環(huán)狀RNA Amotl-1在先兆早產(chǎn)患者中的表達及與陰道黏膜免疫微環(huán)境的相關性研究

徐暉，賀藝，張幼林

(湖北科技學院附屬第一醫(yī)院 咸寧市中心醫(yī)院產(chǎn)科，湖北 咸寧 437000)

近年來，隨著我國二胎政策的全面開放，先兆早產(chǎn)發(fā)生率呈上升趨勢，影響母嬰健康[1]。世界衛(wèi)生組織將妊娠周數(shù)<37周分娩作為早產(chǎn)的診斷標準，我國的早產(chǎn)定義為妊娠滿28周至不足37周分娩者，且先兆早產(chǎn)的確診條件為：①妊娠在28～37周；②胎膜完整；③宮口開大3 cm以內；④子宮收縮持續(xù)時間不超過30 s、間隙為10 min以上者。先兆早產(chǎn)病因復雜，與胎膜早破、絨毛膜羊膜炎、下生殖道及泌尿系感染、妊娠合并癥和并發(fā)癥、子宮畸形等有關[2-3]。環(huán)狀RNA是一種特殊的非編碼RNA分子，與傳統(tǒng)線性RNA不同，環(huán)狀RNA分子呈封閉環(huán)狀結構，且不受RNA外切酶的影響，表達相對穩(wěn)定，富含多個功能結合位點，能解除微RNA(microRNA，miRNA)對其靶基因的作用，亦可與疾病miRNA相互作用，發(fā)揮調控作用[4-5]。先兆早產(chǎn)的原因較多，多數(shù)由于陰道菌群失衡導致生殖道上行感染引起，但是具體機制尚未闡明[6-7]。本研究旨在探討環(huán)狀RNA Amotl-1在先兆早產(chǎn)患者中的表達及與陰道黏膜組織免疫微環(huán)境的相關性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年8月至2018年10月在咸寧市中心醫(yī)院就診的82例先兆早產(chǎn)患者作為觀察組，年齡22～36歲，平均(30±4)歲；孕周28～37周，平均(29.6±1.2)周，其中初產(chǎn)婦48例，經(jīng)產(chǎn)婦34例。選擇同期71例門診正常孕檢妊娠女性作為對照組，年齡21～37歲，平均(30±4)歲；孕周28～37周，平均(31±1.3)周；其中初產(chǎn)婦46例，經(jīng)產(chǎn)婦25例。兩組受試者年齡、孕周比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2觀察組納入與排除標準 納入標準：①根據(jù)《婦產(chǎn)科學(第5版)》[8]先兆早產(chǎn)診斷標準，經(jīng)腹部超聲、生化指標檢查確診；②孕周<37周，停經(jīng)后伴少量陰道出血，有腰痛、下腹墜痛癥狀；③意識清楚，可正常交流者。排除標準：①合并胎盤早剝、胎兒宮內發(fā)育緩慢、宮內感染者；②既往有出血史、精神異常、甲狀腺功能異常者；③給予其他藥物治療或影響本研究檢測結果者。

1.3儀器與設備 本研究使用的儀器和設備為石蠟切片機[徠卡顯微系統(tǒng)(上海有限公司，型號：RM2245)]、電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫(yī)療儀器廠，型號：101-2)、生物安全柜(濟南鑫貝西生物技術有限公司，型號：BSC11A1802105)、BCA蛋白定量試劑盒(中國碧云天生物技術研究所，批號：20170463)、7500聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)基因擴增儀(美國ABI公司，型號：7500型)、β-actin抗體(美國Santa Cruz公司，批號：20185142)、紫外分光光度儀(日本Olympus公司)、電泳儀BIO/RAD-3000(深圳市宇德立生物科技有限公司)、高度冷凍離心機(日本久保田，型號：5910型)。

1.4方法

1.4.1標本采集 通過刮片獲取陰道黏膜上皮細胞，并進行常規(guī)培養(yǎng)，備用；測定環(huán)狀RNA Amotl-1表達水平。①RNA提純。依次將500 μL Trizol和經(jīng)細胞破碎機獲得的均勻溶漿加入細胞標本中，隨后在1.0 mL離心管中振蕩后，常溫靜置5 min；再向離心管中加入氯仿200 μL，連續(xù)進行15 s劇烈振蕩，靜置5 min后以離心力1 216×g離心15 min；取1.5 mL上清液置于離心管中，并加入兩倍體積異丙醇，24 h后在離心力1 216×g，室溫4 ℃條件下離心10 min，去除上層清液，加入75%乙醇1 mL預冷，離心5 min，離心力3 258×g；離心后去除上清液及多余乙醇，常溫干燥7 min，利用紫外分光度儀檢測RNA濃度并完成RNA提純(以Rnase作為空白對照)，在A260下測定吸光度值；采用Dnase酶處理RNA，隨后放入冰箱[9-10]。②檢測方法。采用實時熒光PCR檢測不同陰道黏膜上皮細胞中環(huán)狀RNA Amotl-1表達水平。引物設計：β-actin FOR 5′GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG 3′,RE 5′ATGCCACAGGATTCCATACC 3′；環(huán)狀RNA Amotl-1 FOR 5′CAGGATGCAGCAGGTGGAAGC 3′,RE 5′TGCTCCAGGCTGTAGTCTGTGG 3′。實時熒光PCR反應條件為：30 ℃下連續(xù)進行10 min；42 ℃下進行30 min；99 ℃下進行5 min；5 ℃下進行5 min，共完成35個循環(huán)，72 ℃下完成10 min延長，將所獲得的擴增產(chǎn)物放入1.5%瓊脂凝膠中電泳，隨后采用UVP凝膠圖像測定灰度值，β-actin作為內對照。

1.4.2陰道黏膜免疫微環(huán)境測定 測定陰道黏膜pH值以及陰道人防御素5(human defensin 5，HD-5)、免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)、分泌型IgA(secretory IgA，sIgA)表達水平。充分暴露陰道后，取后穹隆陰道分泌物，采用pH試劑測定pH值；使用0.9%氯化鈉注射液沖洗內1/3陰道壁，灌洗液常規(guī)離心后采用酶聯(lián)免疫吸附法測定陰道HD5、IgE、sIgA、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)及白細胞介素(interleukin，IL)-10水平。

1.5觀察指標 比較兩組患者的環(huán)狀RNA Amotl-1表達水平及陰道黏膜免疫微環(huán)境水平(pH值、陰道HD5、IgE、sIgA、IFN-γ、IL-10)，分析先兆早產(chǎn)患者環(huán)狀RNA Amotl-1水平與陰道黏膜免疫微環(huán)境的相關性。

2 結 果

2.1兩組環(huán)狀RNA Amotl-1表達水平比較 觀察組環(huán)狀RNA Amotl-1表達水平高于對照組(0.86±0.16比0.07±0.01)(t=5.315，P<0.001)，見圖1。

PCR：聚合酶鏈反應；a：先兆早產(chǎn)實時熒光PCR圖片；b：正常妊娠實時熒光PCR圖片

圖1 兩組實時熒光PCR圖(×300)

2.2兩組陰道黏膜免疫微環(huán)境水平比較 觀察組陰道pH值以及陰道HD5、IgE、sIgA水平均高于對照組(P<0.01)，IFN-γ及IL-10水平低于對照組(P<0.01)，見表1。

2.3先兆早產(chǎn)患者環(huán)狀RNA Amotl-1水平與陰道黏膜免疫微環(huán)境的相關性分析 Pearson相關性分析結果顯示，先兆早產(chǎn)患者環(huán)狀RNA Amotl-1水平與陰道黏膜免疫微環(huán)境中的陰道pH值以及陰道HD5、IgE、SIgA水平呈正相關(r=0.563，P=0.002；r=0.612，P=0.019；r=0.668，P=0.035；r=0.598，P=0.043)，與IFN-γ及IL-10水平呈負相關(r=-0.643，P=0.039；r=-0.611，P=0.043)。

組別例數(shù)pH值陰道HD5(ng/L)IgE(μg/L)sIgA(mg/L)IFN-γ(μg/L)IL-10(μg/L)對照組713.06±0.368.74±1.09164.34±19.4637.26±0.958.32±1.122.16±0.69觀察組824.13±0.6912.48±3.51334.69±23.6353.12±1.324.59±0.691.64±0.45t值6.3925.3189.3855.4257.2214.539P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

HD5：人防御素5；IgE：免疫球蛋白E；sIgA：分泌型免疫球蛋白A；IFN-γ：γ干擾素；IL-10：白細胞介素-10；對照組：正常孕檢妊娠婦女；觀察組：先兆流產(chǎn)患者

3 討 論

目前，先兆早產(chǎn)的臨床診斷主要根據(jù)患者病史和臨床表現(xiàn)，存在明顯的局限性。研究表明，RNA是DNA與編碼蛋白之間的信使，亦是經(jīng)典RNA測序方法中的特征性分析，能準確反映胎兒的生長情況，為臨床診療提供更豐富的信息。采用實時熒光PCR技術測定環(huán)狀RNA Amotl-1水平的研究表明，先兆早產(chǎn)患者環(huán)狀RNA Amotl-1表達水平較健康孕檢孕婦高[9-10]，本研究結果與其一致。環(huán)狀RNA Amotl-1是一類特殊的非編碼RNA，除具有RNA的特性外，還可以競爭方式進行自我調控，維持基因水平的穩(wěn)定[11-12]。研究表明，環(huán)狀RNA Amotl-1是環(huán)狀RNA的重要組成部分，能通過堿基互補配對等方式直接調控環(huán)狀RNA Amotl-1轉錄，亦可與miRNA相互作用促進環(huán)狀RNA Amotl-1降解，能直接參與先兆流產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展[13-14]。另有研究發(fā)現(xiàn)，先兆早產(chǎn)患者的環(huán)狀RNA Amotl-1主要定位于細胞質，其表達水平較高，并可與miR-7相互結合，發(fā)揮協(xié)同作用，提高miRNA的表達水平[15-16]。

先兆早產(chǎn)與陰道微環(huán)境的聯(lián)系緊密。下生殖道病原微生物上行感染是引起先兆早產(chǎn)的主要原因[17]。陰道pH值在生殖道感染診斷中具有較高的敏感性，正常妊娠期女性陰道pH值較正常非孕女性陰道pH值(3.8～4.2)下降，但先兆早產(chǎn)患者陰道pH值反而升高，可能與機體激素水平異常有關。陰道唾液酶能產(chǎn)生毒性因子，可提高細菌黏著力，引起黏蛋白破壞，促進細菌穿過宮頸黏液，導致先兆早產(chǎn)的發(fā)生率升高[18]。陰道黏膜中大量的sIgA是陰道重要的免疫球蛋白，能發(fā)揮良好的免疫防御作用；HD5是陰道上皮的先天免疫因子，在先兆早產(chǎn)患者中呈高表達，能直接殺死病原微生物。IFN-γ是水溶性二聚體細胞因子，主要由活化的T細胞及自然殺傷細胞產(chǎn)生，能發(fā)揮抗病毒、免疫調節(jié)作用；IL-10能直接參與機體細胞的生長、分化，亦可參與機體炎癥與免疫反應，其表達水平與消化、血液等疾病有關。本研究中，觀察組陰道pH值以及陰道HD5、IgE、sIgA水平均高于對照組，IFN-γ及IL-10水平低于對照組(P<0.01)，表明先兆早產(chǎn)患者伴有陰道黏膜免疫功能紊亂，并與先兆早產(chǎn)相關。先兆早產(chǎn)的發(fā)生發(fā)展與陰道免疫環(huán)境有關，易受到多種因素的影響，但目前對環(huán)狀RNA Amotl-1水平與陰道黏膜免疫微環(huán)境關系的研究較少。本研究中，先兆早產(chǎn)患者環(huán)狀RNA Amotl-1水平與陰道黏膜免疫微環(huán)境陰道pH值以及陰道HD5、IgE、sIgA水平呈正相關，與IFN-γ和IL-10水平呈負相關，說明環(huán)狀RNA Amotl-1與先兆早產(chǎn)患者陰道黏膜免疫微環(huán)境存在明顯相關性。研究表明，陰道黏膜免疫微環(huán)境能直接參與先兆流產(chǎn)的發(fā)生，而環(huán)狀RNA Amotl-1水平也可影響陰道黏膜免疫微環(huán)境，導致惡性循環(huán)形成，加劇疾病的發(fā)生、發(fā)展[19]。因此，臨床對于疑似先兆早產(chǎn)患者應加強環(huán)狀RNA Amotl-1及陰道黏膜免疫微環(huán)境相關指標的檢測，以早期確診，為臨床診療提供依據(jù)和參考。對于已經(jīng)確診的先兆早產(chǎn)患者，應加強患者藥物指導、干預，避免延誤最佳診療時機[20-21]。

綜上所述，先兆早產(chǎn)患者中環(huán)狀RNA Amotl-1與陰道黏膜免疫微環(huán)境相關，臨床應加強相關指標檢測，為早期臨床診療提供幫助。