未開(kāi)展動(dòng)物體內(nèi)活性的驗(yàn)證以及作用機(jī)制的探討,這些內(nèi)容有待于進(jìn)一步研究。