魔芋花粉短期儲(chǔ)藏技術(shù)及其活力特性研究

趙青華，胡永忠，楊朝柱，潘婭妮，覃 宇

(1.恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 恩施 445000； 2.湖北省魔芋種子種苗工程技術(shù)中心，湖北 恩施 445000； 3.湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心 鄂西綜合試驗(yàn)站，湖北 恩施 445000)

植物花粉攜帶其全部核基因遺傳信息，具有活力的花粉通過發(fā)芽和花粉管生長將其攜帶的基因進(jìn)行傳遞[1].自然狀態(tài)下，大多數(shù)植物花粉存活時(shí)間有限，如水稻[2]、麥類[3]、玉米[4-5]、匍匐翦股穎[6]等禾本科植物存活時(shí)間較短，從幾分鐘到幾小時(shí)，獼猴桃[7]室溫下可存活不超過40 d，丁香[8]不超過30 d，錦帶花[9]為3 d，雞爪槭[10]為15 d，石斛[11]為5 d，芒果[12]為28 d，二球懸鈴木[13]為10 d，梨[14]為60 d以內(nèi)，而茶樹和香蒲花粉也僅能存活120 d[15-16]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足植物雜交改良、基因操作和瀕危物種的拯救.從20世紀(jì)80年代開始，花粉的離體保存技術(shù)發(fā)展較快，印度、日本、美國、中國等相繼建立了植物基因花粉庫(Pollen bank)，形成了成熟的保存技術(shù)，保存了果樹、園林、花卉和蔬菜植物的花粉，部分花粉保存5～10年仍然維持較高活力[17-22].

魔芋屬天南星科多年生植物，球莖富含葡甘露聚糖而具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和商業(yè)價(jià)值，在我國西南地區(qū)種植較多.傳統(tǒng)雜交和選擇是魔芋品種改良的主要方法，多年的育種實(shí)踐表明，種內(nèi)雜交難以獲得優(yōu)勢(shì)雜種后代，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的退化，種間雜交培育超親優(yōu)勢(shì)品種極具希望[23].魔芋屬異花授粉植物，開花期因種屬和生長環(huán)境而異，集中在4～6月，通過不同溫度儲(chǔ)藏可以在一定時(shí)間內(nèi)調(diào)節(jié)花期但難以精確，且魔芋花粉在室溫下存活時(shí)間很短[24]，定向雜交仍然需要收集和短期保存單株花粉.張玉進(jìn)等[25]、李勇軍等[26]通過低溫實(shí)現(xiàn)了花魔芋花粉長達(dá)6個(gè)月以上保存，但需經(jīng)過復(fù)雜的前期處理，且隨著保存時(shí)間延長，授粉結(jié)實(shí)率出現(xiàn)明顯下降.育種實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)授粉結(jié)實(shí)率低于10%以下的單株出現(xiàn)早衰，很難獲得成熟度好的實(shí)生籽.因此，本文研究了不同品種未經(jīng)處理的新鮮花粉在不同條件下的短期保存活力變化，以期為雜交育種實(shí)踐提供技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 花粉收集

研究材料種植于湖北省恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)示范園，花芽長至20 cm左右缽栽，置于防蟲網(wǎng)室，待佛焰完全展開附屬器散發(fā)氣味物質(zhì)后，于上午8時(shí)左右用紅外熱成像儀(FLIR-E63900，T198547，SWEDEN)檢測(cè)溫度變化，當(dāng)附屬器溫度明顯的高于雄花序于下午5時(shí)以后切下雄花序以上部分，用硫酸鈉紙袋套住雄花序，置于室溫(25～30 ℃，濕度75%左右)過夜，次日上午8時(shí)左右自然散粉后及時(shí)收集.

1.2 花粉保存

取新鮮花粉，混勻，分裝于5 mL螺旋口玻璃瓶，作好標(biāo)識(shí)，密封儲(chǔ)藏于不同溫度備用，其中室溫約25～30 ℃，濕度75%左右，4 ℃和-20 ℃置于普通冰箱(BCD-602W，青島海爾)冷藏室和冷凍室，-80 ℃置于超低溫冰箱(MDF-382E(N)，SANYO電子有限公司)，-196 ℃用細(xì)線系住玻璃瓶直接浸入液氮灌中.干燥處理，每瓶中加入1袋0.5 g裝硅膠.

1.3 花粉活力檢測(cè)

花粉活力檢測(cè)用離體發(fā)芽法[27-32].利用正交設(shè)計(jì)獲得優(yōu)化培養(yǎng)基成份：0.7%(w/v)瓊脂，5%(w/v)蔗糖，200 mg/L H3BO3，400 mg/L CaCl2.熔化后取5 mL于直徑55 mm培養(yǎng)皿中蓋上蓋子室，溫冷卻.花粉解凍參照Ganeshan方法[18]：取出分裝花粉玻璃瓶，置于室溫下30 min.接種花粉：用不含瓊脂的培養(yǎng)基溶液添加0.5%甘油稀釋有機(jī)硅(烷氧基改性聚三硅氧烷)(華諾生物科技有限公司，山東濰坊)至2 000倍，取20 μL于載玻片上，用鑷子挑取少量于室花粉攪拌均勻，迅速用濕潤的濾紙條吸附花粉，涂布于冷卻的培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)皿置于人工氣候箱(BIC-800，博訊)30 ℃、濕度95%培養(yǎng)3 h.鏡檢：直接將培養(yǎng)皿放在顯微鏡(EX20，浙江舜宇光學(xué))4倍物鏡拍照(G12，佳能)，隨機(jī)拍5個(gè)視野，每視野花粉數(shù)量要求超過100個(gè)，3次平行.

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

花粉顆粒及發(fā)芽計(jì)數(shù)用Image-Pro Plus6.0軟件，以花粉管伸長至花粉顆粒直徑2倍以上為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算發(fā)芽率.圖像處理用Adobe Photoshop CS6軟件，數(shù)據(jù)分析和作圖用SigmaPlot12.5軟件.

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋花粉收集時(shí)期

魔芋花屬佛焰花序，在其肉穗花序底端和頂端分別有佛焰苞和附屬器特殊結(jié)構(gòu).佛焰苞具有保持雌花序周圍濕度，造成暗環(huán)境有利于花粉萌發(fā).附屬器具有發(fā)熱和散發(fā)氣味物質(zhì)的特性，有利于降低花序溫度和吸引昆蟲授粉.當(dāng)花粉顆粒成熟后，從雄蕊的頂端的裂孔中吐出.從植株上收集花粉難以控制環(huán)境的溫度和濕度，無法保證花粉活力且損失多.通過紅外圖像，發(fā)現(xiàn)魔芋吐粉前24 h左右，附屬器的溫度明顯的高于環(huán)境和其他部位，如圖1所示.此后12 h以內(nèi)切取雄花序以上部分置于室內(nèi)，次日上午8時(shí)左右及時(shí)收集有利于保證花粉的初始活力.

A：白魔芋 B：西盟魔芋 C：花魔芋×白魔芋圖1 魔芋花粉收集前24 h紅外圖像Fig.1 Infrared image of the genus Amorphophallus flowers at 24 h before pollen collected

表1 正交設(shè)計(jì)篩選魔芋花粉萌發(fā)培養(yǎng)基Tab.1 Germination medium (GM) suitable for Amorphophallus spp.(A.konjac × A.albus) pollen

注：試驗(yàn)材料為花魔芋與白魔芋雜交后代花粉.

2.2 花粉離體萌發(fā)條件

2.2.1 培養(yǎng)基篩選 以花魔芋和白魔芋雜交后代花粉為材料，通過正交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)蔗糖、硼酸及氯化鈣極差分別為11.5%、2.9%、6.0%，如表1所示.表明對(duì)魔芋花粉發(fā)芽影響蔗糖>氯化鈣>硼酸.蔗糖含量過高不利于花粉的萌芽，這可能與增加細(xì)胞內(nèi)滲透壓和加速發(fā)酵積累了較高含量的酒精有關(guān)，二者對(duì)花粉的萌發(fā)有抑制作用[33].比較理想的魔芋花粉培養(yǎng)基為：5%(w/v)蔗糖，200 mg/L硼酸，400 mg/L氯化鈣.

2.2.2 甘油和有機(jī)硅對(duì)花粉萌發(fā)的影響 在預(yù)備試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)超過4 h后，培養(yǎng)基容易干裂，花粉管出現(xiàn)萎縮，同時(shí)花粉顆粒間相互作用導(dǎo)致在培養(yǎng)基表面成團(tuán)，嚴(yán)重影響后期計(jì)數(shù).甘油和有機(jī)硅(烷氧基改性聚三硅氧烷)具有良好的保濕和分散作用，常用作保濕劑和農(nóng)藥助劑.在分散液中添加0.5%的甘油，可提高花粉的發(fā)芽率，如圖2所示，同時(shí)避免花粉管干縮.高含量的有機(jī)硅增加了花粉細(xì)胞滲透壓，導(dǎo)致花粉顆粒破裂，影響發(fā)芽率，含量過低，分散效果不好，稀釋2 000倍的有機(jī)硅分散效果好，發(fā)芽率比未加提高4個(gè)百分點(diǎn)，如圖3所示.

2.2.3 離體培養(yǎng)時(shí)間 魔芋花粉發(fā)芽率與培養(yǎng)時(shí)間呈指數(shù)關(guān)系，如圖4所示.在1～2 h之間，上升較快，3 h以后，增加緩慢.培養(yǎng)時(shí)間超過3 h，花粉管長度可達(dá)2 000 um以上，花粉管相互交錯(cuò)，卷曲，增加了后期計(jì)數(shù)難度，因此，以培養(yǎng)3 h為計(jì)算發(fā)芽率，有利于精確統(tǒng)計(jì)和節(jié)省時(shí)間.培養(yǎng)3 h后，花魔芋、白魔芋以及西盟魔芋的發(fā)芽率最高的分別為82%、92%和79%.西盟魔芋花粉在不同溫度(室溫、4 ℃、-20 ℃和-80 ℃)條件下儲(chǔ)藏2 h，發(fā)芽曲線明顯不同，室溫和冷藏較快的達(dá)到最高值，而-20 ℃和-80 ℃表現(xiàn)出明顯的“滯后”現(xiàn)象，如圖5所示.

2.3 不同儲(chǔ)藏條件下魔芋花粉活力

2.3.1 硅膠干燥對(duì)花粉活力影響 花粉儲(chǔ)藏添加干燥劑對(duì)魔芋花粉的萌發(fā)產(chǎn)生極為明顯的影響，如表2所示.

圖2 甘油含量對(duì)發(fā)芽的影響 圖3 有機(jī)硅含量對(duì)發(fā)芽影響

A.albus:白魔芋；A.konjac：花魔芋；A.krausei：西盟魔芋圖4 魔芋花粉離體培養(yǎng)發(fā)芽曲線 圖5 不同溫度儲(chǔ)藏2 h對(duì)發(fā)芽的影響

表2 硅膠干燥保存對(duì)魔芋花粉活力影響Tab.2 Effects on viability of the genus Amorphophallus pollen preserved under different temperature by silica gel drying

注：dry表示保存瓶中加入0.5 g袋裝硅膠干燥劑；A.krausei-4，A.krausei-7，A.spp.(A.konjac×A.albus)-10表示西盟魔芋4號(hào)、7號(hào)單株和花魔芋與白魔芋雜交后代10號(hào)單株；小寫字母表示1%差異顯著性.

除-20 ℃以外，添加干燥劑的花粉活力極速下降，保存2 d內(nèi)活力顯著的低于對(duì)照，4 ℃條件下基本上失活，這可能與花粉水分含量有關(guān)，加入硅膠導(dǎo)致花粉顆粒過度脫水所致[26].

2.3.2 儲(chǔ)存溫度和時(shí)間對(duì)魔芋花粉活力影響 對(duì)不同溫度條件下儲(chǔ)藏1～35 d的西盟魔芋不同單株花粉定期進(jìn)行活力動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)，直線回歸表明，儲(chǔ)藏溫度越低，花粉活力下降越慢.4 ℃和-20 ℃保存，分別經(jīng)過7 d和14 d其花粉活力降至1%左右；-80 ℃保存，經(jīng)過35 d后花粉活力下降53%；而液氮(-196 ℃)保存未經(jīng)任何處理的新鮮花粉，前1～4 d呈“V”，后期逐漸上升，出現(xiàn)“冷適應(yīng)”現(xiàn)象，保存30 d后，花粉活力僅下降14.6%(圖6).室溫下魔芋花粉經(jīng)過6h其發(fā)芽率下降60%，10 h后發(fā)芽率接近0，如圖7所示.

圖6 不同溫度儲(chǔ)藏下魔芋花粉活力變化(西盟魔芋)圖7 室溫(25～30 ℃)儲(chǔ)藏魔芋花粉活力變化(西盟魔芋)

魔芋不同種屬(species)、種內(nèi)不同個(gè)體開花期有異，同株雌雄花成熟不一致，散粉后雌花柱頭完全失活，自花不實(shí).在品種定向雜交育種實(shí)踐中，需要配制大量的組合以保證能夠選出優(yōu)良的后代，從4至6月，必須每天確保有充足數(shù)量有活力的花粉.因此，保存花粉并在授粉前對(duì)花粉活力檢測(cè)極為重要.從臨時(shí)(1～4 d)保存效果來看，4 ℃優(yōu)于-20 ℃，如圖8所示.可能是-20 ℃條件下形成了微小的冰針破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其活力迅速下降.短期(1個(gè)月左右)以液氮凍存較好，如圖9、圖10所示.育種實(shí)踐中，魔芋單株花粉數(shù)量少且不同單株基因型不一致，因此要保證花粉足夠的活力提高結(jié)實(shí)率，以增加獲得有益性狀幾率，對(duì)不同基因型的91個(gè)單株保存于不同溫度下34 d左右的花粉進(jìn)行活力檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)4 ℃、-20 ℃、-80 ℃、-196 ℃平均發(fā)芽率分別為0.6%、2.5%、11.1%、34.1%；發(fā)芽率超過5%以上的比例分別為3.3%、14.8%、53.3%和100%，如表3所示.由此可見，-196 ℃和-80 ℃儲(chǔ)存1個(gè)月左右時(shí)間效果較好.

(A：-80 ℃；B：-196 ℃，存儲(chǔ)21 d；PG：花粉粒，PT：花粉管)圖10 -80 ℃和-196 ℃保存21 d西盟魔芋花粉發(fā)芽狀況Fig.10 Germination of Amorphophallus krausei pollen preserved at -80 ℃ and -196 ℃ for 21 d

表3 91份不同溫度儲(chǔ)藏34 d左右的魔芋花粉活力情況Tab.3 Viability of 91 the genus Amorphophallus pollen preserved under different temperature for about 34 d

注：小寫字母表示1%差異顯著性.

3 結(jié)論與討論

延長花粉的壽命對(duì)于其生物學(xué)研究、植物遺傳多樣性的保護(hù)、雜交育種以及瀕危物種的保護(hù)具有重要應(yīng)用價(jià)值.花粉的保存可分為室溫保存(25～30 ℃)、冷藏(4 ℃)、凍存(-20 ℃)、深度凍存(-80 ℃)和液氮(-196 ℃)超低溫保存，其中超低溫保存可有效的阻止細(xì)胞的代謝和有害物質(zhì)積累，保持遺傳穩(wěn)定性，是植物花粉長期保存最有效、最經(jīng)濟(jì)的方法[1，22，34].但是，超低溫保存受條件限制，普通的育種單位難以實(shí)現(xiàn).

魔芋是我國西南山區(qū)重要的特色經(jīng)濟(jì)作物，育種研究起步晚，早期改良以選擇自然變異或優(yōu)良的地方居群為主，農(nóng)藝性狀很難得到大的提高，雜交育種潛力巨大[23，35-36].魔芋由于雌雄花成熟不一致生理原因?qū)е码y以獲得遺傳上的純系品種，進(jìn)一步影響了雜交優(yōu)勢(shì)利用，種內(nèi)個(gè)體以及種間雜交花期不遇和地理隔離影響雜交育種.在以往的育種中對(duì)花粉進(jìn)行常規(guī)儲(chǔ)存(4 ℃和-20 ℃)，授粉前需要進(jìn)行大量的發(fā)芽試驗(yàn)才能篩選出少量活性好的花粉，部分優(yōu)異的材料花粉失去了活力，關(guān)鍵在于缺乏對(duì)魔芋花粉儲(chǔ)存條件及活力變化的了解.建立魔芋花短期保存技術(shù)體系，對(duì)于大規(guī)模雜交育種至關(guān)重要.

魔芋花粉活力受保存溫度影響大，保存溫度越低，發(fā)芽率下降速度越慢.室溫下花粉活力在10 h以內(nèi)，與前人研究結(jié)果一致[24-26].室溫下離體收集的新鮮花粉，在4 ℃條件下保存4 d，活力變化不大，可用于雜交臨時(shí)花期調(diào)節(jié).新鮮花粉直接浸入-196 ℃液氮保存，早期下降較快，后期有“冷適應(yīng)”現(xiàn)象，保存1個(gè)月左右花粉仍有很高的活力，可作為短期保存，尤其是一些珍貴的材料宜采用此法.-20 ℃保存花粉效果不佳，可能與水份含量有關(guān)，較高的水分導(dǎo)致了冰針形成破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)[22].硅膠干燥處理效果不佳，與張盛林等[24]研究結(jié)果類似，與李勇軍等[26]在魔芋花粉保存及張銘芳等[37]在百合花粉保存方面研究結(jié)果有差異，可能與花粉過度脫水有關(guān)[20,26].花粉離體發(fā)芽過程中添加0.5%的甘油和稀釋2 000倍的有機(jī)硅有助于防止花粉管干縮和花粉顆粒在培養(yǎng)基上均勻分布，便于后期準(zhǔn)確計(jì)數(shù).

魔芋屬植物全球超過160種，我國分布有21種以上[38].不同基因型植物花粉保存方法有差異[14-15].對(duì)于水份含量高、粘度大的疣柄魔芋、甜魔芋、彌勒魔芋、謝君魔芋等花粉的保存仍舊不成熟，因此，針對(duì)不同的魔芋種(Species)，建立適宜的長期保存方法，是下一步研究的重點(diǎn).