固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定結(jié)合雌激素乳膏中主要成分含量

楊 婷，李欣榮，姚 軍，高曉黎

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

結(jié)合雌激素(conjugated estrogens，CE)是從孕馬尿中提取的天然混合類雌激素[1-2]。結(jié)合雌激素類藥物最早由美國(guó)惠氏-艾爾斯特制藥公司生產(chǎn)，于1942年由FDA批準(zhǔn)使用，商品名為PREMARIN(倍美力)，主要成分為雌酮硫酸鈉(sodium estrone sulfate，Es)和馬烯雌酮硫酸鈉(sodium equilin sulfate，Eqs)[3-6]，臨床用于治療女性更年期綜合癥、骨質(zhì)疏松癥、與絕經(jīng)相關(guān)的中-重度血管舒縮癥、與雌激素缺乏相關(guān)的各種疾病等。

目前，結(jié)合雌激素類藥物主要有兩種劑型，分別是片劑和乳膏。其有效成分結(jié)合雌激素的含量測(cè)定一般采用HPLC法[7]和GC法[8]。相比于片劑，乳膏中結(jié)合雌激素含量(0.625 mg·g-1)較低，處方組成復(fù)雜，其中的白蜂蠟、單硬脂酸甘油酯等油相基質(zhì)使乳膏破乳困難，使得檢測(cè)時(shí)色譜柱柱效降低，影響2種主要成分的含量測(cè)定結(jié)果，導(dǎo)致結(jié)合雌激素回收率較低。因此，作者采用固相萃取-高效液相色譜法(SPE-HPLC)測(cè)定結(jié)合雌激素乳膏中2種主要成分含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察[9]，旨在建立更加科學(xué)、有效的結(jié)合雌激素測(cè)定方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

Es對(duì)照儲(chǔ)備液(濃度441.0 μg·mL-1，批號(hào)20190623)、Eqs對(duì)照儲(chǔ)備液(濃度288.6 μg·mL-1，批號(hào)20160404)、結(jié)合雌激素原料藥(批號(hào)20190501)、結(jié)合雌激素乳膏(批號(hào)20190903)，新疆新姿源生物制藥有限責(zé)任公司；空白基質(zhì)(批號(hào)20190329)，自制。

磷酸二氫鉀(批號(hào)20190516)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈，色譜級(jí)，Sigma公司。

HY-5型回旋振蕩器，金壇醫(yī)療儀器廠；KQ5200DE型超聲儀，昆山超聲儀器有限公司； LC-20AB-4型高效液相色譜儀，日本島津公司；BT100-1L-A型蠕動(dòng)泵，保定蘭格恒流泵有限公司；Mulyifuge X3R型高速離心機(jī)，德國(guó)Thermo公司；SPE小柱(Sep-Pak?Vac 3cc C18 cartridges)，美國(guó)Waters公司。

1.2 對(duì)照溶液的制備

精密吸取Es對(duì)照儲(chǔ)備液(441.0 μg·mL-1)2.5 mL置于5 mL容量瓶中，得到220.5 μg·mL-1Es對(duì)照溶液。

精密吸取Eqs對(duì)照儲(chǔ)備液(288.6 μg·mL-1)2.5 mL置于5 mL容量瓶中，得到144.3 μg·mL-1Eqs對(duì)照溶液。

1.3 供試溶液的制備

精密稱取1 g乳膏置于50 mL離心管中；加入25 mL純化水，渦旋1 min，分散乳膏；再加入15 mL純化水，超聲20 min；室溫振搖2 h后于4 ℃、13 000 r·min-1離心60 min；將上清液置于另一離心管中。

用3 mL甲醇活化SPE小柱，再用3 mL 5%甲醇水溶液潤(rùn)洗SPE小柱。

精密吸取20 mL下清液過SPE小柱，用2 mL 5%甲醇水溶液潤(rùn)洗SPE小柱，甲醇溶液洗脫，收集洗脫液3 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。

色譜條件：Agilent C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.025 moL·L-1KH2PO4(1∶3，體積比)，流速1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫35 ℃，運(yùn)行時(shí)間30 min。

1.4 原料藥溶液的制備

精密稱取1.166 g結(jié)合雌激素原料藥至容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.625 mg·mL-1原料藥溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的確定

結(jié)合雌激素乳膏成分復(fù)雜，在含量測(cè)定前需進(jìn)行前處理。分別采用有機(jī)溶劑萃取法、液-液萃取法和固相萃取法對(duì)乳膏進(jìn)行前處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：有機(jī)溶劑萃取法需要加入乙醚多次萃取[8]，操作復(fù)雜，且主要成分有損失；液-液萃取法需加入飽和BaCl2溶液，萃取率低，且除雜效果不佳；而固相萃取法中使用SPE小柱，可以消除溶液中賦型劑及油相基質(zhì)的干擾，除雜效果好，且可以對(duì)目標(biāo)成分進(jìn)行富集，使目標(biāo)成分純度更高，在檢測(cè)時(shí)對(duì)色譜柱的損害小，并且可以提高樣品前處理效率。因此，采用固相萃取法對(duì)乳膏進(jìn)行前處理。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密吸取對(duì)照溶液(Es 220.5 μg·mL-1、Eqs 144.3 μg·mL-1)2.5 mL置于5 mL容量瓶中，用甲醇-水(1∶1)定容至刻度，采用倍量稀釋法進(jìn)行稀釋，得到濃度(μg·mL-1)分別為110.25、55.125、27.57、13.78、6.89的Es系列溶液，濃度(μg·mL-1)分別為72.15、36.075、18.0375、9.02、4.5的Eqs系列溶液；將各系列溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)、溶液濃度(x)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：Es在6.89～220.5 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=81307x-45891，R2=0.9996；Eqs在4.5～144.3 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=72874x-65248，R2=0.9999。

2.3 高效液相色譜圖

精密吸取混合對(duì)照溶液(Es 220.5 μg·mL-1、Eqs 144.3 μg·mL-1)2.5 mL置于5 mL容量瓶中，用甲醇-水(1∶1)定容至刻度，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，其高效液相色譜圖如圖1所示。

圖1 混合對(duì)照溶液的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of mixed reference solution

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取Es和Eqs對(duì)照溶液20 μL，按色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算RSD分別為0.15%和0.19%。表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

稱取結(jié)合雌激素乳膏1 g共6份，按1.3方法制備供試溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，其高效液相色譜圖如圖2所示。

圖2 供試溶液的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC of test solution

由圖2可得到結(jié)合雌激素含量分別為74.793%、75.963%、73.887%、75.040%、76.581%、75.213%，RSD為1.25%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

稱取結(jié)合雌激素乳膏1 g，按1.3方法制備供試溶液，在4 ℃下分別放置0 h、24 h、48 h，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得結(jié)合雌激素含量分別為75.239%、76.312%、76.563%，RSD為0.925%。表明供試溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

稱取空白乳膏基質(zhì)9份分別置于50 mL離心管中，3份為一組，按1.4方法配制0.625 mg·mL-1的原料藥溶液。分別吸取0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL的原料藥溶液置于50 mL離心管中，配制成標(biāo)示量的80%、100%和120%，按1.3方法制備供試溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見表1。

表1加標(biāo)回收率(n=3)

Tab.1 Adding standard recovery rate(n=3)

由表1可知，標(biāo)示量80%、100%和120%的Es供試溶液的平均加標(biāo)回收率分別為105.32%、103.10%、105.81%，RSD分別為0.60%、1.32%、1.57%；標(biāo)示量80%、100%和120%的Eqs供試溶液的平均加標(biāo)回收率分別為95.15%、96.81%、96.37%，RSD分別為0.88%、1.57%、1.09%。

3 結(jié)論

采用SPE-HPLC法同時(shí)測(cè)定結(jié)合雌激素乳膏中雌酮硫酸鈉和馬烯雌酮硫酸鈉的含量。該方法準(zhǔn)確度高，精密度和靈敏度均能滿足測(cè)定要求，加標(biāo)回收率滿足低劑量藥物的檢測(cè)要求，適用于結(jié)合雌激素乳膏中主要成分含量測(cè)定。