TPM4在胃癌細(xì)胞中的表達及其對胃癌細(xì)胞侵襲與遷移能力的影響

鄭文英,陸細(xì)紅,陳嘉樂,鄧 敏*

(1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所,廣州 510030;2廣州市第八人民醫(yī)院;*通訊作者,E-mail:dengmin510095@163.com)

胃癌的轉(zhuǎn)移途徑有直接浸潤、血行轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移與種植轉(zhuǎn)移,其主要以淋巴轉(zhuǎn)移為主,胃癌侵襲轉(zhuǎn)移能力強,它的發(fā)病機制和侵襲轉(zhuǎn)移機制雖然已經(jīng)有很多研究,但還有很多未知值得探索[1,2]。肌球蛋白4(TPM4)是肌動蛋白結(jié)合蛋白家族中的一員,原肌球蛋白可為微絲提供穩(wěn)定性,調(diào)節(jié)其他肌動蛋白結(jié)合蛋白。TPM4在多種癌癥中均有異常表達,被認(rèn)為是卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、角化棘皮瘤和食管鱗癌的潛在檢測標(biāo)志物。根據(jù)蛋白表達譜,TPM4被認(rèn)為是卵巢癌和乳腺癌的一種潛在致癌因子[3]。有研究表明,TPM4在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤、膀胱癌等多種癌癥中都高表達[4],并且TPM4 siRNA能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖,促進肺癌細(xì)胞的凋亡[5]。本研究通過Transwell小室分離法培養(yǎng)SGC7901-invasion細(xì)胞、SGC7901-noninvasion細(xì)胞亞系并測序,旨在觀察胃癌細(xì)胞SGC7901-invasion TPM4的表達水平及敲低TPM4對SGC7901-invasion細(xì)胞侵襲遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

人胃癌細(xì)胞系SGC7901購于美國ATCC細(xì)胞庫。DMEM高糖培基、胰酶及胎牛血清均購于美國Gibcol公司。蛋白酶抑制劑(PMSF)購于美國Sigma-Aldrich公司,蛋白裂解液(RIPA)購于碧云天生物科技有限公司。預(yù)染蛋白質(zhì)標(biāo)記物與轉(zhuǎn)染試劑均購于美國Thermo Fisher Scientific公司。TPM4抗體購于美國Abcam公司。HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG購于美國Cell Signaing Technology公司。ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒購于北京安諾倫生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分離

培養(yǎng)GC7901胃癌細(xì)胞,培養(yǎng)液用含有10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液,Transwell小室培養(yǎng)SGC7901-noninvasion細(xì)胞上層細(xì)胞,下層培養(yǎng)SGC7901-invasion細(xì)胞,放置于37 ℃,飽和濕度,5% CO2培養(yǎng)箱中,當(dāng)細(xì)胞密度長至80%-90%時,PBS洗滌,用0.25%胰酶(含EDTA)消化并進行傳代,重復(fù)10代。

1.3 qRT-PCR檢測相關(guān)RNA的表達水平

總RNA的提取用TRIzol法,在SGC7901-invasion細(xì)胞、SGC7901-noninvasion細(xì)胞生長處于對數(shù)期時加入TRIzol,靜置10 min,將其分別移入無核酶的EP管中,將TRIzol與氯仿按照5 ∶1的比例震蕩混勻,靜置5 min,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,吸取上清至無核酶的EP管中,再加入同等體積的異丙醇,混勻,靜置5 min,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min。去上清,在沉淀中加入75%酒精,4 ℃ 7 500 r/min離心10 min,棄上清,加入適量無核酶水,溶解沉淀,NANO Drop中測濃度,存于-80 ℃冰箱?？俁NA的逆轉(zhuǎn)錄使用Thermo Fisher Scientific逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,共20 μl體系,反應(yīng)體系如下:Oligo(dT)1 μl,5×Reaction Buffer 4 μl,RiboLock RNase Inhibitor(20 U/μl)1 μl,10 mmol/L dNTP Mix 2 μl,RevertAid M-MuLV RT(200 U/μl)1 μl,RNA逆轉(zhuǎn)錄質(zhì)量為3 μg,加水補齊至20 μl,逆轉(zhuǎn)錄程序為42 ℃ 60 min,70 ℃ 5 min。實時qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μl:SYBR Premix Ex TaqTM 10 μl,PCR Forward Primer(10 μmol/L) 1 μl,PCR Reverse Primer(10 μmol/L) 1 μl,cDNA 2 μl,加水補齊至20 μl,每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。反應(yīng)程序為預(yù)變性95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。

1.4 Western blot檢測TPM4蛋白的表達水平

單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取,取對數(shù)生長期的細(xì)胞,先將培養(yǎng)基倒掉,PBS洗3次,用蛋白裂解液(RIPA)+蛋白酶抑制劑(PMSF)冰上裂解30 min,將蛋白刮下,采用BILON-R1500D超聲波信號發(fā)生器,超聲1.5 s,間隔4 s,每個樣品超聲6次,超聲時需將樣品置于冰中。超聲后將樣品4 ℃ 12 000 r/min離心15 min,收取上清,BCA法測定總蛋白濃度。上樣量為30 μg,使用SDS-PAGE凝膠電泳,電泳為80 V,當(dāng)marker分開時改用120 V電泳,當(dāng)溴酚藍指示劑跑至SDS-PAGE凝膠底部1 cm處停止電泳,開始濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜條件為200 mA恒流90 min,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,脫脂牛奶封閉液封閉2 h,在目的條帶處孵育TPM4抗體與β-actin抗體(抗體濃度均為1 ∶1 000),4 ℃過夜。TBST洗膜3次,每次10 min。孵育HRP標(biāo)記的特異性二抗2 h(二抗使用TBST按1 ∶5 000稀釋),TBST洗膜3次,每次10 min,之后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑對X光片顯影,掃描照片。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的SGC7901-invasion細(xì)胞,待細(xì)胞生長至70%-80%時,使用3 μg siCTR質(zhì)?；? μg siTPM4質(zhì)粒分別對SGC7901-invasion細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染,未處理組為對照。轉(zhuǎn)染時為無血清DMEM培基,6-8 h換為10%FBS的DMEM培基。轉(zhuǎn)染進行48 h,使用Western blot法檢測TPM4的水平,以驗證沉默效果。

1.6 Transwell實驗

選擇鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室,將其從-20 ℃拿出,加入無血清的DMEM培基200 μl進行活化,放入37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min。消化SGC7901-invasion-siCTR細(xì)胞與SGC7901-invasion-siTPM4細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,用無血清DMEM培基重懸后用計數(shù)板計數(shù),取5×104個細(xì)胞,Transwell小室中為細(xì)胞與無血清DMEM培基,共200 μl,下室為600 μl的10% FBS的DMEM培基,37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。甲醇固定30 min,結(jié)晶紫染色15 min。清水洗滌后用棉簽擦拭小室內(nèi)部,晾干后用倒置顯微鏡拍照。

1.7 劃痕實驗

取生長對數(shù)期的SGC7901-invasion-siCTR細(xì)胞與SGC7901-invasion-siTPM4,待細(xì)胞長至90%后用10 μl規(guī)格的槍頭劃痕,0,24,48 h用倒置顯微鏡拍照。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用軟件GraphPad Prism 6.0進行統(tǒng)計學(xué)分析,結(jié)果均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差,兩組間比較用獨立樣本t檢驗,多組間比較使用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TPM4在SGC7901-invasion細(xì)胞中的表達高于SGC7901-noninvasion細(xì)胞

Western blot及qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,TPM4在SGC7901-invasion細(xì)胞中的表達高于SGC7901-noninvasion細(xì)胞(見圖1)。qRT-PCR的結(jié)果顯示,TPM4在SGC7901-noninvasion細(xì)胞的表達為1,在SGC7901-invasion細(xì)胞中為3.16±0.33,與SGC7901-noninvasion細(xì)胞比較,TPM4表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000 3),表明TPM4在SGC7901-invasion細(xì)胞表達量遠(yuǎn)高于SGC7901-noninvasion細(xì)胞。

2.2 轉(zhuǎn)染TPM4-siRNA沉默TPM4的表達

使用siRNA沉默TPM4后,48 h后收取總蛋白,Western blot法檢測TPM4的表達水平,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染TPM4-siRNA于SGC7901-invasion細(xì)胞,TPM4的表達量大大降低(見圖2)。

2.3 TPM4促進SGC7901-invasion細(xì)胞的侵襲

使用siRNA在SGC7901-invasion細(xì)胞中沉默TPM4,Transwell基質(zhì)膠侵襲實驗檢測TPM4對SGC7901-invasion細(xì)胞侵襲能力的影響,結(jié)果見圖3。SGC7901-invasion-siTPM4組與SGC7901-invasion-siCTR組比較,細(xì)胞侵襲能力顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009),表明沉默TPM4對SGC7901-invasion細(xì)胞的侵襲能力具有抑制作用。

圖1 Western blot及qRT-PCR檢測TPM4的表達

圖2 Western blot檢測沉默TPM4后的表達

2.4 TPM4促進SGC7901-invasion細(xì)胞的遷移

使用siRNA在SGC7901-invasion細(xì)胞沉默TPM4,檢測對遷移能力的影響,結(jié)果見圖4。SGC7901-invasion-siTPM4和SGC7901-invasion-siCTR細(xì)胞24 h遷移率為0.343 3±0.050和0.693 3±0.032,兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.004 2),表明沉默TPM4對SGC7901-invasion細(xì)胞的遷移能力具有抑制作用。

圖3 沉默TPM4后對SGC7901-invasion細(xì)胞侵襲的影響

圖4 沉默TPM4后對SGC7901-invasion細(xì)胞遷移的影響

3 討論

胃癌仍然是全世界最常見的腫瘤之一,發(fā)病率在腫瘤中排名高居第五,死亡率為第三[6,7]。盡管早期胃癌治療可通過手術(shù)治療且預(yù)后良好,但是進展期胃癌易復(fù)發(fā),容易因為復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥等因素而預(yù)后不好[8]。近年來雖然對胃癌的致癌因子、腫瘤抑制因子有了大致的研究,但對于胃癌的發(fā)生發(fā)展機制尚未明確[9]。本實驗室對胃癌細(xì)胞SGC7901采用Transwell小室分離法培養(yǎng)出SGC7901-noninvasion細(xì)胞與SGC7901-invasion細(xì)胞,提取RNA測序發(fā)現(xiàn)TPM4在SGC7901-invasion細(xì)胞中高表達。原肌球蛋白(TPM)是細(xì)肌絲中與肌動蛋白的結(jié)合蛋白,每條TPM4都是由首尾相連而連接形成的一條連續(xù)不間斷的鏈同肌動蛋白在細(xì)肌絲結(jié)合。原肌球蛋白在肌肉運動中起著肌肉收縮的作用,發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,在真核細(xì)胞中以異構(gòu)體的形式存在。哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4種TPM,即TPM1、TPM2、TPM3、TPM4。目前對TPM1、TPM2、TPM3的研究已經(jīng)有很多,例如在膀胱移行細(xì)胞癌中,TPM1在腫瘤組織中的表達明顯降低,有可能成為早期診斷膀胱癌的一個新標(biāo)志物[10];在乳腺癌中,與正常乳腺細(xì)胞相比,乳腺癌細(xì)胞中TPM2表達下調(diào),下調(diào)TPM4可顯著降低細(xì)胞對紫杉醇的敏感性[11],在胰腺癌中,敲除PANC-1細(xì)胞中TPM3基因表達后,細(xì)胞發(fā)生EMT,細(xì)胞表型呈惡性轉(zhuǎn)化,細(xì)胞的體外生物學(xué)行為(如增殖和侵襲)均有不同程度的增強,TPM3基因有望成為胰腺癌治療的靶點[12]。近年來發(fā)現(xiàn)TPM4異常表達于各種腫瘤中,如乳腺癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌,但TPM4在不同的腫瘤中起著不同的致癌或抑癌作用。在乳腺癌中,TPM4通過Rac1-肌球蛋白ⅡB信號通路在阻斷其侵襲性行為中扮演重要角色[13];同樣的,低表達TPM4是結(jié)腸癌患者不良的獨立預(yù)后因素,有體外實驗提示TPM4表達上調(diào)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MMP-2、MMP-9和MT1-MMP的表達[14]。而在石棉肺中,TPM4的高水平與石棉暴露或石棉肺診斷相關(guān)[15]。肺癌細(xì)胞中TPM4也高度表達[3]。有研究在口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)患者的唾液蛋白質(zhì)組通過二維聚丙烯酰胺凝膠電泳和質(zhì)譜進一步鑒定了上調(diào)蛋白為TPM4,并通過生物信息學(xué)證明了其與scFV-D09的結(jié)合,它在穩(wěn)定細(xì)胞骨架肌動蛋白絲(可能與腫瘤組織重塑有關(guān))中起著核心作用,并且已經(jīng)有長期研究證實TPM4是惡性過程的潛在標(biāo)志物[16],在肝硬化型胃癌中也上調(diào)[17]。本實驗也驗證了TPM4在SGC7901-invasion細(xì)胞高表達。

為了進一步驗證TPM4是否參與調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞的侵襲與遷移的過程,在體外試驗中選擇了高表達TPM4的SGC7901-invasion細(xì)胞作為研究模型。我們應(yīng)用siRNA技術(shù)特異性地下調(diào)TPM4的表達,觀察其對SGC7901-invasion細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，結(jié)果顯示,沉默TPM4的表達能顯著抑制SGC7901-invasion細(xì)胞的體外侵襲、遷移能力(P<0.05)。以上結(jié)果說明,TPM4具有調(diào)控胃癌細(xì)胞侵襲與遷移的能力,可能是促進胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移的致癌基因。提示TPM4可能成為胃癌診斷的標(biāo)志物且可能與復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。