氧化苦參堿對骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用及對TLR4/NF-κB信號通路的影響

馬成龍,陳建平,李 航,羅 偉,孫倩倩,孫宇睿,馮曉月,蘇 睿

(1山西醫(yī)科大學麻醉教研室,太原 030001;2山西白求恩醫(yī)院,山西醫(yī)學科學院疼痛科;*通訊作者,E-mail:sxcjp2011@163.com)

骨癌是某些原發(fā)于骨組織以外的惡性腫瘤(如乳癌、肺癌、腎癌、直腸癌等)經(jīng)血行轉(zhuǎn)移至骨組織引起的疾病,以骨損害、疼痛為主要臨床表現(xiàn)。骨癌引起的疼痛是癌癥最可怕的后果,極大地降低了患者的生活質(zhì)量[1]。目前藥物干預仍是治療骨癌痛的首選治療方案,阿片類藥物被廣泛應(yīng)用于骨癌痛治療,雖然其鎮(zhèn)痛效果較好,但是持續(xù)治療導致的藥物耐受,以及長期使用產(chǎn)生的嚴重不良反應(yīng)限制了其臨床的應(yīng)用[2]。由于中藥或天然藥物具有毒副作用小、機體不易殘留且鎮(zhèn)痛效果好等優(yōu)點引起了臨床醫(yī)生及科研人員的廣泛關(guān)注,因此尋求一種安全有效易得的天然藥物用于緩解骨癌痛患者的疼痛是目前該領(lǐng)域的研究重點。

氧化苦參堿(oxymatrine,OMT)是從豆科槐屬植物苦參(SophoraflavescensAit)中提取的具有四環(huán)喹嗪啶類結(jié)構(gòu)的生物堿類成分?，F(xiàn)代藥理學研究表明,氧化苦參堿具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗纖維化及抗腫瘤等作用[3]。有研究表明氧化苦參堿可通過減輕炎癥反應(yīng)改善慢性神經(jīng)性疼痛小鼠的坐骨神經(jīng)功能[4]。但是氧化苦參堿對轉(zhuǎn)移性骨腫瘤引起的骨癌痛是否具有抑制作用,目前尚未見報道。Toll樣受體4(TLR4)是機體免疫細胞中大量表達的受體,TLR4可激活其下游靶點NF-κB,誘導NF-κB的磷酸化并促進IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子的釋放,從而導致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。有研究表明,催產(chǎn)素可通過抑制大鼠脊髓中的TLR4和促炎因子來緩解骨癌疼痛[5]。說明TLR4/NF-κB信號通路在骨癌痛發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。因此,本研究構(gòu)建骨癌痛大鼠模型,觀察氧化苦參堿對骨癌痛大鼠模型的鎮(zhèn)痛作用并從TLR4/NF-κB信號通路角度探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

從遼寧長生生物技術(shù)有限公司購進SPF級SD雌性大鼠(體質(zhì)量80-85 g)24只及同周齡同批次的SD雄性大鼠(體質(zhì)量180-220 g)50只,合格證號:SCXK(遼)2010-001。購進的大鼠被飼養(yǎng)在符合SPF級的大鼠獨立送風隔離籠(Individually Ventilated Cages,IVC)中,溫度(22±2)℃,相對濕度(60±5)%,亮 ∶暗循環(huán)比為12 h ∶12 h,每籠4只大鼠,可自由取用飼料和水。所有本研究中使用的實驗方案得到了實驗動物福利倫理委員會的批準。

1.2 主要試劑和儀器

氧化苦參堿購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;鹽酸曲馬多購自北京四環(huán)醫(yī)藥科技股份有限公司;大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司;RPMI Medium 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司;青-鏈霉素(penicillin-strepotomycin,P/S)購自Thermo公司;小鼠抗GFAP、兔抗TLR4、IκB、p-IκB、NF-κB、p-NF-κB及GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;辣根過氧化物酶標記驢抗兔IgG購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司;蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒和SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)購自碧云天生物技術(shù)研究所。大鼠IVC獨立送風隔離籠具(北京佳源興業(yè)科技有限公司);von Frey hairs(上海玉研科學儀器有限公司)；恒溫細胞培養(yǎng)箱和超低溫高速離心機(美國Thermo公司);X光機(Siemens AG Medical Solutions Group);倒置熒光生物顯微鏡(德國Leica公司);電動勻漿器(上海季諾公司);Western blot電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司);全自動酶標儀(南京德鐵公司)。

1.3 Walker256大鼠乳腺癌細胞培養(yǎng)

Walker256大鼠乳腺癌細胞(上海中喬新舟生物有限公司)培養(yǎng)于含有10%FBS、1% P/S的RPMI1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長到90%以上時進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞制成單細胞懸液,計數(shù)并以2×107個/ml的密度保存于凍存管中備用。

1.4 骨癌痛大鼠模型的制備、分組及給藥

參照文獻[6]所述方法建立大鼠骨癌痛模型。取1.3中1 ml Walker256細胞,注射到體質(zhì)量為80-85 g的SD雌性大鼠腹腔中,注射后放回鼠籠中培養(yǎng)。7-9 d后觀察到SD雌鼠腹部明顯腫大,脫頸處死大鼠并抽取腹水于5 ml離心管中,以1 000 r/min離心5 min,棄去上清液,沉淀物用RPMI 1640培養(yǎng)基清洗3次,重新計數(shù)并調(diào)整細胞密度至1×108個/ml,置于冰盒內(nèi)備用。將50只SD雄性大鼠腹腔注射4%水合氯醛(0.7 ml/kg)麻醉后,左側(cè)膝關(guān)節(jié)部位去毛,暴露脛骨骨面,用牙科鉆頭在膝關(guān)節(jié)髕韌帶內(nèi)側(cè)緣沿脛骨縱軸往脛骨遠端鉆孔,用微量移液器抽取腫瘤細胞20 μl,緩緩注射于鉆孔中,另取10只注射20 μl無菌生理鹽水作為假手術(shù)對照組(sham)。注射完成后固定15-20 s,然后緩慢拔出,最后用醫(yī)用骨蠟封好鉆孔。使用酒精棉球消毒并擦去溢出的Walker256細胞液,逐層縫合,并肌注青霉素鈉防止感染。術(shù)后7 d將Walker256細胞液注射大鼠分為骨癌痛模型組、鹽酸曲馬多陽性藥組(Tramadol,腹腔注射10 μg/kg,連續(xù)7 d)、氧化苦參堿低、高劑量組(腹腔注射50,100 mg/kg,連續(xù)7 d),每組10只。

1.5 X攝片觀測各組大鼠脛骨病理學改變

術(shù)后第7天取假手術(shù)組和模型組大鼠4%水合氯醛麻醉后以仰臥位固定,用X光機拍攝每只大鼠股骨X線片,觀察脛骨病理學改變確認模型構(gòu)建成功。

1.6 機械性縮足反射閾值的測定

將各組大鼠置于透明的金屬網(wǎng)格籠中,測定前使之適應(yīng)15-30 min,直至探覓行為停止后開始測量。機械痛閾的行為學測定指標為100%爪縮閾值(paw withdrawal threshold,PWT),采用Up and Down法對各組大鼠術(shù)前1 d及術(shù)后7,9,11,14 d的機械縮足反射閾值進行測定,測試工具為纖毛機械刺激針(von Frey hairs)。Up and Down法操作方法為測定力度先從2 g開始,當該力度的刺激不能引起大鼠縮足反應(yīng)時,則給予相鄰大一級力度的刺激;若出現(xiàn)縮足反應(yīng)則給予相鄰小一級力度的刺激,如此連續(xù)進行,直至出現(xiàn)第一次陽性和陰性反應(yīng)的騎跨,再連續(xù)測定4次取平均值。最大力度為15 g,大于此值時記為15 g。每次刺激間隔30 s。

1.7 組織取材與處理

行為學測定后處死各組大鼠,冰上快速取每只大鼠左側(cè)L4-6背根神經(jīng)節(jié)(DRG)標本。將每組一半的DRG標本保存于4%多聚甲醛中室溫固定過夜,進行免疫熒光染色。另一半大鼠DRG組織快速放入液氮后,提取各組大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)DRG組織的總RNA和蛋白。

1.8 免疫熒光檢測各組大鼠DRG中星形膠質(zhì)細胞的活化

將放入4%多聚甲醛中固定過夜的DRG組織包埋在組織包埋盒中置于-80 ℃冰箱中凍實,后置于-20 ℃冰凍切片機中做連續(xù)冠狀切片,片厚5 μm,隔10取1用于免疫熒光染色。4%多聚甲醛固定30 min,1%PBS洗滌3次,每次5 min;0.5% Triton X-100透化30 min,1×PBS洗滌3次,每次5 min;滴加適量5% BSA溶液封閉30 min;滴加小鼠抗GFAP一抗稀釋液(1 ∶300比例稀釋),4 ℃孵育過夜;1×PBS洗滌3次,每次5 min;滴加Cy3熒光標記的山羊抗小鼠二抗稀釋液(1 ∶500)室溫避光孵育1 h,1×PBS洗滌3次,每次5 min;加入DAPI染色液(1 ∶500)避光反應(yīng)10 min,1×PBS洗滌3次,每次5 min;加適量抗熒光淬滅劑封片,倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 ELISA法檢測各組大鼠DRG中TNF-α、IL-1β和IL-6水平

稱取各組大鼠DRG組織0.02 mg,用9倍體積(0.18 ml)的生理鹽水用電動勻漿器勻漿成勻漿液,并置于1.5 ml離心管收集起來。采用ELISA試劑盒檢測各組大鼠DRG勻漿液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。

1.10 Western blot法檢測各組大鼠DRG中TLR4/NF-κB信號通路中TLR4、IκB、p-IκB、NF-κB、p-NF-κB蛋白的表達

各組大鼠DRG中加入蛋白裂解液和終濃度為1 mmol/L的PMSF并置于電動勻漿器中勻漿,在冰上裂解30 min。隨后將液體轉(zhuǎn)移至新的1.5 ml離心管中,4 ℃條件下離心,吸取上清,BCA試劑盒進行蛋白定量檢測。以最低濃度為標準,加入一定量裂解液將各組蛋白調(diào)整至等濃度后,用等體積的蛋白上樣緩沖液稀釋,SDS-PAGE電泳分離。320 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入稀釋比例均為1 ∶1 000的TLR4、IκB、p-IκB、NF-κB、p-NF-κB及GAPDH一抗稀釋液于4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次后,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗置搖床上室溫孵育1 h,采用ECL發(fā)光后膠片暗室曝光顯影。用Image J軟件對圖像進行分析,結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH的光密度比值表示。

1.11 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠脛骨的X線影像比較

假手術(shù)組骨組織影響表現(xiàn)正常,骨質(zhì)密度均勻,骨皮質(zhì)連續(xù),無缺失現(xiàn)象;而模型組大鼠的脛骨可見骨結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的改變和破壞,骨質(zhì)密度明顯不均勻,并伴有缺失現(xiàn)象,骨皮質(zhì)缺損,周圍組織明顯腫脹(見圖1)。說明骨癌痛大鼠模型成功建立,為后期藥效學研究奠定基礎(chǔ)。

2.2 OMT改善骨癌痛大鼠的機械痛行為

對于同一時間點不同組間來說,各組大鼠在術(shù)前1 d的機械痛閾值比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見表1),說明實驗大鼠的均一性較好;術(shù)后7 d,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠機械縮足反射閾值明顯降低,說明骨癌痛大鼠出現(xiàn)機械痛敏。而給予7 d低高劑量OMT和鹽酸曲馬多治療后的大鼠與模型組大鼠比較,機械縮足反射閾值隨著治療時間的延長而升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01或P<0.05),且呈劑量依賴性。而對于同組間不同時間點來說,假手術(shù)組不同時間點之間差異無統(tǒng)計學意義;與術(shù)前1 d相比,模型組和各給藥組其余時間點機械縮足反射閾值明顯降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與術(shù)后7 d相比,模型組剩余其他時間點的機械縮足反射閾值無顯著性差異,說明模型的穩(wěn)定,而各給藥組在術(shù)后11 d和14 d的機械縮足反射閾值明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

圖1 骨癌痛模型組和假手術(shù)組大鼠脛骨X線影像對比

表1 每組大鼠機械縮足反射閾值的比較 (g,n=10)

Table 1 Comparison of pawmechanicalwithdrawal threshold of rats among five groups (g,n=10)

組別 術(shù)前1d術(shù)后7d術(shù)后9d術(shù)后11d術(shù)后14d 假手術(shù)組14.50±1.5813.30±2.7913.80±2.5714.00±2.1113.10±3.11 模型組14.00±2.113.67±1.57##a3.22±1.83##a2.96±1.34##a2.90±1.69##a 50mg/kgOMT組13.80±2.573.62±1.73a4.20±1.48a4.74±1.80?a5.40±1.35??a 100mg/kgOMT組14.30±2.213.36±1.85a5.14±2.05?a6.00±1.89??ab6.40±2.07??ab Tramadol組13.60±2.953.42±1.52a5.40±1.35?a6.60±1.65??ab7.00±1.41??ab

與假手術(shù)組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與術(shù)前1 d比較,aP<0.01;與術(shù)后7 d比較,bP<0.01

2.3 OMT對骨癌痛大鼠DRG處星形膠質(zhì)細胞活化的影響

模型組DRG處星形膠質(zhì)細胞百分比較假手術(shù)組相比顯著升高(28.17%±3.06%vs3.19%±1.71%,P<0.01,見圖2);而50 mg/kg OMT組和Tramadol組大鼠的DRG處星形膠質(zhì)細胞數(shù)目百分比明顯降低至19.65%±2.55%,15.49%±1.58%和13.68%±2.62%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.4 OMT對骨癌痛大鼠DRG中炎癥因子釋放的影響

與假手術(shù)組相比,模型組IL-1β、IL-6和TNF-α濃度明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與模型組相比,OMT不同劑量組及鹽酸曲馬多組DRG組織中IL-1β、IL-6和TNF-α釋放量顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見表2)。

GFAP(紅色)染色星形膠質(zhì)細胞,DAPI(藍色)染色細胞核

A.各組大鼠DRG處星形膠質(zhì)細胞活化情況 (bar=25 μm) B.定量分析各組大鼠DRG處GFAP陽性細胞占所有細胞的百分比 (n=5)

圖2 比較各組大鼠DRG處星形膠質(zhì)細胞的活化情況

Figure 2 Comparison of activation of astrocyte in DRG in rats among five groups

表2 各組大鼠中相關(guān)炎癥因子的表達 (ng/L,n=5)

Table 2 Comparison of related inflammatory factors in rats among five groups (ng/L,n=5)

組別 IL-1βIL-6TNF-α 假手術(shù)組62.51±10.29295.39±38.68 505.66±99.31模型組241.05±39.91##879.27±98.00##1997.53±79.45##50mg/kgOMT179.15±15.51??710.35±50.89?1501.93±102.36??100mg/kgOMT146.94±18.23??609.45±52.50??1286.53±171.02??Tramadol137.11±28.57??580.91±86.54??1025.67±133.19??

與假手術(shù)組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.5 OMT對骨癌痛大鼠脊髓中TLR-4/NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

與假手術(shù)組相比,模型組TLR-4、p-IκB和p-NF-κB蛋白表達量明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與模型組相比,不同劑量OMT組和鹽酸曲馬組TLR-4、p-IκB和p-NF-κB表達均能降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01),而各組DRG內(nèi)IκB和NF-κB蛋白表達量無明顯變化(P>0.05,見圖3)。

3 討論

腫瘤骨轉(zhuǎn)移引起的骨癌痛是臨床常見的慢性疾病,發(fā)病機制復雜,且無有效治愈藥物。脊髓背根神經(jīng)節(jié)(DRG)是痛覺的初級傳入神經(jīng)元,在疼痛傳導及發(fā)生過程中具有重要作用。因此,DRG始終是疼痛機制和疼痛治療研究中的重點對象[7]。有研究表明,DRG的致敏作用能夠促進腫瘤誘導痛覺過敏和產(chǎn)生疼痛,并且以DRG為靶點進行治療緩解疼痛的效果良好[8]。因此,本研究通過左后肢脛骨注射walker256乳腺癌細胞懸液的方法制備大鼠骨癌痛模型,旨在探討氧化苦參堿對骨癌痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用及其作用機制。揭示了氧化苦參堿可通過調(diào)節(jié)大鼠DRG內(nèi)炎癥免疫反應(yīng),抑制TLR-4/NF-κB信號通路發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。

在骨組織中生長的腫瘤細胞刺激破骨細胞導致骨破壞和骨膜牽拉,引起局部缺血和周圍神經(jīng)受壓,并誘導膠質(zhì)細胞活化。有研究發(fā)現(xiàn)在骨癌痛大鼠模型中,脊髓、DRG和癌旁處星形膠質(zhì)細胞大量活化增生,能夠釋放包括IL-1β、IL-6和TNF-α等在內(nèi)的各種促炎因子[9]。IL-1β、IL-6和TNF-α是產(chǎn)生持續(xù)性疼痛的重要介質(zhì),具有改變細胞膜通透性,促進Na+內(nèi)流,降低興奮性閾值,從而產(chǎn)生疼痛[10]。此外,膠質(zhì)細胞激活后除參與炎癥反應(yīng)外,還與嗎啡耐受形成有關(guān)。Pan等[11]報道稱鞘內(nèi)注射Nav1.7 shRNA慢病毒載體可抑制DRG內(nèi)星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的活化,從而改善疼痛,并且在嗎啡耐受型骨癌疼痛模型大鼠中也具有相同的效果。本研究結(jié)果也證實,氧化苦參堿顯著降低了DRG處星形膠質(zhì)細胞數(shù)目百分比,抑制星形膠質(zhì)細胞活化;同時,氧化苦參堿還降低了DRG內(nèi)促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平,提示氧化苦參堿的鎮(zhèn)痛作用與調(diào)控大鼠DRG內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。

TLR4是首先被報道的人類Toll樣受體,是炎癥信號傳遞過程中的“門戶蛋白”,在免疫炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的膠質(zhì)細胞內(nèi)大量表達[12]。有研究表明,特異性阻斷TLR4可顯著提高骨癌痛大鼠的機械縮足反射閾值,起到鎮(zhèn)痛作用[13]。NF-κB是普遍存在于細胞質(zhì)中的一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,位于TLR4下游信號通路的樞紐位置,可調(diào)控TNF-α、NO等多種疼痛相關(guān)因子的表達[14]。NF-κB通常以p50/p65二聚體形式存在于細胞內(nèi)。生理狀態(tài)下,NF-κB蛋白p50/p65二聚體在胞漿中與抑制蛋白κB(inhibitor kappa B, IκB)結(jié)合,使其不能進入細胞核內(nèi),處于非活化狀態(tài)。而當細胞受到外界炎癥刺激后(比如LPS、IL家族成員等),使IκB的激酶IKK被激活,使IκB被磷酸化,磷酸化的IκB會發(fā)生泛素化并快速降解,導致NF-κB蛋白被釋放,并進入細胞核內(nèi)發(fā)揮生物活性,并與靶基因結(jié)合,誘導靶基因轉(zhuǎn)錄,促進靶蛋白合成,從而發(fā)揮生物效應(yīng)[15,16]。TLR-4/NF-κB信號通路被激活后,可調(diào)控IL-1β、IL-6和TNF-α等多種炎癥因子的表達,并且IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子也對TLR-4/NF-κB信號通路有激活的反饋調(diào)節(jié)作用,從而形成反饋環(huán)路,共同參與骨癌痛的病理進程[17]。Tian等[18]證實沙利度胺可通過抑制骨癌痛大鼠中樞系統(tǒng)內(nèi)星形膠質(zhì)細胞活化及NF-κB活性,起到減輕疼痛的目的。Song等[19]報道了米諾環(huán)素可通過抑制大鼠中樞系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的NF-κB活性來減輕大鼠骨癌痛。為了證明氧化苦參堿抑制免疫炎癥反應(yīng),減輕疼痛與TLR-4/NF-κB信號通路的相關(guān)性,我們利用Western blot檢測了大鼠DRG內(nèi)TLR4、IκB、p-IκB、NF-κB和p-NF-κB蛋白表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)給予氧化苦參堿治療后骨癌痛大鼠DRG內(nèi)TLR4、p-IκB和p-NF-κB蛋白表達量顯著降低,說明氧化苦參堿調(diào)控大鼠DRG內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)、緩解骨轉(zhuǎn)移誘導的疼痛與抑制TLR-4/NF-κB信號通路活性有關(guān)。

綜上所述,本研究證明了氧化苦參堿可提高骨癌痛大鼠的機械痛閾值,抑制DRG處星形膠質(zhì)細胞活化及促炎因子釋放;并且證明了其上述作用與抑制TLR-4/NF-κB信號通路活性有關(guān),但是其具體分子生物學機制,尚需進一步研究。