洋川芎內(nèi)酯A對單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用及機(jī)制研究

鄭 雷，陳 翔，尹博煒，陳大可，胡明哲

關(guān)鍵字：洋川芎內(nèi)酯A；單側(cè)輸尿管梗阻；腎間質(zhì)纖維化；Wnt4/β-catenin信號通路

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要因素，隨著生活方式改變，其發(fā)病率也隨之逐年上升，已成為世界范圍內(nèi)的公共健康問題[1]。據(jù)調(diào)查，我國CKD發(fā)病率已高達(dá)10.8%，患者數(shù)量約1億例，而大量CKD患者可發(fā)展為終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）[2]，嚴(yán)重威脅生命健康。腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是各類病因所致慢性腎臟病的共同病理過程，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在腎間質(zhì)內(nèi)過度沉積以及腎間質(zhì)內(nèi)成纖維細(xì)胞異常增生，繼而破壞腎臟結(jié)構(gòu)，擾亂腎臟功能[3-4]，因此RIF是CKD病理進(jìn)程及預(yù)后途徑中的關(guān)鍵靶標(biāo)，對于CKD的病理轉(zhuǎn)歸具有重要意義。由于RIF病理機(jī)制復(fù)雜，近年來與RIF治療相關(guān)的病理探索和藥物開發(fā)成為研究熱點(diǎn)。

目前，臨床中尚無治療腎纖維化的有效藥物，而傳統(tǒng)中草藥在腎纖維化的預(yù)防及治療方面發(fā)揮積極作用[5]。川芎屬傘形科植物川芎（Ligusticum Chuanxiong Hort）的干燥根莖，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性溫味辛微苦，歸肝、膽、心包經(jīng)，具有活血化瘀、行氣解郁等功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，川芎具有抗炎、抗氧化及神經(jīng)保護(hù)等作用，對心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)均表現(xiàn)出良好的保護(hù)能力，尤其在對腎病的防治方面具有重要意義[6-7]。洋川芎內(nèi)酯A（Senkyunolide A，SenA）是川芎中重要的苯酞類物質(zhì)[8]，入血后在體內(nèi)分布良好，具有顯著的抗氧化損傷、舒張血管等作用[9]，而其對慢性腎臟病的治療是否具有同樣的可靠價值尚不明確。因此本研究擬通過單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)建立大鼠RIF模型，并給予SenA進(jìn)行干預(yù)治療。采用病理學(xué)觀察及生物分子學(xué)檢測，探討SenA改善RIF的作用及機(jī)制，為RIF治療提供新的策略，同時為川芎的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級健康雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g，購自南京青龍山動物養(yǎng)殖場，合格證號：SCXK(蘇)2017-0001。飼養(yǎng)于SPF級動物實(shí)驗(yàn)室，給予標(biāo)準(zhǔn)普通飼料，自由飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑及儀器 SenA（HPLC≥98%，Y-083）購自成都瑞芬思生物科技有限公司；厄貝沙坦（HPLC≥98%，37655）購自賽諾菲杭州制藥有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE試劑盒，武漢賽維爾生物科技有限公司；尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司；免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；HE試劑盒、RIPA裂解緩沖液，北京索萊寶科技有限公司；ECL試劑盒，美國Santa Cruz公司；α-SMA及Collagen I一抗，美國Santa Cruz公司；GAPDH及二抗，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、Wnt4、β-catenin、GSK-3β 及p-GSK-3β一抗，美國CST公司。1/10萬電子天平，日本島津公司；CK2顯微鏡，日本OLYMPUS公司；AU5800全自動生化分析儀，美國Beckman公司；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；其他試劑均購自上海西唐生物科技有限公司。

1.3 模型制備與分組 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、SenA低劑量（20 mg/kg）組、SenA高劑量（40 mg/kg）組及陽性對照（厄貝沙坦，20 mg/kg）組。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠按5 mL/kg給予8%水合氯醛進(jìn)行麻醉，在劍突下側(cè)4 cm處切開，鈍性分離皮層與肌層，暴露腎下極并游離左側(cè)輸尿管，托住輸尿管中上段，采用4-0號絲線在相距1 cm處對輸尿管兩側(cè)進(jìn)行結(jié)扎，在結(jié)扎中間部位剪斷輸尿管，縫合開口。假手術(shù)組處理同上，但不行結(jié)扎手術(shù)。造模后，各組大鼠灌胃給予相應(yīng)劑量藥物，假手術(shù)組與模型組大鼠給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥21天[10]。

1.4 標(biāo)本收集與固定 大鼠末次給藥24 h后，眼眶取血，分離血清。根據(jù)試劑盒說明書操作步驟檢測血清中Scr及BUN水平。取部分左側(cè)腎臟，固定于4%多聚甲醛中，4℃條件靜置2天，用于后續(xù)HE染色及免疫組化實(shí)驗(yàn)。剩余部分置于-80℃冰箱用于后續(xù)Western blotting試驗(yàn)。

1.5 HE染色 取出固定好的腎臟組織，經(jīng)過常規(guī)脫水、透明、浸蠟與包埋等步驟，切成4 μm薄片。隨后對其進(jìn)行HE染色，中性樹膠封片，置于顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍攝。

1.6 免疫組化 將石蠟切片后經(jīng)脫蠟水化，加入3% H2O2孵育10 min，隨后采用熱抗原修復(fù)、5%BSA封閉、一抗（1:500）4℃孵育過夜、二抗常溫孵育30 min、DAB顯色。通過水洗、復(fù)染、脫水、透明與封片，置入顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍攝。觀察指標(biāo)：蛋白陽性表達(dá)呈黃至棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞漿。同時用IPP6.0軟件對圖像進(jìn)行光密度分析。

1.7 Western blotting檢測上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取部分腎臟組織，加入裂解緩沖液提取蛋白。采用BCA法對蛋白濃度進(jìn)行分析計(jì)算。隨后在蛋白樣品中加入上樣緩沖液孵育，取蛋白樣本通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行分離，再由半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。加入5% BSA封閉1h，滴加一抗（1:1000）-4℃孵育過夜。次日滴加二抗常溫孵育30 min，隨后加入ECL液顯影成像。通過Image J影像分析系統(tǒng)計(jì)算各組蛋白表達(dá)水平，采用β-Tubulin作為內(nèi)參。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清中腎損傷標(biāo)志物水平的比較 模型組大鼠血清中BUN及Scr水平高于假手術(shù)組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型大鼠比較，SenA低劑量組、SenA高劑量組及陽性對照組大鼠血清中BUN、Scr水平均明顯降低，其中SenA高劑量組及陽性對照組降低效果更明顯（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠腎臟病理學(xué)觀察的比較 假手術(shù)組大鼠腎臟內(nèi)部未見明顯病變，腎小管大小、形態(tài)均正常。腎小管間質(zhì)未見增寬、充血或炎性細(xì)胞浸潤等。模型組大鼠腎臟中可見嚴(yán)重的腎小管擴(kuò)張、小管萎縮、上皮細(xì)胞空泡變性；同時出現(xiàn)明顯的腎小管間質(zhì)增寬、間質(zhì)內(nèi)單核/巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤增多，纖維組織增生等現(xiàn)象。與模型組大鼠比較，SenA低劑量、高劑量及陽性對照組大鼠的腎間質(zhì)損傷均有不同程度減輕，偶見炎性細(xì)胞輕度浸潤、纖維組織輕微增生等現(xiàn)象，其中以SenA低劑量組效果最佳。見圖1。

2.3 各組大鼠腎組織中Wnt4/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較 與假手術(shù)大鼠比較，模型組大鼠腎組織中Wnt4、p-GSK-3β及β-catenin表達(dá)上調(diào)（P＜0.01）。與模型組大鼠比較，SenA低、高劑量及陽性對照組大鼠腎組織中Wnt4、p-GSK-3β及β-catenin水平明顯降低，以SenA高劑量及陽性對照組效果最優(yōu)（P＜0.01），見表2，圖2。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)觀察（HE染色）

表2 各組大鼠腎組織中Wnt4、p-GSK-3β及β-catenin表達(dá)水平的變化

圖2 各組大鼠腎組織中Wnt4、p-GSK-3β及β-catenin表達(dá)情況

2.4 各組大鼠腎組織中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的比較 與假手術(shù)大鼠比較，模型組大鼠腎組織中E-cadherin表 達(dá) 下 調(diào)，Vimentin、α-SMA及Collagen I表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組比較，SenA低、高劑量及陽性對照組大鼠腎組織中E-cadherin水平明顯升高，其中SenA高劑量及陽性對照組效果最優(yōu)（P＜0.01）；與模型組比較，SenA低、高劑量及陽性組大鼠腎組織中Vimentin水平明顯下降，其中陽性對照組效果最優(yōu)（P＜0.01）；與模型組比較，SenA低、高劑量及陽性對照組大鼠腎組織中α-SMA水平明顯下調(diào)，其中SenA高劑量組效果最優(yōu)（P＜ 0.01）；與模型組比較，SenA低、高劑量及陽性對照組大鼠腎組織中Collagen I水平明顯下調(diào)，其中SenA高劑量及陽性對照組效果最優(yōu)（P＜ 0.01）。見表3，圖3。

表3 各組大鼠腎組織中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化

圖3 各組大鼠腎組織中EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.5 各組大鼠腎臟中α-SMA陽性染色水平的比較 模型組大鼠腎組織α-SMA陽性率高于假手術(shù)大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型大鼠比較，SenA低、SenA高劑量及陽性對照組大鼠腎組織α-SMA陽性率明顯降低，其中SenA高劑量及陽性對照組效果最為明顯（P＜0.01）。見表4、圖4。

表4 各組大鼠腎臟中α-SMA陽性率比較

圖4 各組大鼠腎組織免疫組化染色

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是慢性腎臟病發(fā)展至終末期腎功能衰竭的病理基礎(chǔ)，其病理進(jìn)程主要表現(xiàn)為腎小管萎縮、管周毛細(xì)血管喪失、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)沉積等[11]。通常RIF是由各類細(xì)胞因子及信號通路共同參與調(diào)控的病理過程，目前其發(fā)病機(jī)制尚未明確，臨床上尚無有效的干預(yù)手段治療RIF[12]。中醫(yī)認(rèn)為，腎纖維化屬“關(guān)格”“水腫”“虛勞”“腰痛”“癃閉”等范疇，本虛標(biāo)實(shí)為其病機(jī)，主要以脾腎氣虛、腎陽衰敗為本，濕濁、瘀毒為標(biāo)，臨床常用行氣解郁、活血化瘀的川芎進(jìn)行組方對RIF進(jìn)行治療[13]。SenA是川芎中的重要成分，研究顯示其具有良好的抗氧化、抗炎、抗血小板聚集及舒張血管等作用[9]，與此同時UUO作為經(jīng)典的RIF動物造模方式，廣泛被應(yīng)用在RIF的實(shí)驗(yàn)研究[14]。本研究通過UUO手術(shù)建立RIF模型，用以探討SenA是否參與了川芎抗RIF的干預(yù)過程。病理形態(tài)考察顯示，SenA可有效緩解UUO模型大鼠的腎間質(zhì)纖維化病變。而BUN、Scr通常作為評估藥物對UUO模型大鼠腎損傷的金指標(biāo)[15]，結(jié)果顯示，SenA可明顯降低RIF大鼠血清中BUN、Scr含量，提示其具有良好的改善腎損傷作用。初步揭示了SenA逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化、改善腎損傷，繼而發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用。

近年來，隨著器官纖維化研究的逐漸深入，EMT機(jī)制受到日益關(guān)注，EMT進(jìn)程在腎間質(zhì)纖維化病變中扮演著關(guān)鍵角色[16]。通常EMT發(fā)生后可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)上皮表型特征標(biāo)志物（E-cadherin）的合成減少，繼而使其極性降低、黏附性減弱等；細(xì)胞內(nèi)間充質(zhì)表型特征標(biāo)志物（Vimentin、α-SMA）的合成增加、Collagen I的分泌亦隨之上調(diào)[17]。研究表明，Vimentin、α-SMA作為重要的細(xì)胞骨架蛋白，分別為腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化時的中間產(chǎn)物，以及平滑肌細(xì)胞的標(biāo)志物，而Collagen I通常為UUO誘導(dǎo)沉積于腎臟間質(zhì)及血管周圍的主要膠原，由腎間質(zhì)中肌成纖維細(xì)胞分泌[18]。因此通過檢測上述標(biāo)志蛋白的表達(dá)情況，可間接揭示腎間質(zhì)纖維化程度。本研究發(fā)現(xiàn)，SenA可有效抑制間充質(zhì)表型特征標(biāo)志物（Vimentin、α-SMA）的合成，促進(jìn)上皮表型特征標(biāo)志物（E-cadherin）的合成，同時還可降低腎組織中基質(zhì)成分Collagen I的分泌。表明SenA對腎臟的保護(hù)作用可能通過逆轉(zhuǎn)腎小管上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程而產(chǎn)生。Wnt/β-catenin信號通路是腎間質(zhì)纖維化EMT進(jìn)程的重要途徑[19]。當(dāng)Wnt4異常過表達(dá)時，可促進(jìn)GSK-3β磷酸化，而p-GSK-3β不可激活β-catenin，因此β-catenin無法及時降解。細(xì)胞質(zhì)中積累的β-catenin可通過調(diào)控核轉(zhuǎn)錄促進(jìn)Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)下游致纖維效應(yīng)靶基因的過表達(dá)，促進(jìn)UUO大鼠腎臟中EMT進(jìn)程與ECM積累[20]，因此通過抑制Wnt4/β-catenin信號傳導(dǎo)可逆轉(zhuǎn)RIF的發(fā)生、發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，SenA可有效下調(diào)腎組織中Wnt4、p-GSK-3β及β-catenin的表達(dá)水平，提示SenA可能通過抑制Wnt4/β-catenin信號傳導(dǎo)逆轉(zhuǎn)RIF大鼠腎小管上皮細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)化，繼而防止腎間質(zhì)纖維化，并改善腎臟損傷。

綜上所述，SenA可明顯改善RIF大鼠腎損傷及腎間質(zhì)纖維化等病理進(jìn)程，有效防止慢性腎臟病發(fā)展至終末期腎功能衰竭。而SenA對腎臟的具體保護(hù)機(jī)制可能與通過介導(dǎo)腎間質(zhì)上皮細(xì)胞中Wnt4/β-catenin信號傳導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞EMT進(jìn)程有關(guān)。本研究揭示了SenA對UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的改善能力，并同時闡釋了其相關(guān)的潛在機(jī)制，為臨床慢性腎損傷患者的治療提供了新的藥物研發(fā)方向，同時為中藥川芎的臨床腎病治療作用增添了可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。