擠奶廳氣載大腸桿菌的分離鑒定及其REP-PCR指紋圖譜分型研究

鐘召兵，王寧，孫紅華，楊夫會

（1.山東省泰安市岱岳區(qū)行政審批服務(wù)局，泰安 271018；2.山東省泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局，泰安 271018）

乳品營養(yǎng)豐富，是優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)食品，同時也是微生物良好的培養(yǎng)基，在生產(chǎn)加工運輸過程中極易被微生物污染[1]。大腸桿菌是乳品國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的菌群檢測項目的主要目標(biāo)物，且是食品級飲用水受糞源污染的重要微生物學(xué)指標(biāo)[2]。

擠奶廳的空氣質(zhì)量對原料乳的質(zhì)量有著重要的影響，因此從擠奶廳中分離大腸桿菌不僅可以為評估微生物污染提供有價值的信息，其基因分型還可以用于乳及乳產(chǎn)品生產(chǎn)過程中污染源的追蹤[3]。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了一系列的分子生物學(xué)分型方法[4]。在通過PCR擴(kuò)增細(xì)菌基因外的重復(fù)DNA片段獲得的菌株特異性遺傳圖譜中，其中重復(fù)DNA片段包含了一個高度保守的回文序列（repetitive extragenic palindromic elements, REP），以腸桿菌科基因重復(fù)序列為引物進(jìn)行PCR，能擴(kuò)增出多態(tài)性的DNA圖譜[5]。通過對指紋圖譜進(jìn)行綜合分析，獲得其相似指數(shù)，能準(zhǔn)確地反映菌株間DNA基因組的異同，能區(qū)別含有這些重復(fù)序列的不同菌種或菌株，因此具有很強(qiáng)的鑒別種乃至菌株的能力[6]。REP-PCR作為一種行之有效的分子分型技術(shù)，已經(jīng)被作為一種流行病學(xué)調(diào)查方法[7]。

本研究從28個生鮮乳收購站的擠奶廳空氣中分離氣載大腸桿菌，通過菌株的REP-PCR指紋圖譜分析分離株的同源性，旨在為生鮮乳及乳制品生產(chǎn)源頭上控制大腸桿菌污染及追蹤污染源提供一種有效的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

采用國際標(biāo)準(zhǔn)的ANDERSEN-6級空氣微生物樣品收集器（Andersen，1958）[8]，將其置于擠奶廳中央，高度為1m，空氣流量是28.31m3/min，以血瓊脂培養(yǎng)基為采樣介質(zhì)，驅(qū)動時間根據(jù)不同衛(wèi)生條件在1～5min之間。

1.2 主要試劑及儀器

緩沖蛋白胨水、肉湯培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂、麥康凱3號瓊脂（Oxoid）等。REP1:(3′-CACTTAGGGGTCCTCGAATGTA-5′)和REP2(5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′)由大連寶生物公司合成；TaqDNA聚合酶PCR反應(yīng)試劑為大連寶生物公司產(chǎn)品。

培養(yǎng)皿，高壓蒸汽滅菌鍋，Eppendorf PCR擴(kuò)增儀（AG22331），上海天能科技有限公司凝膠成像系統(tǒng)（tanon-2500）。電泳儀（北京六一儀器廠）；凝膠自動成像（Biorad，意大利）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海實驗儀器總廠）。

1.3 大腸桿菌培養(yǎng)、分離鑒定

采集的樣本在37℃條件下培養(yǎng)24h后，所有的陽性菌落經(jīng)過“KOH 反應(yīng)”試驗鑒定其是革蘭氏陰性菌還是革蘭氏陽性菌。革蘭氏陰性菌在血瓊脂培養(yǎng)基（杭州天河，批號180227）上進(jìn)行一次分離培養(yǎng)。然后在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基平板上37℃培養(yǎng)18～24h；挑取黑色金屬閃光的菌落，再次接種麥康凱3號瓊脂培養(yǎng)基（Oxoid）平板，37℃恒溫培養(yǎng)過夜。用API 20 E（Bio Merieux, Marcy-I’Etoile, France）鑒定。

1.4 菌體DNA提取

將大腸桿菌接種到5mL LB培養(yǎng)基（Oxoid）中振蕩培養(yǎng)18h。然后取出培養(yǎng)液置于1.5mL Ep管中，10000×g離心2min，棄上清，用100μLTE緩沖液（10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA, pH 8.0）懸浮沉淀，在100℃條件下煮沸10min，再迅速冰浴5min，最后12000×g離心2min后，取上清液作為模板，在-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 REP-PCR 反應(yīng)

使用含有20個堿基左右的引物通過PCR擴(kuò)增細(xì)菌基因的重復(fù)DNA片段來獲得菌株特異性圖譜，用計算機(jī)對圖譜進(jìn)行綜合分析，觀察菌株間基因組差異。

REP-PCR反應(yīng)體系為25μL：1×TAE緩沖液，1.5mmol/L MgCl2(TaKaRa)，0.875mmol/μL dNTP，1.5U Taq DNA聚合酶，引物各300ng/μL，2μL模板DNA，最后用滅菌雙蒸水補充至25μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，51℃復(fù)性1min，72℃延伸3min，共32個循環(huán)，最后72℃延伸16min結(jié)束反應(yīng)。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，用透射紫外燈觀查結(jié)果和照相。為了減少誤差，所有分離菌的REP-PCR均在同一反應(yīng)條件下一次完成，反應(yīng)產(chǎn)物加樣于同一塊凝膠中進(jìn)行電泳。

1.6 REP-PCR指紋分析

記錄擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳譜帶。樣品有擴(kuò)增帶賦值為“1”，無擴(kuò)增帶賦值為“0”，用電泳圖象分析軟件（Gel Image System, Version 4.00）進(jìn)行分析，采用非加權(quán)對數(shù)算術(shù)平均法（Unweighted pair group method using averages algorithm，UPGMA）、利用NTSYS-pc 2.10軟件構(gòu)建聚類樹狀圖，進(jìn)行聚類分析。每一個分離株看作是一個分類學(xué)單位（Operational Taxonomic Unit,OTU），并且把≥90%相似性的菌株看作是一個分離株[9]。

2 結(jié)果

2.1 氣載大腸桿菌分離鑒定

95份樣品中，有23份分離到大腸桿菌，共16株，陽性率平均24.21%（表1）。

表1 擠奶廳氣載大腸桿菌的分離情況

2.2 REP-PCR鑒定

用REP-PCR方法對從擠奶廳分離的氣載大腸桿菌進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)電泳譜帶繪制的UPGMA遺傳進(jìn)化樹（圖1），16株氣載大腸桿菌共分為13種基因型，分別是A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M。它們之間的同源性在57%～92%之間，大部分菌株間相似性低于90%，同源性大于90%的只有菌株3和4、7和8以及9與10（圖1）。

圖1 16株氣載大腸桿菌的REP-PCR聚類圖

3 討論

現(xiàn)代原料乳及乳制品的質(zhì)量安全控制涉及整個供應(yīng)鏈（即從農(nóng)場到餐桌的過程）。在整個供應(yīng)鏈當(dāng)中，奶源是供應(yīng)鏈的起點，乳制品是最終產(chǎn)品，這兩點是乳品質(zhì)量安全得以實現(xiàn)的關(guān)鍵[10]。對于過去的最終產(chǎn)品質(zhì)量合格檢驗的控制模式已經(jīng)不能適應(yīng)現(xiàn)代乳及乳制品質(zhì)量安全生產(chǎn)的發(fā)展。

乳產(chǎn)品質(zhì)量安全問題嚴(yán)重影響我國乳制品行業(yè)發(fā)展。造成安全問題的原因是多方面的，其中原料奶生產(chǎn)中所使用的容器及用具，如奶桶、擠奶機(jī)、濾乳布和毛巾等不清潔，是造成污染的重要途徑。畜舍內(nèi)飄浮的灰塵中常常含有許多微生物，多數(shù)為芽孢桿菌及球菌，此外也含有大量的霉菌孢子，空氣中的塵埃落入乳中即可造成污染[11]。

蠅、蚊有時會成為最大的污染源，特別是夏秋季節(jié)，由于蒼蠅常在垃圾或糞便上停留，所以每個蒼蠅體表可存在幾百萬甚至幾億個細(xì)菌，其中包括各種致病菌，當(dāng)其落入乳中時就可把細(xì)菌帶入乳中造成污染。乳被飼料中的細(xì)菌污染，主要是在擠乳前分發(fā)干草時，附著在干草上的細(xì)菌（主要是芽孢桿菌，如酪酸芽孢桿菌、枯草桿菌等），隨同灰塵、草屑等飛散在廄舍的空氣中，既污染了牛體，又污染了所有用具，或擠奶時直接落入奶桶，造成乳的污染[12]。從源頭上控制污染已經(jīng)成為解決乳制品質(zhì)量安全的關(guān)鍵點，在生鮮乳及乳制品生產(chǎn)中，大腸桿菌超標(biāo)是一個重要的衛(wèi)生安全問題[13]。

本研究按照食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗-大腸桿菌檢驗標(biāo)準(zhǔn)對收集的氣載大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定，并分析分離株的同源性。結(jié)果從95份樣品的23份中分離到16株大腸桿菌，其中陽性率為24.21%（23/95）。

REP-PCR是由Versalovic等[14]建立起來的一種菌株鑒定技術(shù)，通過PCR擴(kuò)增細(xì)菌基因的重復(fù)DNA片段可獲得菌株特異性遺傳圖譜，其中重復(fù)DNA片段包含了一個高度保守的回文序列（REP）為38bp的片段，由1個保守回文段以及兩端分別有6個降解位點和1個5bp的可變框構(gòu)成。REP片段中的回文序列以及能形成框架結(jié)構(gòu)的特征是導(dǎo)致其具有高度保守結(jié)構(gòu)等多重功能的關(guān)鍵。通過對擴(kuò)增形成的DNA片段條帶的電泳指紋圖譜進(jìn)行綜合分析，獲得其相似指數(shù)，能準(zhǔn)確地反映菌株間DNA基因組的異同。理論上，同種、同型以及具備相同的遺傳基因菌株即同源性相同的細(xì)菌應(yīng)具備特異而穩(wěn)定的DNA指紋圖譜，故該方法可應(yīng)用于不同種、型及細(xì)菌菌株的同源性或相似性鑒定。Del Vecchio等[15]用肺炎支原體的RepMP3序列中分離的RW3A為引物，對其進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)他們的PCR產(chǎn)物有高度的重復(fù)性和穩(wěn)定性。而Vander Zee[16]等比較了Rep-PCR與其他鑒定方法的差異，發(fā)現(xiàn)Rep-PCR與PFGE（染色體DNA脈沖場凝膠電泳PFGE）的分析結(jié)果一致。因此，REP-PCR作為一種行之有效的分子鑒定分型技術(shù)，已被用作一種病原學(xué)或分子流行病學(xué)調(diào)查的研究方法[17]。

本研究利用REP-PCR方法分析16株氣載大腸桿菌的指紋圖譜，對氣載大腸桿菌進(jìn)行分型，16株菌分為13種基因型，而且各個基因型之間的同源性較低，只有6株兩兩之間的同源性＞90%。這表明空氣中的大腸桿菌來源更為廣泛，而且通過克隆傳播的可能性較低。這可能與擠奶廳日常管理要求擠奶后清洗消毒，使其空氣不適宜細(xì)菌繁殖有關(guān)。大腸桿菌氣源性傳播途徑往往被人們所忽略。但是本研究的結(jié)果表明，擠奶廳環(huán)境中的氣載大腸桿菌，其基因型多且同源性較低。因此，在實際生產(chǎn)中除了需要清洗消毒外，還應(yīng)采取定期更換消毒劑等措施來控制大腸桿菌通過空氣進(jìn)行散播。

REP-PCR作為一種分子分型技術(shù)，可用于擠奶廳大腸桿菌的檢測、基因分型研究及同源性的分析。對控制擠奶廳空氣中大腸桿菌的污染，指導(dǎo)生鮮乳及乳制品生產(chǎn)企業(yè)從源頭上控制大腸桿菌的傳播有重要意義。