發(fā)酵法制取藍(lán)莓果渣可溶性膳食纖維工藝優(yōu)化及其特性分析

杜斌，馮軍，李苗苗，周笑犁，孫情，孟令帥

（貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽550005）

藍(lán)莓（blueberry），又稱越橘，杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium L.）植物，其果實(shí)富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，有著“水果皇后”的美譽(yù)[1-2]。同時，藍(lán)莓果實(shí)中富含具有抗氧化、抗癌和抗炎作用的多酚類化合物和多糖類物質(zhì)，因此有著極強(qiáng)的藥用價值及營養(yǎng)保健功能[3-5]，被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。近年來，藍(lán)莓種植面積在貴州省逐年擴(kuò)大，黔東南州已成為西南地區(qū)乃至全國的重要藍(lán)莓種植基地，其藍(lán)莓深加工產(chǎn)業(yè)也隨之發(fā)展迅速，而藍(lán)莓皮渣作為加工后的的副產(chǎn)物也隨之増加。研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓果渣中依然含有大量的營養(yǎng)成分，如花青素，有機(jī)酸，膳食纖維等[6]。而目前對于藍(lán)莓皮渣通常以廢棄物的形式丟棄，這樣不但會形成巨大的環(huán)境壓力，同時也造成了資源的巨大浪費(fèi)。因此，對于藍(lán)莓皮渣進(jìn)行的有效處理，成為提高藍(lán)莓綜合利用價值必然的發(fā)展趨勢。

膳食纖維（dietary fiber，DF）是既不能被胃腸道消化吸收，也不能產(chǎn)生能量的多糖類物質(zhì)的總和。因其重要的生理作用被營養(yǎng)學(xué)界補(bǔ)充認(rèn)定為第七類營養(yǎng)素。研究發(fā)現(xiàn)膳食纖維具有防止排泄系統(tǒng)疾病、預(yù)防肥胖癥、降血壓、改善腸道菌群等功能，而這些功能又都與可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）有很大的關(guān)系[7-10]。目前，化學(xué)法是提取膳食纖維最為常見的方法，雖然其具有制備成本較低等優(yōu)點(diǎn)，但在處理過程中帶入大量陰陽離子，制取的膳食纖維含量較低，色澤差，給膳食纖維的進(jìn)一步利用帶來不利影響。本研究以藍(lán)莓藍(lán)莓果渣為原料，以乳酸菌為發(fā)酵菌種，采用微生物發(fā)酵法制備藍(lán)莓果渣可溶性膳食纖維，為藍(lán)莓果渣資源的高值轉(zhuǎn)化利用，延伸藍(lán)莓加工產(chǎn)業(yè)鏈，提供一個新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓果渣：貴州麻江藍(lán)莓經(jīng)榨汁等加工后的副產(chǎn)物，由貴陽學(xué)院貴州省高校功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-20 ℃冷凍保存；植物乳桿菌-YRA7：分離自侗族傳統(tǒng)酸肉[11]，貴陽學(xué)院貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室保存；嗜酸桿菌：中科院微生物研究所菌種保藏中心；MRS 培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AUW120D 電子分析天平：日本島津公司；TGL-16C 高速臺式離心機(jī)：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；SHA-B 數(shù)顯水浴恒溫振蕩器：常州澳華恩斯儀器有限公司；LDZX-30KBS 高壓滅菌鍋：上海申安有限公司；SPX-250B-Z 生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-1G 超凈工作臺：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司

1.3 工藝流程

藍(lán)莓果渣→調(diào)配→滅菌→接種→發(fā)酵→滅活→離心取上清液→醇析→抽濾→干燥→SDF

200 mL 錐形瓶中加入20 g 藍(lán)莓果渣，按一定料液比加入蒸餾水，并分別加入2%的脫脂奶粉和白砂糖，混合均勻后滅菌；冷卻至室溫25 ℃后，按一定的接種量接入發(fā)酵菌種，在一定溫度下發(fā)酵一定時間后取出，5 000 r/min 離心15 min，收集上清液；向上清液中加3 倍體積的95 %乙醇，抽濾分離SDF，干燥至衡中后稱重并記錄，所得產(chǎn)物為藍(lán)莓果渣SDF。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 發(fā)酵菌種的培養(yǎng)

取植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌（1 ∶1 混合菌種）接入MRS 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng) 24 h～48 h，采用平板計數(shù)法計數(shù)，調(diào)整細(xì)菌數(shù)含量在107CFU/mL～108CFU/mL。

1.4.2 單因素試驗(yàn)

1.4.2.1 料液比對藍(lán)莓果渣SDF 得率的影響

稱取20 g 藍(lán)莓果渣置于250 mL 錐形瓶內(nèi)，按料液比 1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5、1 ∶6、1 ∶7（g/mL），pH 值為 6.0，接種量10%，37 ℃發(fā)酵36 h，測定SDF 含量。

1.4.2.2 發(fā)酵時間對藍(lán)莓果渣SDF 得率的影響

稱取20 g 藍(lán)莓果渣置于250 mL 錐形瓶內(nèi)，按料液比 1 ∶5（g/mL）pH 值為 6.0，接種量 10%，37 ℃分別培養(yǎng) 24、36、48、60、72 h，測定 SDF 含量。

1.4.2.3 發(fā)酵溫度對藍(lán)莓果渣SDF 得率的影響

稱取20 g 藍(lán)莓果渣置于250 mL 錐形瓶內(nèi)，按料液比 1 ∶5（g/mL），pH 值為 6.0，接種量 10%，分別調(diào)整溫度為 28、31、34、37、40、43 ℃發(fā)酵 36 h，測定 SDF含量。

1.4.2.4 pH 值對藍(lán)莓果渣SDF 得率的影響

稱取20 g 藍(lán)莓果渣置于250 mL 錐形瓶內(nèi)，按料液比 1 ∶5（g/mL），接種量 10%，分別調(diào)整 pH 值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，37 ℃發(fā)酵 36 h，測定 SDF 含量。

1.4.2.5 pH 值對藍(lán)莓果渣SDF 得率的影響

稱取20 g 藍(lán)莓果渣置于250 mL 錐形瓶內(nèi)，按料液比 1 ∶5（g/mL），pH 值為 6.0，分別按接種量 6%、8%、10%、12%、14%接入發(fā)酵菌種，37 ℃發(fā)酵36 h，測定SDF 含量。

1.4.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，每個因素選取3 個對SDF 得率影響較大的水平，以SDF 得率為指標(biāo)，選取五因素三水平的L18（35）正交試驗(yàn)進(jìn)行工藝條件優(yōu)化，因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.4.4 藍(lán)莓果渣SDF 持水力和膨脹力分析

1.4.4.1 持水力分析

參照周笑犁等的方法進(jìn)行[12]，準(zhǔn)確稱量質(zhì)量為1.00 g（m1）的 SDF 樣品，并將其加入 20 ℃的去離子水中1 h。將其倒入濾紙漏斗上過濾，待水滴干后，然后轉(zhuǎn)移至質(zhì)量為m2的表面皿，準(zhǔn)確稱其質(zhì)量（m3）。

1.4.4.2 溶脹性分析

稱取質(zhì)量為1.000 0 g（m）的SDF 樣品，將其置于20 mL 量筒中，測量體積（v1），準(zhǔn)確吸取 10 mL 蒸餾水于量筒中，均勻搖動，在室溫25 ℃下靜置24 h 后，讀取 SDF 膨脹后的體積（v2）。

1.4.5 藍(lán)莓果渣SDF 吸附性能分析

1.4.5.1 藍(lán)莓果渣SDF 對油脂的吸附作用

參照Sangnark 等[13]的方法進(jìn)行。分別取1.00 g（W1）SDF 于離心管中，各自加入食用花生油（不飽和脂肪）或豬油（飽和脂肪），室溫25 ℃靜置1 h，用尼龍網(wǎng)（重量為W2）過濾收集沉淀，稱取濕重W3。

1.4.5.2 藍(lán)莓果渣SDF 對葡萄糖的吸附作用

稱取1.00 g 樣品于50 m L 的離心管中，加入20 mL的 50 mmol/L 的葡萄糖溶液，室溫25 ℃靜置2 h，6 000 r/min 離心20 min，采用DNS 法測定上清液中葡萄糖的濃度，根據(jù)反應(yīng)前后的濃度差別計算藍(lán)莓果渣SDF 對葡萄糖的吸附量[14-15]。

1.4.5.3 藍(lán)莓果渣SDF 對亞硝酸鹽的吸附作用

在250 mL 錐形瓶中，加入50 mL 100 μmol/L NO2-溶液和一定量的膳食纖維，調(diào)整pH 值為7.0，于室溫下振蕩2 h 后，取1 mL 樣液按鹽酸萘乙二胺方法測定其中NO2-含量，計算吸附后溶液中殘余NO2-吸附量[14-15]。

NO2-吸附量=（吸附前 NO2-含量- 吸附后 NO2-含量）/膳食纖維質(zhì)量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，以p＜0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對藍(lán)莓果渣SDF得率的影響

在微生物發(fā)酵過程中，料液比過低而導(dǎo)致菌種和原料接觸不充分，使發(fā)酵不徹底，而過高則不利于乳酸菌菌體產(chǎn)酶代謝[14，16]。料液比對可溶性膳食纖維產(chǎn)率的影響見圖1。

圖1 料液比對可溶性膳食纖維產(chǎn)率的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on the SDF yield

由圖1 可知，隨著溶劑體積的增大，藍(lán)莓果渣SDF的得率也隨之增加，當(dāng)液料比為 1 ∶5（g/mL）時，SDF得率顯著增加，明顯高于其他各組（p＜0.05）。因此，確定最佳料液比為 1 ∶5（g/mL）。

2.2 發(fā)酵時間對藍(lán)莓果渣SDF得率的影響

發(fā)酵時間對可溶性膳食纖維產(chǎn)率的影響見圖2。

圖2 發(fā)酵時間對可溶性膳食纖維產(chǎn)率的影響Fig.2 Effects of fermentation time on the SDF yield

如圖2 所示，藍(lán)莓果渣SDF 得率隨著發(fā)酵時間延長而升高，發(fā)酵到48 h 后，3 個組間SDF 得率均差異不顯著，并且在72 h 出現(xiàn)了小幅下降（p＞0.05）?？赡苁怯捎诎l(fā)酵時間過長，菌種增長致使發(fā)酵產(chǎn)物（如乳酸等）不斷的積累，使發(fā)酵體系pH 值不斷下降，果膠在水中被氫離子水解，同時在酸性環(huán)境下，使菌體產(chǎn)酶效果下降從而導(dǎo)致發(fā)酵能力的下降所致[14，16-17]。因此，確定最佳發(fā)酵時間為48 h。

2.3 發(fā)酵溫度對藍(lán)莓果渣SDF得率的影響

發(fā)酵溫度對可溶性膳食纖維產(chǎn)率的影響見圖3。

由圖3 可知，隨著發(fā)酵溫度的上升，SDF 得率隨之增加，37 ℃時SDF 得率最高達(dá)12.80%。當(dāng)溫度超過37 ℃時，SDF 得率開始顯著下降（p＜0.05）。這一現(xiàn)象一方面可能是由于溫度升高導(dǎo)致SDF 分子的自身結(jié)構(gòu)遭到破壞[18]，另一方面溫度過高會抑制乳酸菌的生長不利于發(fā)酵的進(jìn)行[14，16]。因此，選擇最佳發(fā)酵溫度為37 ℃。

圖3 發(fā)酵溫度對可溶性膳食纖維產(chǎn)率的影響Fig.3 Effects of fermentation temperature on the SDF yield

2.4 pH值對藍(lán)莓果渣SDF得率的影響

pH 值對可溶性膳食纖維產(chǎn)率的影響見圖4。

圖4 pH 值對可溶性膳食纖維產(chǎn)率的影響Fig.4 Effects of pH on the SDF yield

由圖4 可知，在pH 值為4.0 時，發(fā)酵速度較慢，且SDF 得率較低（p＜0.05）。pH 值為 5.0 和 6.0 是，SDF 得率最高，兩組差異不顯著（p＞0.05），且明顯高于其他各組（p＜0.05）。而當(dāng) pH 值 高于 6.0 時，得率迅速下降（p＜0.05），提示發(fā)酵菌種乳酸菌具有較強(qiáng)的耐酸性，在偏酸的環(huán)境下進(jìn)行發(fā)酵適于它們的生長和代謝，而當(dāng)pH值升高時，抑制了菌體的自身生長，使菌體產(chǎn)酶效果下降從而導(dǎo)致發(fā)酵能力下降。因此，選擇6.0 為最佳發(fā)酵pH 值。

2.5 接種量對藍(lán)莓果渣SDF得率的影響

接種量對可溶性膳食纖維產(chǎn)率的影響見圖5。

如圖5 所示，隨著接種量的增加，藍(lán)莓果渣SDF得率不斷增大，當(dāng)接種量為12%時，SDF 得率最高（p＜0.05）。當(dāng)接種量大于12%時，SDF 得率明顯下降（p＜0.05）。提示，接種量低，菌體生長緩慢，發(fā)酵不徹底。而接種量過高，則導(dǎo)致菌體生長過于旺盛，使培養(yǎng)液營養(yǎng)快速消耗，引發(fā)后續(xù)發(fā)酵動力不足，SDF 得率下降[16]。因此，確定12%接種量較適宜。

圖5 接種量對可溶性膳食纖維產(chǎn)率的影響Fig.5 Effects of inoculation quantity on the SDF yield

2.6 發(fā)酵法制取藍(lán)莓果渣可溶性膳食纖維工藝的優(yōu)化

通過對各個單因素進(jìn)行初步分析后，選取發(fā)酵時間、料液比、接種量、發(fā)酵溫度和pH 值這5 個因素，以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，以藍(lán)莓果渣SDF 得率為指標(biāo)進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析見表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析表Table 2 The orthogonal experiment results analysis table

由表2 極差分析可知，影響藍(lán)莓果渣SDF 得率的各因素主次順序?yàn)锽＞A＞E＞C＞D，即料液比＞接種量＞pH 值＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間。方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments

由表3 方差分析表可以看出，料液比對藍(lán)莓果渣SDF 得率影響顯著。由正交試驗(yàn)結(jié)果分析可得發(fā)酵法制備藍(lán)莓果渣SDF 的最適工藝條件為A2B3C1D2E2，即接種量 12%、料液比 1 ∶6（g/mL）、發(fā)酵溫度 34 ℃、發(fā)酵時間48 h、pH 6.0。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果可得藍(lán)莓果渣SDF 的平均得率可達(dá)到15.92%，可溶性膳食纖維產(chǎn)品呈淡紫色、質(zhì)構(gòu)蓬松、無味。

2.7 藍(lán)莓果渣SDF持水力和膨脹力

作為衡量膳食纖維品質(zhì)的重要指標(biāo)，水力和膨脹力值越大就表明其吸附性能越強(qiáng)，并且較高的持水力有利于防止便秘和結(jié)腸癌的發(fā)生[19-20]。膳食纖維特性分析見表4。

由表4 可知，發(fā)酵法制備的藍(lán)莓果渣可溶性膳食纖維的持水力和膨脹力均高于果渣組（p＜0.05）。同時，吸附能力試驗(yàn)結(jié)果顯示，藍(lán)莓果渣可溶性膳食纖維對油脂、葡萄糖以及亞硝酸鹽的吸附能力均高于原果渣。其中對油脂的吸附能力為（2.35±0.06）（g/g）（不飽和脂肪）和（1.67±0.05）（g/g）（飽和脂肪），均高于鐘希瓊等報道的米糠、甘薯、馬鈴薯和葛根等膳食纖維對油脂的吸附量[21]；對葡萄糖的吸附量為（1.40±0.62）mmol/g，高于豆渣、麥麩及玉米膳食纖維的吸附能力[15]；對亞硝酸鹽的吸附量為（50.39±0.37）μmol/g，優(yōu)于已報道的大豆、魔芋、燕麥以及菠蘿膳食纖維[22-23]。結(jié)果表明，發(fā)酵法制備的藍(lán)莓果渣可溶性膳食纖維是一種優(yōu)質(zhì)的膳食纖維資源。

表4 膳食纖維特性分析Table 4 Character analysis of SDF

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以藍(lán)莓果渣為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)獲得采用乳酸菌發(fā)酵法制備藍(lán)莓果渣可溶性膳食纖維的最佳工藝條件，即菌種的接種量12%、料液比 1 ∶6（g/mL）、發(fā)酵溫度 34 ℃、發(fā)酵時間48 h 以及pH 6.0；此條件下藍(lán)莓果渣可溶性膳食纖維的的率為15.92%，高于非發(fā)酵條件下的可溶性膳食纖維得率[24]，說明采用乳酸菌發(fā)酵可以明顯地提高可溶性膳食纖維的得率，并且發(fā)酵法得到的膳食纖維膨脹力、持水力以及對油脂、葡萄糖以及亞硝酸鹽的吸附能力均比原果渣有所提高，符合高質(zhì)量膳食纖維的要求。本研究方法操作簡單，發(fā)酵時間短，成本低，為推動藍(lán)莓果渣資源的綜合利用提供了新的途徑，也為利用藍(lán)莓果渣膳食纖維開發(fā)保健食品的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。