藍(lán)藻不同類型膠被提取方法*

劉泠昕，肖 艷 ，李 哲，吳興華，張 宇

(1：中國(guó)科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院，中國(guó)科學(xué)院水庫(kù)水環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400714) (2：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049) (3：中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)有限公司，北京 100038)

膠被(surface coat)是一種廣泛存在于微生物以及一些植物和動(dòng)物細(xì)胞周圍的結(jié)構(gòu). 由于其主要成分為多糖和蛋白質(zhì)，早期的學(xué)者提出一個(gè)廣義的術(shù)語(yǔ)“ glycocalyx ”來描述這種功能性結(jié)構(gòu)[1]. 在過去的幾十年里，微生物和植物的膠被得到了越來越多的關(guān)注，但其術(shù)語(yǔ)經(jīng)?；煜貏e是藻類的膠被，在許多文獻(xiàn)中其名稱并沒有嚴(yán)格區(qū)分. 在已有的研究報(bào)道中，藻類的膠被稱為capsular polysaccharides(CPS)、bound extracellular polymers(BEPS)、tight extracellular polymers(TEPS)、transparent exopolymer particles(TEP)、bound extracellular organic matter(bEOM)、polysaccharide(PS)等[2-4]，BEPS還可進(jìn)一步分為loosely bound extracellular polymers(LB-EPS)和tightly bound extracellular polymers(TB-EPS)[5]. 除此之外，大部分藻類膠被可以分泌溶解性多糖物質(zhì)到外界環(huán)境中，一般稱之為released polysaccharides(RPS)或soluble extracellular polymers(SEPS)，因此有學(xué)者用胞外多糖(exopolysaccharide、extracellular polymeric substance、EPS)代表膠被及其分泌物，在物質(zhì)層面上對(duì)其進(jìn)行分析[6-7]. 但這忽略了藻類膠被自身的生物學(xué)功能，且膠被可能比RPS具有更多的生物活性[8].

已有的研究表明，膠被的形成和保留可作為藻類與其周圍環(huán)境之間的物理屏障，同時(shí)也為細(xì)胞周圍提供了必要營(yíng)養(yǎng)素和微量元素的微環(huán)境[5,9]. 尤其是藍(lán)藻和綠藻的膠被，被認(rèn)為對(duì)紫外線輻射、氧化、有毒化合物、干燥和原生動(dòng)物的捕食等不利環(huán)境因素具有防御作用[10-12]. 此外，這些外層對(duì)于藍(lán)藻和綠藻維持其群體形態(tài)至關(guān)重要，并參與細(xì)胞間相互作用、粘附和聚集等一系列過程，從而進(jìn)一步影響藍(lán)藻和綠藻水華的形成[13-14]. 然而，許多學(xué)者對(duì)藻類膠被并沒有系統(tǒng)深入地區(qū)別劃分，導(dǎo)致這些外層之間的結(jié)構(gòu)和功能研究仍然是零散和片面的.

研究者普遍認(rèn)為，藻類膠被根據(jù)形態(tài)可分為鞘(sheath)、莢膜(capsule)、粘液(slime)[15]. 鞘層薄而均勻，在光學(xué)顯微鏡下觀察可見；莢膜是厚而有粘性的多糖層，用印度墨水染色后光學(xué)顯微鏡下觀察可見；粘液是最外一層，分散在細(xì)胞周圍，不能反映細(xì)胞的形狀[15]. 而目前有關(guān)藻類不同類型膠被的研究相對(duì)較少，且針對(duì)不同類型的膠被如何在保證細(xì)胞完整狀態(tài)下被完全提取的方法仍不清晰. 歸納近10年研究中關(guān)于藻類膠被的提取方法(表1)，目前最常用的方法有離心法、熱水提取法、氫氧化鈉水浴法等. 然而不同藻種的膠被提取方法不一，即使是同一藻種，如銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)，不同的文獻(xiàn)所提及的方法以及采用的提取時(shí)間、提取劑濃度、溫度也均有不同[5,16-19]，且大部分文獻(xiàn)中并未對(duì)特定的藻種膠被形態(tài)進(jìn)行描述. 現(xiàn)有文獻(xiàn)提取膠被采用溫度范圍廣，研究表明高溫會(huì)促進(jìn)多糖的溶解[20]，最高達(dá)到100℃；提取時(shí)間范圍為10 min到24 h，F(xiàn)r?lund等發(fā)現(xiàn)0.5～1 h提取膠被對(duì)導(dǎo)致細(xì)胞裂解的風(fēng)險(xiǎn)最小[21]，F(xiàn)ang等也發(fā)現(xiàn)膠被提取完成時(shí)間少于1 h最佳[22].

藻類膠被提取方法的不完善，以及在保證細(xì)胞完整的條件下針對(duì)不同類型膠被的提取方法缺失，很大程度上阻礙了對(duì)藻類膠被生物學(xué)功能的深入探索. 此外，不同藻種膠被形態(tài)、性質(zhì)不同，其提取方法也不盡相同，膠被提取效果不完全也為后續(xù)分析帶來一定誤差，因此首先尋找適宜的膠被提取方法十分重要. 基于此背景，本研究選取水華優(yōu)勢(shì)種魚腥藻Anabaenasp.和念珠藻Nostocsp.為研究對(duì)象，探討其膠被類型以及相對(duì)應(yīng)的最優(yōu)提取方法，為后續(xù)進(jìn)一步揭示不同類型膠被的功能作用提供技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 藻種及藻種培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)選用的魚腥藻FACHB-82Anabaenasp.(具副異形胞，藻絲所有細(xì)胞形態(tài)相同)和念珠藻FACHB-599Nostocsp.(具離異形胞，藻體單生，成熟后為球形)，由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)(FACHB-Collection)提供，藻種常規(guī)培養(yǎng)以BG-11為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25±1℃，光照強(qiáng)度為25 μmol photons/(m2·s)，光周期為12 h∶12 h，每天手動(dòng)搖勻3次.

1.2 藻種膠被形態(tài)觀察

在倒置熒光顯微鏡(OLYMPUS IX73)明場(chǎng)下觀察藻類膠被的鞘結(jié)構(gòu)，通過印度墨水(PH1714, phygene)

表1 近10年有關(guān)藻類膠被提取方法歸納

染色觀察藻細(xì)胞膠被的莢膜和粘液，分別對(duì)藻種進(jìn)行膠被形態(tài)的分類.

本研究所選藻種魚腥藻呈群體形態(tài)，許多藻絲聚集在一起(圖1a)，但群體和單根藻絲外沒有鞘層(圖1b)；印度墨水染色發(fā)現(xiàn)魚腥藻群體中存在大量莢膜和粘液，包裹在藻絲周圍(圖1c). 念珠藻群體中許多藻絲聚集在一起，在未染色情況下觀察到群體外存在較厚的鞘層結(jié)構(gòu)(圖1d)；印度墨水染色下，念珠藻群體鞘外未存在其他形態(tài)的膠被(圖1e).

圖1 魚腥藻和念珠藻的膠被形態(tài)：(a～c)FACHB-82魚腥藻;(d～e)FACHB-599念珠藻 (a、b：未染色；c:印度墨水染色，莢膜(白箭頭)，粘液(紅箭頭)；d：未染色，鞘(黑箭頭)；e：印度墨水染色)Fig.1 Surface coat of Anabaena and Nostoc: (a-c) FACHB-82 Anabaena sp.; (d-e) FACHB-599 Nostoc sp. (a, b: unstained; c: stained with India ink, capsule (white arrow), slime (red arrow); d: unstained, sheath (black arrow); e: stained with India ink)

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期藻液30 mL，用0.22 μm醋酸纖維濾膜過濾，濾液即為RPS，后用透析袋(1000-Da)在去離子水中純化RPS. 將濾膜表面的藻樣重懸于30 mL的NaCl溶液(0.05%，維持藻細(xì)胞滲透壓)中，以10000g，4℃下離心10 min，收集上清液即為粘液，后用0.22 μm醋酸纖維濾膜過濾.

根據(jù)表1中歸納的膠被提取方法的普適范圍，設(shè)置一系列溫度、時(shí)間、提取劑濃度梯度，將離心沉淀和濾膜表面的藻細(xì)胞處理如下：①用NaCl溶液(0.05%)重懸浮到30 mL，進(jìn)行雙因素實(shí)驗(yàn)處理(表2)；②用H2SO4、NaOH提取劑重懸浮到30 mL，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)處理(表3)，每10 min震蕩1次. 由于念珠藻鞘層較堅(jiān)硬，因此在正交實(shí)驗(yàn)中溫度設(shè)計(jì)較高.

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1)硫酸水浴法提取劑：H2SO4；氫氧化鈉水浴法提取劑：NaOH.

上述處理后的樣品在4℃下以5000g離心10 min，收集上清液即為莢膜/鞘. 將離心沉淀的藻細(xì)胞重懸于NaCl(0.05%)中，通過印度墨水染色觀察藻細(xì)胞膠被是否提取完全. 對(duì)于膠被均能完全提取的處理組，于熒光顯微鏡(OLYMPUS IX73)G模式下觀察藻細(xì)胞自發(fā)熒光，激發(fā)波長(zhǎng)為530～550 nm，測(cè)定藻細(xì)胞數(shù)，確定膠被最優(yōu)提取方法.

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.4.1 生物量及細(xì)胞數(shù)的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期藻液30 mL用于測(cè)定生物量及細(xì)胞密度. 生物量以藻細(xì)胞干重(DW)表示，將藻液用GF/F濾膜(Whatman，UK)抽濾，濾膜提前烘干至恒重并記錄重量W0(g)，后將濾有藻樣的濾膜置于60℃，24 h烘干至恒重，記錄重量Wt(g). 生物量X=1000 × (Wt-W0)/V，其中，V為藻液體積(mL).

采用血球計(jì)數(shù)板在熒光顯微鏡(OLYMPUS IX73)明場(chǎng)下對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(上下計(jì)數(shù)板總細(xì)胞數(shù)誤差<5%)，對(duì)照組藻細(xì)胞數(shù)為Y1，提取膠被后藻細(xì)胞數(shù)為Y2.

1.4.2 單糖組成分析 將獲得的RPS、粘液、莢膜/鞘樣品溶液在磁力攪拌器上于60℃蒸發(fā)至三分之一體積，以達(dá)到濃縮效果[24]，采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定單糖組成(中科百測(cè)科技有限公司，北京).

待測(cè)樣品水解：精確吸取250 μL樣品水解液到5 mL EP管中，加入250 μL 0.6 mol/L NaOH、500 μL 0.4 mol/L PMP-甲醇，70℃反應(yīng)1 h. 冷水中冷卻10 min；加入500 μL 0.3 mol/L HCl中和，再加入1 mL 氯仿漩渦1 min，3000 r/min離心10 min，小心取上清，萃取3次后取上清液.

對(duì)照溶液：精密稱取甘露糖(M103970, 阿拉丁)、核糖(B21897, 源葉)、鼠李糖(B21172, 源葉)、葡萄糖醛酸(B25302, 源葉)、半乳糖醛酸(B21894, 源葉)、氨基葡萄糖(SG8490, 索萊寶)、葡萄糖(110833, 奧科)、氨基半乳糖(SG8450, 索萊寶)、半乳糖(SG8010, 索萊寶)、巖藻糖(B25632, 源葉)、木糖(A600998, 生工)、阿拉伯糖(B25845, 源葉)對(duì)照品適量，溶解稀釋至各糖濃度為50 μg/mL的混合對(duì)照溶液.

樣品衍生：分別精確吸取250 μL混合對(duì)照溶液和樣品水解液到5 mL EP管中，加入250 μL 0.6 mol/L NaOH，500 μL 0.4 mol/L PMP-甲醇，70℃反應(yīng)1 h. 冷水中冷卻10 min；加入500 μL 0.3 mol/L HCl中和，再加入1 mL氯仿漩渦1 min，3000 r/min離心10 min，小心取上清，萃取3次. 上清用于HPLC.

色譜分析條件：色譜柱：Xtimate C18柱，4.6 mm×200 mm；流動(dòng)相：0.05 mol/L KH2PO4(氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=6.70)-乙腈=83-17；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm.

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示. 數(shù)據(jù)分析采用Origin Version 9.0(Origin Lab Corporation，USA)方差分析和組間差異顯著性檢驗(yàn)(One-way ANOVA)，當(dāng)P<0.05時(shí)，處理組與對(duì)照組間存在顯著性差異. 圖片數(shù)據(jù)亦為實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后的結(jié)果.

2 結(jié)果

2.1 不同提取方法對(duì)藍(lán)藻膠被的提取效果

不同提取方法對(duì)藍(lán)藻膠被的提取效果見表4. 離心法和熱水水浴法對(duì)藍(lán)藻膠被提取效果不顯著. 超聲法和陽(yáng)離子交換樹脂法對(duì)膠被提取有部分效果. 一定濃度、溫度的硫酸水浴法和氫氧化鈉水浴法對(duì)魚腥藻膠被提取效果明顯；氫氧化鈉水浴法可以使念珠藻鞘結(jié)構(gòu)變得松散，而后通過超聲可將藻絲與膠被分離.

表4 不同提取方法對(duì)藍(lán)藻膠被的提取效果

√表示可明顯提取膠被，×表示無明顯提取效果，*表示有部分提取效果.

圖2a顯示魚腥藻藻絲通過超聲法均可打散成短單鏈，但藻絲周圍莢膜依然存在. 通過陽(yáng)離子交換樹脂法，藻絲解聚成短絲，但周圍莢膜依然存在(圖2b). 硫酸水浴法(1 mol/L H2SO4，分別為50℃，40 min、60℃，30 min、70℃，20 min)和氫氧化鈉水浴法(0.01 mol/L NaOH，分別為50℃，20 min、60℃，40 min、70℃，30 min)均可將莢膜提取完全(圖2c).

念珠藻在高速離心(>15000g，>1 h)后，鞘結(jié)構(gòu)發(fā)生小部分破裂，少部分藻鏈逸出，經(jīng)印度墨水染色發(fā)現(xiàn)逸出藻鏈周圍無膠被存在(圖2d). 超聲法對(duì)膠被提取效果不明顯，且功率過高容易導(dǎo)致細(xì)胞破裂(圖2e). 陽(yáng)離子交換樹脂法只能提取最外層鞘，內(nèi)層鞘提取效果不明顯(圖2f). 在溫度、時(shí)間閾值內(nèi)適當(dāng)提高溫度、延長(zhǎng)處理時(shí)間，氫氧化鈉水浴法(0.01 mol/L，80℃，40 min)可以使鞘結(jié)構(gòu)變得松散(圖2g)，但膠被依然存在(圖2h)，再用超聲法冰浴超聲(20 kHz, ≥30 W, ≥2 min, on: 3 s, off: 3 s)，即可將念珠藻藻絲與鞘層完全分離(圖2i).

圖2 不同提取方法對(duì)藍(lán)藻膠被形態(tài)的影響：(a～c)FACHB-82魚腥藻；(d～i)FACHB-599念珠藻 (a:超聲法處理,印度墨水染色；b:陽(yáng)離子交換樹脂法處理,印度墨水染色；c:硫酸水浴法/氫氧化鈉水浴法處理,印度墨水染色；d:離心法處理,逸出藻鏈(箭頭)；e:超聲法處理,印度墨水染色；f:陽(yáng)離子交換樹脂法處理；g:氫氧化鈉水浴法處理；h:氫氧化鈉水浴法處理,印度墨水染色；i:氫氧化鈉水浴法+超聲法處理,印度墨水染色)Fig.2 Effects of different extraction methods on the morphology of cyanobacterial surface coat: (a-c) FACHB-82 Anabaena sp.; (d-i) FACHB-599 Nostoc sp. (a: ultrasonic method, stained with India ink；b: cation exchange resin method, stained with India ink；c: sulfuric acid/sodium hydroxide bath, stained with India ink；d: centrifugation, escaped algal filament (arrow)；e: ultrasonic method, stained with India ink；f: cation exchange resin method；g: sodium hydroxide bath；h: sodium hydroxide bath, stained with India ink；i: sodium hydroxide bath and ultrasonic method, stained with India ink)

2.2 藍(lán)藻膠被提取方法條件優(yōu)化

魚腥藻膠被完全提取組的藻細(xì)胞存在部分自發(fā)熒光，熒光均較弱(圖3)，而僅通過自發(fā)熒光的觀察無法選取魚腥藻膠被的最優(yōu)提取方法. 魚腥藻膠被完全提取組和對(duì)照組的藻細(xì)胞數(shù)如圖4所示，處理組A1(1 mol/L H2SO4，50℃，40 min)、A3(1 mol/L H2SO4，70℃，20 min)、B2(0.01 mol/L NaOH，60℃，40 min)、B3(0.01 mol/L NaOH，70℃，30 min)與對(duì)照組相比，細(xì)胞密度均出現(xiàn)顯著性降低(P<0.05)，其中A3、B2組為極顯著差異(P<0.01). 處理組A2(1 mol/L H2SO4，60℃，30 min)、B1(0.01 mol/L NaOH，50℃，20 min)細(xì)胞密度分別達(dá)到(501.67±12.58)×107cells/L和(495.33±6.03)×107cells/L，占對(duì)照組的98.8%和97.6%，與對(duì)照無顯著差異.

念珠藻在高溫、長(zhǎng)時(shí)間的氫氧化鈉水浴法(0.01 mol/L，80℃，40 min)條件下鞘結(jié)構(gòu)才變得松散，在光學(xué)顯微鏡下未見明顯邊緣(圖2g)，由于超聲功率過大，時(shí)間過長(zhǎng)易對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生一定的機(jī)械破壞，因此選擇低功率、短時(shí)間冰浴超聲(20 kHz, 30 W, 2 min, on: 3 s, off: 3 s)結(jié)合處理即可將膠被和藻絲完全分離(圖2i)，且自發(fā)熒光依然存在(圖3C).

圖3 藍(lán)藻完全提取膠被處理組自發(fā)熒光：(A、B) FACHB-82魚腥藻; (C) FACHB-599念珠藻 (A1(1 mol/L H2SO4，50℃，40 min)；A2(1 mol/L H2SO4，60℃，30 min)；A3(1 mol/L H2SO4，70℃，20 min)；B1(0.01 mol/L NaOH，50℃，20 min)；B2(0.01 mol/L NaOH，60℃，40 min)；B3(0.01 mol/L NaOH，70℃，30 min)；C(0.01 mol/L NaOH，80℃，40 min+20 kHz, 30 W, 2 min, on: 3 s, off: 3 s))Fig.3 Spontaneous fluorescence of cyanobacteria in the experimental treatment groups：(A, B) FACHB-82 Anabaena sp. ; (C) FACHB-599 Nostoc sp.

圖4 魚腥藻完全提取膠被實(shí)驗(yàn)組下藻細(xì)胞密度(A1(1 mol/L H2SO4，50℃，40 min)；A2(1 mol/L H2SO4，60℃，30 min)；A3(1 mol/L H2SO4，70℃，20 min)；B1(0.01 mol/L NaOH，50℃，20 min)；B2(0.01 mol/L NaOH，60℃，40 min)；B3(0.01 mol/L NaOH，70℃，30 min)；C(未處理)；*，P<0.05；**，P<0.01)Fig.4 Cell density of Anabaena sp. in the experimental treatment groups

2.3 不同類型膠被的單糖成分分析

將上述對(duì)藻細(xì)胞熒光活性和細(xì)胞數(shù)無顯著影響的方法用于魚腥藻和念珠藻不同膠被類型的提取，魚腥藻采用氫氧化鈉水浴法(0.01 mol/L NaOH，50℃，20 min)，念珠藻采用氫氧化鈉水浴法(0.01 mol/L，80℃，40 min)+超聲法(20 kHz, 30 W, 2 min, on: 3 s, off: 3 s)進(jìn)行膠被提取，并對(duì)其進(jìn)行多糖組分分析. 結(jié)果如表5所示，魚腥藻膠被包含粘液、莢膜，且培養(yǎng)基中存在RPS. RPS、粘液、莢膜三者的單糖總含量比約為2∶1∶15，RPS和粘液的單糖含量較少，僅有5.581±0.24和2.823±0.25 mg/g，莢膜單糖總含量為43.673±0.71 mg/g. RPS和粘液中占比最高的均為阿拉伯糖，分別達(dá)到36.8%和75.4%，而莢膜中最主要的單糖為葡萄糖，占比為32.5%. 此外，與RPS和粘液相比，莢膜中還含有氨基葡萄糖(1.261±0.02 mg/g).

念珠藻膠被只含鞘，且未分泌RPS入培養(yǎng)基中. 鞘的總單糖含量達(dá)到111.719±4.51 mg/g，葡萄糖占比最高，為32.4%，此外，念珠藻中含有魚腥藻所沒有的葡萄糖醛酸(5.066±0.24 mg/g)、鼠李糖(0.652±0.05 mg/g)和木糖(10.313±0.64 mg/g).

3 討論

藍(lán)藻膠被主要以3種形態(tài)(鞘、莢膜和粘液)存在，這些膠被形態(tài)有時(shí)在藻細(xì)胞中是并存的. 膠被作為藻細(xì)胞與外界環(huán)境間的緩沖基質(zhì)，可抵御外界不良環(huán)境以及參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳輸，且不同類型膠被發(fā)揮的生物學(xué)功能不同[23,32-35]. 本研究在不顯著影響藻類細(xì)胞活性和細(xì)胞完整性的前提下完全提取不同形態(tài)膠被，為后續(xù)分析膠被生物學(xué)功能提供技術(shù)支撐. 對(duì)已有文獻(xiàn)進(jìn)行歸納(表1)，發(fā)現(xiàn)影響膠被提取效果的主要因素有溫度、提取劑濃度、時(shí)間等. 通過表1確定各提取方法的因素閾值，研究設(shè)置溫度梯度50、60、70和80℃，提取劑濃度梯度0.01、0.1和1 mol/L，時(shí)間梯度20、30和40 min，離心速度15000、20000、25000 和30000g，超聲功率30、60、90和120 W等，設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)雙因素和正交實(shí)驗(yàn)，針對(duì)不同形態(tài)的膠被區(qū)別提取，通過印度墨水染色和藻細(xì)胞自發(fā)熒光觀察、細(xì)胞密度測(cè)定，確定藍(lán)藻不同形態(tài)膠被最優(yōu)提取方法.

膠被是藍(lán)藻細(xì)胞外的多層保護(hù)結(jié)構(gòu)，因此，溫和或機(jī)械方法無法將其完全提取[36]. 由于RPS溶解于培養(yǎng)基中，因此可通過過濾法直接獲取藍(lán)藻的RPS. 粘液松散地分散在細(xì)胞周圍，采用離心法(10000g，10 min)可將藻細(xì)胞和粘液分離[16]. 本研究中，魚腥藻莢膜與細(xì)胞粘結(jié)十分緊密，念珠藻鞘層結(jié)構(gòu)致密且堅(jiān)硬，通過高速離心(>15000g)和冰浴超聲均無法將莢膜和鞘與藻細(xì)胞分離，且超聲功率過大、時(shí)間過長(zhǎng)容易使藻細(xì)胞破裂. 陽(yáng)離子交換樹脂中的Na+雖然可與Ca2+、Mg2+之間發(fā)生離子交換作用，破壞Ca2+和Mg2+與膠被之間的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，但僅促使魚腥藻藻絲解聚，念珠藻失去最外層鞘，未能完全提取莢膜和鞘，這可能是由于陽(yáng)離子交換樹脂的交換容量較小，不足以提取大量膠被.

研究結(jié)果顯示，使用提取劑的熱水浴法對(duì)膠被的提取效果較好. 莢膜可通過硫酸水浴法和氫氧化鈉水浴法完全提取. 一方面，溫度升高使群體結(jié)構(gòu)變得松散，分子運(yùn)動(dòng)加劇，增加膠被的可溶性[36]；另一方面，硫酸使溶液pH值降低，引起顆粒之間表面電荷的變化，導(dǎo)致群體藻細(xì)胞解散并改變膠被在水中的溶解度[29]，氫氧化鈉可使膠被中的酸性基團(tuán)分離，在此作用下帶負(fù)電荷的膠被相互排斥，增加其溶解性. 本研究為減少細(xì)胞裂解，設(shè)置提取時(shí)間均小于1 h，發(fā)現(xiàn)1 mol/L H2SO4分別處理50℃，40 min、60℃，30 min、70℃，20 min以及0.01 mol/L NaOH分別處理50℃，20 min、60℃，40 min、70℃，30 min均可完全提取莢膜. 此外，鞘層通過0.01 mol/L NaOH水浴法進(jìn)一步高溫、延長(zhǎng)處理時(shí)間(80℃，40 min)，結(jié)構(gòu)才變得松散(圖2g). Su等和Ge等曾采用蒸餾水80℃水浴6 h提取念珠藻膠被[26-27]，推測(cè)與蒸餾水處理相比NaOH可以加速鞘層的溶解，因此其處理時(shí)間相對(duì)熱水水浴法較短.

比較魚腥藻完全提取莢膜方法下藻細(xì)胞的自發(fā)熒光，發(fā)現(xiàn)各處理組自發(fā)熒光無明顯差異(圖3). 進(jìn)一步對(duì)各組提取后的藻細(xì)胞密度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示1 mol/L、60℃、30 min硫酸水浴法和0.01 mol/L、50℃、20 min氫氧化鈉水浴法提取后的藻細(xì)胞數(shù)無顯著變化(P>0.05)，表明此條件適用于在不破壞細(xì)胞的完整性前提下完全提取莢膜，而其他處理組中的藻細(xì)胞均有不同程度的裂解. 有研究報(bào)道，硫酸水浴法中酸的濃度要求較高，需達(dá)到1 mol/L，才有利于膠被多糖的水解[29]，而在氫氧化鈉水浴法中，濃度較高不利于細(xì)胞的存活[36]，因此NaOH濃度為0.01 mol/L為宜. 此外，由于鞘層結(jié)構(gòu)較莢膜更堅(jiān)硬[15]，其提取溫度相較莢膜更為劇烈，0.01 mol/L、80℃、40 min氫氧化鈉水浴法處理，念珠藻鞘層結(jié)構(gòu)才變得松散. 為減少藻細(xì)胞破壞，進(jìn)一步通過低功率、短時(shí)間冰浴超聲(20 kHz，30 W，on: 3 s，off: 3 s)2 min后，藻絲即與膠被完全分離. 用印度墨水染色單根藻絲后觀察顯示其周圍均無膠被結(jié)構(gòu)，由此推測(cè)鞘層結(jié)構(gòu)雖致密且堅(jiān)硬，但與藻細(xì)胞之間的粘附力不強(qiáng).

大多數(shù)藍(lán)藻膠被包含大量中性糖(2～10種)與蛋白質(zhì)分子結(jié)合[37-38]. 將本研究中以最優(yōu)方法提取出的膠被及RPS進(jìn)行了單糖組分分析，魚腥藻膠被中含有7種單糖組分，RPS中含有6種，念珠藻膠被中含有7種單糖組分. 魚腥藻膠被中包含粘液(2.823±0.25 mg/g)和莢膜(43.673±0.71 mg/g)，并釋放RPS(5.581±0.24 mg/g)到培養(yǎng)液中；念珠藻膠被僅含鞘層(111.719±4.51 mg/g)，不分泌RPS. 有研究報(bào)道RPS是由莢膜或粘液分泌的[15]，這和本研究在光學(xué)顯微鏡下觀察的膠被類型及組分分析結(jié)果一致，說明膠被大部分與藻細(xì)胞結(jié)合并參與藻細(xì)胞生命活動(dòng)，少部分分泌到外界環(huán)境或松散地結(jié)合在藻細(xì)胞周圍. 本研究中念珠藻均為單個(gè)小群體外包裹鞘層結(jié)構(gòu)，群體之間沒有粘附作用，魚腥藻則是藻絲粘附成大型群體生存. 這可能是因?yàn)槟钪樵迩手泻忻撗跆?0.652±0.05 mg/g鼠李糖)，從而使膠被產(chǎn)生疏水性[6]，未水化為粘液或RPS. 另一方面，魚腥藻莢膜中存在的氨基葡萄糖(1.261±0.02 mg/g)是念珠藻鞘層結(jié)構(gòu)中沒有的，這些取代基可使得莢膜比鞘更具有粘附性和凝結(jié)特性[39]，導(dǎo)致細(xì)胞與膠被間的聯(lián)結(jié)十分牢固. 由此說明，膠被單糖組分的差異可能是造成莢膜和鞘的形態(tài)不同的原因之一. 此外，念珠藻鞘中的葡萄糖醛酸(5.066±0.24 mg/g)，使其鞘可用堿性水溶液提取，而魚腥藻莢膜中的氨基葡萄糖(1.261±0.02 mg/g)，使其莢膜可用酸性水溶液提取[40]. 本研究得到的對(duì)莢膜和鞘的最優(yōu)提取方法也恰恰證實(shí)了這一點(diǎn)，魚腥藻莢膜粘附性強(qiáng)，在高速離心作用下無法將藻細(xì)胞與莢膜分離，而在50～60℃氫氧化鈉/硫酸水浴30 min條件下可完全提取，念珠藻的鞘與藻細(xì)胞粘附力較弱但堅(jiān)硬，需更劇烈的方法(0.01 mol/L NaOH，80℃，40 min)和冰浴超聲(20 kHz, 30 W, 2 min, on: 3 s, off: 3 s)結(jié)合處理.

將本研究得到的莢膜和鞘的最優(yōu)提取法分別運(yùn)用到膠被形態(tài)以莢膜為主的纖細(xì)席藻(Phormidiumtenue)、鞘絲藻(Lyngbyasp.)、微鞘藻(Microcoleussp.)等絲狀藻和膠被形態(tài)以鞘為主的卵囊藻(Oocystissp.)、雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)等藻種，均有很好的提取效果，且提取后的藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整并具有一定的活性(數(shù)據(jù)未顯示). 在今后的研究中，可針對(duì)有膠被和脫膠被的藻種進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)鹽吸收、抗脅迫能力等過程的對(duì)比分析，進(jìn)一步明確藻類膠被的生物學(xué)功能.