辛伐他汀干預(yù)對(duì)大鼠肺動(dòng)脈高壓及其內(nèi)皮祖細(xì)胞的影響＊

裴 芳，裴 華，劉俊峰，陳 植，康興斌，黃 驥，黃 婕，王華民

（1.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)重慶市總隊(duì)醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶400061；2.海南醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，?？?71101；3.華北石油總醫(yī)院兒科，河北任丘062552；4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院，北京100045）

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是一種病因各不相同的難治性惡性肺血管疾病，預(yù)后不佳，臨床上目前藥物治療效果不甚理想。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPC）又稱血管母細(xì)胞，是一種成年個(gè)體骨髓中的血管內(nèi)皮前體細(xì)胞，它能遷移至外周血并分化成成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有良好的增生潛能。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)EPC能通過(guò)促進(jìn)受損的肺動(dòng)脈內(nèi)皮修復(fù)及動(dòng)脈重塑減低肺動(dòng)脈壓[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀可促進(jìn)EPC增殖，減少EPC凋亡，提高其遷移能力及趨化活性[3-4]。因此，本研究旨在探討利用辛伐他汀治療PH的可行性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集24只8周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量150～200 g，許可證號(hào)：SCXK（京）2005-0013。適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后，分為模型組、實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，每組8只。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 模型組及干預(yù)組于項(xiàng)背部皮下注射1%的野百合堿（monocrotaline，美國(guó)Sigma公司）50mg／kg以誘導(dǎo)形成PH模型[5]；對(duì)照組注射等量磷酸鹽緩沖液（PBS）。注射當(dāng)天為第0天。實(shí)驗(yàn)組于第3天開始予辛伐他汀20mg／kg溶液灌胃，模型組以等量蒸餾水灌胃，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2.2 循環(huán)EPC含量測(cè)定 第21天各組大鼠經(jīng)尾靜脈取血，予乙二胺四乙酸抗凝后取0.1mL，加入2μL小鼠抗大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-2（VEGFR-2）抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），孵育15min，經(jīng)紅細(xì)胞裂解、PBS洗滌離心后，再加入5μL異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（美國(guó)Santa Cruz公司），避光孵育15min，PBS洗滌離心后，依次加入5μL藻紅素標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD34抗體（PE-CD34）、別藻藍(lán)素標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD45抗體（APC-CD45，美國(guó)BD公司）避光孵育15min，PBS洗滌離心后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)每100 000個(gè)單個(gè)核細(xì)胞中CD34＋VEGFR-2＋CD45-的EPCs所占的比例。

1.2.3 心肺指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 右心室收縮壓測(cè)定 經(jīng)靜脈采血后的大鼠以10%水合氯醛（3mL／kg）腹腔注射麻醉，自右側(cè)頸外靜脈插管至右心室，應(yīng)用PM-8000型多參數(shù)監(jiān)護(hù)儀測(cè)定右心室收縮壓，以此間接反映肺動(dòng)脈壓力。

1.2.3.2 觀察肺組織及肺血管病理變化 大鼠斷頭處死，分離右下肺葉，10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察大鼠肺組織病理變化，并應(yīng)用Leica QWinV3圖像分析系統(tǒng)測(cè)量與終末細(xì)支氣管伴行的小動(dòng)脈管壁中膜厚度（MT）與血管外徑（ED）的比值（MT／ED）、管腔面積（VA）與血管總面積（TAA）的比值（VA／TAA）。

1.2.4 循環(huán)EPC的體外培養(yǎng)及功能監(jiān)測(cè)

1.2.4.1 循環(huán)EPC的體外培養(yǎng) 將經(jīng)尾靜脈采集的外周血，以淋巴分離液經(jīng)密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞，加入含5%胎牛血清（FBS）的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基-2（EGM-2，瑞士Lonza公司），以2×106個(gè)／mL密度將細(xì)胞接種于纖維連接蛋白（美國(guó)Hematological Technologies公司）包被的24孔板中，每只大鼠設(shè)2個(gè)孔，置37℃、5%CO2。培養(yǎng)箱孵育，3d后以PBS洗去未貼壁細(xì)胞，更換新的培養(yǎng)液，以后隔日半量換液。

1.2.4.2 循環(huán)EPC的免疫熒光鑒定 細(xì)胞培養(yǎng)7d后，分別取1孔細(xì)胞加入Dil標(biāo)記的乙酰化低密度脂蛋白（美國(guó)Molecular Probes公司）至終濃度5mg／L。繼續(xù)孵育4h，吸棄培養(yǎng)液，用2%多聚甲醛固定細(xì)胞20min，PBS反復(fù)浸洗后，加入含5mg／L FITC標(biāo)記的血凝素（美國(guó)Sigma公司）的PBS 0.5 mL，37℃孵育1h，PBS浸洗后予90%中性甘油封片，于共聚焦顯微鏡下觀察。顯示紅色熒光者為Dil標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍钻?yáng)性細(xì)胞，顯示綠色熒光者為FITC標(biāo)記的血凝素陽(yáng)性細(xì)胞，雙熒光陽(yáng)性細(xì)胞被認(rèn)為是EPC。

1.2.4.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)EPCs特異性表面標(biāo)志CD34、VEGFR-2表達(dá)情況體外培養(yǎng)的EPC于第14天各取1孔細(xì)胞應(yīng)用0.25%胰酶消化細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×106個(gè)／mL，取0.1mL，加人2μL小鼠抗大鼠VEGFR-2抗體，孵育15min，經(jīng)PBS洗滌離心后，再加入5μL FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，避光孵育15min，PBS洗滌離心后，加入5 μL PE-CD34，避光孵育15min，經(jīng)PBS洗滌離心后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EPCs相對(duì)特異性表面標(biāo)志CD34、VEGFR-2的表達(dá)情況。

1.2.4.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 將消化的EPC調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)／mL，取0.2mL接種于預(yù)先鋪有纖維連接蛋白的96孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)96h，每孔加入20 μL四甲基偶氮唑藍(lán)（5mg／mL，美國(guó)Duchfo公司），培養(yǎng)4h后加入100μL二甲基亞砜，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在570nmol／L處的吸光度。

1.2.4.5 細(xì)胞黏附能力檢測(cè) 將消化的EPC調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)／mL，取1mL接種于預(yù)先鋪有纖維連接蛋白的24孔板中，置37℃、5%CO2。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30min，以PBS沖洗3遍去除未貼壁細(xì)胞，200倍相差顯微鏡下選擇3個(gè)不同視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。

1.2.4.6 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 孔徑為8μm的插入式培養(yǎng)皿置于24孔板中，在插入式培養(yǎng)皿外加入0.6mL含5.0%FBS的EGM-2，將消化的EPC應(yīng)用含0.1%FBS不含細(xì)胞因子的EBM-2重新調(diào)整至細(xì)胞密度為5×105個(gè)／mL，取0.1mL加于皿內(nèi)。37℃、5%CO2：培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，取出插入式培養(yǎng)皿，用棉簽擦凈濾膜上層的細(xì)胞，應(yīng)用4%多聚甲醛將膜下層細(xì)胞固定20min，PBS反復(fù)浸洗干燥后，經(jīng)0.1%結(jié)晶紫染色，200倍相差顯微鏡下選擇3個(gè)不同視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組樣本之間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察 模型組大鼠于第10天起較對(duì)照組大鼠活動(dòng)明顯減少，進(jìn)食減少，體毛雜亂無(wú)光澤，呼吸急促。干預(yù)組大鼠除活動(dòng)略有減少外，呼吸、進(jìn)食及體毛情況均較對(duì)照組無(wú)明顯的變化。

2.2 肺動(dòng)脈壓力及局部病變的比較 與對(duì)照組相比，模型組大鼠RVSP明顯升高，且肺小動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷明顯。血小板黏附在損傷的內(nèi)皮細(xì)胞及裸露的基底膜上，可見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肌型小動(dòng)脈中膜厚度顯著增加，MT／ED比值增大。管腔狹窄，甚至閉塞，VA／TAA比值減小。同時(shí)，與模型組相比，干預(yù)組大鼠RVSP明顯降低，已接近對(duì)照組水平。肺部病變也相對(duì)較輕，MT／ED及VA／TAA比值明顯改善并趨于正常，見圖1、表1。

圖1 不同組別大鼠肺組織病理表現(xiàn)（HE，×400）

表1 不同組別大鼠肺動(dòng)脈壓力指標(biāo)的比較（±s）

表1 不同組別大鼠肺動(dòng)脈壓力指標(biāo)的比較（±s）

a：P＜0.01，與模型組比較。

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2.3 循環(huán)EPCs數(shù)量及功能的比較

2.3.1 循環(huán)EPCs數(shù)量的變化 流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，模型組大鼠循環(huán)EPCs在外周血單核細(xì)胞中所占比例（0.017±0.008）%較對(duì)照組（0.036±0.014）%明顯減低（P＜0.01）。干預(yù)組循環(huán)EPCs數(shù)量（0.039±0.012）%較模型組及對(duì)照組均明顯增加（P＜0.01）。

2.3.2 EPCs的體外生長(zhǎng)情況 培養(yǎng)后7d，外周血單個(gè)核細(xì)胞可以見到大量梭形細(xì)胞（圖2A），其具有結(jié)合FITC-lectin（圖2B、2D）及吞噬Dil-acLDL（圖2C、2D）的特性。模型組中同時(shí)結(jié)合FITC-lectin和吞噬Dil-acLDL雙陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例（80.25±6.34）%較對(duì)照組（87.92±6.74）%略少（P＜0.05）。干預(yù)組雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例（88.05±6.92）%較模型組明顯增多（P＜0.05），與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 循環(huán)EPC的培養(yǎng)及免疫熒光鑒定（×100）

2.3.3 EPC表面分子的表達(dá) 培養(yǎng)至第14天，模型組外周血單個(gè)核細(xì)胞CD34、VEGFR-2的表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）；而干預(yù)組表達(dá)顯著上調(diào)，明顯高于模型組（P＜0.01），且與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 不同組別循環(huán)EPC表面分子表達(dá)的比較（±s，%）

表2 不同組別循環(huán)EPC表面分子表達(dá)的比較（±s，%）

a：P＜0.01，與模型組比較；b：P＞0.05，與對(duì)照組比較。

組別CD34 VEGFR-2對(duì)照組 30.17±4.62a 50.68±5.16a模型組 17.35±3.52 32.93±4.72干預(yù)組 31.62±4.86ab 49.75±5.04ab

2.3.4 EPC功能的變化 比較循環(huán)EPC在體外培養(yǎng)狀態(tài)下的增殖、黏附、遷移能力，模型組與對(duì)照組比較均有所下降（P＜0.01）。干預(yù)組各項(xiàng)功能指標(biāo)較模型組顯著上調(diào)（P＜0.01），且與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 不同組別循環(huán)EPC功能指標(biāo)的比較（±s）

表3 不同組別循環(huán)EPC功能指標(biāo)的比較（±s）

a：P＜0.01，與模型組比較；b：P＞0.05，與對(duì)照組比較。

組別 增殖能力（OD值）黏附能力（細(xì)胞個(gè)數(shù)／HPF）遷移能力（細(xì)胞個(gè)數(shù)／HPF）對(duì)照組 0.65±0.08a 12.23±2.12a 13.19±2.67a模型組 0.44±0.05 7.35±1.68 7.36±2.13干預(yù)組 0.62±0.07ab 11.73±2.06ab 12.78±2.72ab

3 討 論

PH是以肺血管阻力漸進(jìn)性增加、右心后負(fù)荷漸進(jìn)性增加、最終導(dǎo)致右心衰竭為特征的惡性疾病。近十余年來(lái)，雖然波生坦、西地那非等靶向藥物的應(yīng)用使得PH的臨床癥狀能夠在一定程度上得到改善，但遠(yuǎn)期預(yù)后依舊不佳。有研究認(rèn)為，血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度凋亡所引起的內(nèi)皮損傷是PH的觸發(fā)因素和起始環(huán)節(jié)[6-8]。因此，從病理基礎(chǔ)角度來(lái)說(shuō)，盡早修復(fù)受損的血管內(nèi)皮，防止血管功能障礙的發(fā)生及血管重構(gòu)將有可能從根本上阻止PH的進(jìn)程，從而達(dá)到對(duì)PH治療的目的。研究表明，EPC在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷后的修復(fù)及維持正常功能方面都起著重要作用[9-10]。PH急性期循環(huán)EPC數(shù)量明顯增加，而對(duì)于已經(jīng)發(fā)生血管重構(gòu)的病例，其循環(huán)EPC的數(shù)量及活性存在明顯下降[11-13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠外周血中EPC的數(shù)量顯著減少，其表面CD34、VEGFR-2的表達(dá)及各項(xiàng)功能指標(biāo)也發(fā)生了明顯的下調(diào)。在組織病理方面，模型組大鼠肺小動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷明顯、管壁增厚、管腔狹窄及肺循環(huán)壓力增高。這說(shuō)明PH的形成確實(shí)與EPC的數(shù)量及功能有關(guān)。

他汀類藥物具有良好的調(diào)脂作用，在膽固醇水平相當(dāng)?shù)那闆r下，他汀類藥物能顯著降低心血管事件發(fā)生率。此外，他汀類藥物還具有促進(jìn)血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)作用。近年來(lái)，隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)了他汀類的很多非干細(xì)胞的生物學(xué)作用。有研究報(bào)道，他汀類能增加EPC的增殖、遷移及分化，有利于改善EPC的功能，以實(shí)現(xiàn)血管損傷的修復(fù)及通過(guò)血管生成來(lái)增加和改善缺血區(qū)域的血液供應(yīng)。本研究顯示，干預(yù)組大鼠于實(shí)驗(yàn)第21天時(shí)，其循環(huán)EPC的數(shù)量較模型組增多，與對(duì)照組比較也在相對(duì)較高水平。在體外培養(yǎng)狀態(tài)下，干預(yù)組EPC表面CD34、VEGFR-2的表達(dá)及增殖、黏附、遷移能力比模型組有顯著上調(diào)，相應(yīng)地，其肺小動(dòng)脈的病變及肺循環(huán)壓力的增高也得到了改善。這說(shuō)明辛伐他汀對(duì)PH有一定的治療效果。

綜上所述，辛伐他汀能明顯地增加循環(huán)EPC的數(shù)量，改善EPC的功能，達(dá)到促進(jìn)血管新生和受損血管內(nèi)皮修復(fù)的作用，以便在肺動(dòng)脈內(nèi)皮損傷的早期即有效地完成修復(fù)工作，維持內(nèi)皮正常的結(jié)構(gòu)和功能，防止因血管的舒張功能受損和平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖而造成的血管重構(gòu)，達(dá)到對(duì)PH的治療目的。然而，由于辛伐他汀治療過(guò)程中的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、EPC參與局部損傷修復(fù)的具體作用方式及機(jī)制尚不完全明了，因此應(yīng)用辛伐他汀治療PH尚需要對(duì)其遠(yuǎn)期療效和可能存在的問(wèn)題進(jìn)行更加深入地研究和評(píng)估。

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