超聲波輔助提取刺梨籽黃酮工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性研究

李美東，羅 凱，黃秀芳

(湖北民族大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000)

刺梨(Rosaroxbunghii)屬于薔薇科的植物，在中國具有十分廣泛的分布，一直以來作為一種野生水果而受人們的喜愛，擁有維生素C之王的美譽(yù)，近年來由于其有極好的藥用價(jià)值和食用保健價(jià)值而被廣泛研究和開發(fā)利用[1-11].文獻(xiàn)報(bào)道刺梨中的超氧化物歧化酶(SOD)具有一定的解毒功能、鎮(zhèn)靜功能[12-14]，刺梨中的黃酮物質(zhì)具有抗氧化作用，并對動脈粥樣硬化[15-16]、糖尿病的防治[17]具有一定的效果.刺梨中的多糖具有一定的抗疲勞效果[18].將刺梨榨成刺梨汁后，汁中的活性成分有更多的功效，例如延緩衰老[19]、對急性胃黏膜的損傷[20]、降低體內(nèi)重金屬的含量[21-23]等.

目前對于刺梨的加工主要運(yùn)用其果肉，在刺梨加工過程中，刺梨籽等下腳料作為廢料而被遺棄，在生產(chǎn)過程中，如能將這些資源進(jìn)行收集并對其加以有效利用，能夠有效的提高刺梨的綜合利用并實(shí)現(xiàn)良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值.本文以野生刺梨的種子(刺梨籽)為原料，研究的重點(diǎn)為刺梨籽中黃酮的提取工藝，同時(shí)對刺梨籽黃酮的抗氧化性進(jìn)行相應(yīng)的探究，為恩施野生刺梨籽的開發(fā)與利用提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)以及相應(yīng)的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生刺梨籽：采摘于湖北省恩施市的野生刺梨.刺梨采摘后去除果肉部分，分離獲得野生刺梨的種子，置于50 ℃恒溫干燥箱中烘干、粉碎、過100目篩后保存、備用.

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(0.1 mol/L)；乙醇(v/v)；5%亞硝酸鈉；10%硝酸鋁；鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])；甲醇；硫酸鐵(500 μmol/L)；4%氫氧化鈉；0.1% FeCl3；10%三氯乙酸(TCA)；雙氧水(H2O2，500 μmol/L)；維生素C(Vc)；石油醚(30～60 ℃沸程).以上試劑均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

SY-360型超聲波提取機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；FW-100型高速粉碎機(jī)(上海楚定分析儀器有限公司)；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海洪旋實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)等.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 刺梨籽黃酮的提取工藝[24]準(zhǔn)確稱取刺梨籽粉末5.0 g放入100 mL三角瓶中，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液進(jìn)行超聲波輔助提取，過濾得黃酮粗提液，粗提液通過石油醚脫色處理并過濾，所得濾液用70%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，分光光度法510 nm處測定提取液的吸光值，按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算刺梨籽黃酮含量.

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[25]該方法采用硫酸鋁顯色法.具體流程為：取20 mg標(biāo)準(zhǔn)蘆丁樣品加入70%(v/v)乙醇溶液溶解定容至100 mL，得到0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，取6支25 mL具塞試管(編號1-6)依次精確加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)液，同時(shí)加入70%(v/v)乙醇溶液定容至10 mL，再分別加入1.5 mL 5%的亞硝酸鈉溶液后室溫放置6 min，再次分別加入2 mL 10%的硝酸鋁溶液并室溫放置15 min，分光光度計(jì)510 nm處測吸光度值.制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=2.033 4C-0.000 7(R2=0.997).

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)4個(gè)單因素來考察其對刺梨籽黃酮提取得率的影響，提取液乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%；料液比選擇1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70；超聲波處理時(shí)間選擇45、55、65、75、85、95、105 min；超聲波功率分別選擇為：152、199、247、304、351、399、446 W.

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以刺梨籽黃酮的提取得率為響應(yīng)值，以上述4個(gè)因素為因變量，設(shè)計(jì)4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案為：A：料液比(水平分別為1∶10、1∶20、1∶30)；B：超聲時(shí)間(水平分別為45、55、65 min)；C：乙醇體積分?jǐn)?shù)(水平分別為60%、70%、80%)；D：超聲功率(水平分別為351、399、446 W).

1.3.5 刺梨籽黃酮的抗氧化試驗(yàn) 刺梨籽黃酮DPPH自由基的清除率、羥自由基的清除率以及還原力檢測方法分別參考文獻(xiàn)[25-26]進(jìn)行.

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)中所有檢測分別進(jìn)行3次平行操作和檢測，所得數(shù)據(jù)取得平均值后采用origin 8.0軟件以及Excel 2007進(jìn)行處理.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 提取液(CH3CH2OH)對刺梨籽黃酮得率的影響 不同體積分?jǐn)?shù)的有機(jī)溶劑由于其極性的差異從而對有機(jī)物質(zhì)的浸提產(chǎn)生較大的影響，因此本試驗(yàn)設(shè)計(jì)運(yùn)用7種不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液來進(jìn)行刺梨籽黃酮提取最佳溶液的優(yōu)化試驗(yàn).試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示.結(jié)果表明，隨著提取液乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，刺梨籽黃酮的得率也相應(yīng)得到提高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，刺梨籽黃酮得率達(dá)到最大值，之后繼續(xù)增加乙醇的含量，刺梨籽黃酮得率反而開始下降，因此選定70%乙醇溶液作為刺梨籽黃酮提取的最佳溶劑.

2.1.2 液料比對刺梨籽黃酮得率的影響 通常在提取有機(jī)物的過程中原料與溶劑的比例也是十分關(guān)鍵的參數(shù).本試驗(yàn)探究了不同液料比對刺梨籽黃酮的得率影響規(guī)律，所得結(jié)果如圖2所示.結(jié)果表明，當(dāng)提取溶劑用量達(dá)到20∶1時(shí)，刺梨籽黃酮得率達(dá)到最大值，若持續(xù)增加溶劑的用量，刺梨籽黃酮的得率反而呈緩慢減少的趨勢.分析這種現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)椋?dāng)液料比達(dá)到20∶1時(shí)，刺梨籽中黃酮類物質(zhì)已完全溶出，再增加溶劑的用量，使得黃酮的損失率提高，因此液料比宜選用20∶1.

圖1 提取液(CH3CH2OH)對刺梨籽黃酮得率的影響 圖2 液料比對刺梨籽黃酮得率的影響

2.1.3 超聲波功率對刺梨籽黃酮得率的影響 超聲波對細(xì)胞膜的通透性有一定的影響，能導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞壁受到破壞從而有利于胞內(nèi)物質(zhì)的溶出，因此有利于植物細(xì)胞中有機(jī)物的提取.本試驗(yàn)探究了不同的超聲功率對刺梨籽黃酮得率的影響規(guī)律，結(jié)果如圖3所示.結(jié)果表明，在超聲功率小于399 W時(shí)，刺梨籽黃酮的得率隨著超聲波功率的逐漸上升而上升，在399 W處得到最大值，但在超聲功率達(dá)到399 W后，刺梨籽黃酮得率隨之下降.分析其原因可能是超聲功率較高時(shí)，溶液溫度升高導(dǎo)致黃酮類物質(zhì)穩(wěn)定性下降而部分被氧化，致使得率出現(xiàn)下降的結(jié)果.因此本試驗(yàn)中超聲功率選399 W為宜.

2.1.4 超聲波處理時(shí)間對刺梨籽黃酮得率的影響 試驗(yàn)在前述研究的基礎(chǔ)上，探索了不同超聲波處理時(shí)間對刺梨籽黃酮得率的影響研究，結(jié)果如圖4所示.結(jié)果表明，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到55 min時(shí)，刺梨籽黃酮的得率得到了最大值，進(jìn)而繼續(xù)增加超聲波對刺梨籽黃酮的處理時(shí)間，黃酮的得率逐步開始呈下降趨勢.分析其原因可能是因?yàn)楫?dāng)超聲時(shí)間達(dá)到55 min時(shí)，黃酮類物質(zhì)已基本溶出，進(jìn)一步延長產(chǎn)生時(shí)間，可能導(dǎo)致黃酮受到破壞致使得率降低，因此本試驗(yàn)超聲時(shí)間定為55 min為最佳.

圖3 超聲波功率對刺梨籽黃酮得率的影響 圖4 超聲波處理時(shí)間對刺梨籽黃酮得率的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)合刺梨籽黃酮提取單因素的試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，所得試驗(yàn)結(jié)果如表1所示.

2.2.2 響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型方差分析結(jié)果 對試驗(yàn)得出的數(shù)學(xué)模型討論其方差，并對方程的有效性、因子之間的回歸系數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，所得結(jié)果的方差分析如表2所示.二次回歸模型的P<0.000 1，說明了模型具有極高的顯著性；同時(shí)模型的失擬項(xiàng)P=0.077>0.05，說明所得出的失擬項(xiàng)差異并不顯著，可用于超聲波提取刺梨籽黃酮的預(yù)測和分析.由F檢驗(yàn)對自變量、因變量的影響判斷，得到各因素對刺梨籽黃酮的得率影響的主要次序是C>D>A>B，即得出結(jié)論為：不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對提取刺梨籽黃酮得率影響最大，其次是超聲波的功率、液料比，最后是超聲時(shí)間.同時(shí)，表2結(jié)果還顯示，在此試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，C、AB、BC等項(xiàng)極顯著(P<0.01)；A、D項(xiàng)顯著(0.01

回歸方程為：Y=81.20+3.73A+1.77B+6.46C+4.09D+AB+10.52+0.96AC+1.59AD-9.29BC+3.13BD+2.58CD-12.37A2-19.04B2-22.57C2-24.94D2.

表1 Box-Bwhneken試驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 The results of Box-Behnken design

試驗(yàn)號黃酮得率/(mg·g-1)試驗(yàn)號黃酮得率/(mg·g-1)184.721637.51242.791742.20367.471852.55429.221934.10550.502025.55640.152137.24739.602254.06849.762355.76940.712483.271079.372652.451151.152645.011220.432781.911323.122833.561432.072976.721542.55

表2 回歸模型的方差分析

Tab.2 Regression model variance analysis

方差來源平方和自由度均方F值P值顯著度模型8973.2814640.9517.66<0.0001???A-液料比166.881166.884.600.0500??B-超聲時(shí)間37.74137.741.040.3252C-乙醇濃度501.041501.0413.800.0023???D-超聲功率200.331200.335.520.0340??AB442.471442.4712.190.0036???AC3.7113.710.100.7540AD10.14110.140.280.6053BC345.591345.599.520.0081???BD39.25139.251.080.3160CD26.57126.570.730.4066A2992.921992.9227.360.0001???B22352.3812352.3864.81<0.0001???C23356.0113356.0192.47<0.0001???D24034.5614034.56111.16<0.0001???殘差508.121436.29失擬項(xiàng)467.521046.754.610.0771純誤差40.60410.15

結(jié)合所有數(shù)據(jù)分析得到對恩施野生刺梨籽黃酮的最佳的提取條件是：乙醇體積分?jǐn)?shù)為81.36%，液料比為21.94 mL/g，功率為403.54 W，超聲時(shí)間為55.76 min.在此條件下，刺梨籽黃酮的得率最高，說明模型可以較好地反映出刺梨籽黃酮提取的條件，優(yōu)化條件也較為可靠.

2.3 刺梨籽黃酮體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.3.1 刺梨籽黃酮DPPH自由基清除率試驗(yàn) 在優(yōu)化刺梨籽黃酮提取工藝的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，對刺梨籽黃酮的生理活性進(jìn)一步探索.本試驗(yàn)探究了刺梨籽黃酮提取物對DPPH自由基的效果能力，結(jié)果如圖6所示.結(jié)果表明，在試實(shí)驗(yàn)測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著Vc、BHT、刺梨籽黃酮提取液的含量增加，DPPH自由基的清除率也增加.當(dāng)刺梨籽黃酮提取液質(zhì)量濃度比較低的時(shí)候，刺梨籽黃酮提取液的羥自由基清除效果也低于對照品Vc的清除效果，當(dāng)刺梨黃酮提取液的質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí)，黃酮提取液的自由基清除效果與Vc的自由基清除效果基本相同，這也說明在作為添加劑使用時(shí)，只要使用量調(diào)整合理，刺梨籽黃酮的作用與Vc可以達(dá)到相同的效果，同時(shí)因?yàn)辄S酮與Vc的其它生理活性有較大的區(qū)別，因此在一些不適合使用Vc或者為了達(dá)到其它目的的產(chǎn)品中，添加刺梨籽黃酮是完全可行的.

2.3.2 刺梨籽黃酮還原力測定 還原力也是黃酮的主要生理活性的體現(xiàn)，本試驗(yàn)探究了刺梨籽黃酮的還原力并與Vc進(jìn)行了比較，試驗(yàn)結(jié)果如圖7所示.吸光度值的升降變化可以反映出樣品自身還原力的能力高低，體系的吸光度數(shù)值越大，其還原力越強(qiáng).在本試驗(yàn)所測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不斷增加刺梨籽黃酮的質(zhì)量濃度時(shí)，刺梨籽黃酮的還原力也不斷增強(qiáng).即使達(dá)到較高的質(zhì)量濃度，刺梨籽黃酮提取液的還原力還是低于對照品Vc的還原力.

2.3.3 刺梨籽黃酮對羥自由基清除效果檢測 黃酮類物質(zhì)對羥自由基效果的清除效果也是其重要性質(zhì)之一，本試驗(yàn)探究了刺梨籽黃酮提取物清除羥自由基效果并與Vc進(jìn)行了比較實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖8所示.結(jié)果顯示，在本試驗(yàn)所測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著刺梨籽黃酮和Vc的質(zhì)量濃度的增加，對羥自由基的清除效果也不斷增強(qiáng).而且當(dāng)刺梨籽黃酮提取液質(zhì)量濃度比較低的時(shí)候，刺梨籽黃酮提取液的羥自由基清除效果明顯低于對照品Vc的清除效果，當(dāng)刺梨籽黃酮提取液的質(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí)，其對羥自由基清除能力與Vc的羥自由基清除能力差異不顯著.

圖5 響應(yīng)面與等高線圖Fig.5 Response surface and contour map

圖6 DPPH自由基的清除效果 圖7 刺梨籽黃酮提取液的還原力Fig.6 Scavenging effect of DPPH free radicals Fig.7 Reducing power of flavonoid extract from Rosa roxbunghii seeds

圖8 羥自由基的清除效果Fig.8 Scavenging effect of hydroxyl radicals

3 結(jié)語

為了達(dá)到在刺梨發(fā)展產(chǎn)業(yè)中原料綜合利用的目的，試驗(yàn)優(yōu)化了刺梨籽中黃酮的提取工藝，并對提取的黃酮進(jìn)行了活性研究.以刺梨籽為原料，通過有機(jī)溶劑乙醇在超聲波輔助處理下提取其中的黃酮，在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得出了刺梨籽黃酮的最佳提取條件，分別為乙醇體積分?jǐn)?shù)為81.36%、液料比為21.94 mL/g、功率為403.54 W、超聲時(shí)間為55.76 min.此工藝刺梨籽黃酮得率為80.16 mg/g.

通過對體外抗氧化活性的測定，證明了刺梨籽黃酮的提取物確實(shí)具有比較好的體外抗氧化活性.在較高的質(zhì)量濃度下，刺梨籽黃酮對DPPH自由基、羥自由基清除率與傳統(tǒng)抗氧化劑Vc差異很小，但其還原性不如Vc.試驗(yàn)結(jié)果說明刺梨籽黃酮可作為抗氧化劑的新型來源.這也為促進(jìn)刺梨開發(fā)利用及其產(chǎn)業(yè)鏈的延伸提供了一定的理論和試驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐.