柱層析法純化藻膽蛋白的紫外-可見光譜特征研究與機理分析

武 康，汪家權，趙冰冰，方 艷，張發(fā)宇

1. 合肥工業(yè)大學資源與環(huán)境工程學院，安徽 合肥 230009 2. 合肥工業(yè)大學土木與水利工程學院，安徽 合肥 230009 3. 合肥工業(yè)大學電子科學與應用物理學院，安徽 合肥 230009

引 言

近年來，隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，河流湖泊的富營養(yǎng)化程度愈發(fā)嚴重，主要表現(xiàn)為夏季藍藻大規(guī)模爆發(fā)，政府要花大量資金打撈藍藻，如何實現(xiàn)藍藻減量化、資源化和無害化是亟待解決的重要問題之一。 目前的解決方案是把藍藻作為反應物消化掉，如好氧堆肥、產沼氣、制備藍藻基活性炭、生產生物塑料制品等。 這些方法雖在一定程度上緩解了藍藻的處置難題，但存在被動消化、附加值不高、經(jīng)濟效益低等問題。

巢湖藍藻體內有豐富的藻膽蛋白，高純度的藻膽蛋白具有良好的抗衰老性、抗癌性和熒光免疫性等[1]。 提取與純化高純度藻膽蛋白既能實現(xiàn)主動消化、高附加值資源化的目的，又可以推動進一步對藻膽蛋白特性的研究[2]。 紫外-可見吸收光譜法已被證明可以在提取純化藻膽蛋白過程中發(fā)揮重要作用。 這是由于藻膽蛋白(藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白)在紫外-可見波段(200～700 nm)除了具有一般的蛋白吸收峰(280 nm)外，還各自具有其相應的最大特征吸收峰[3]。 如藻紅蛋白在565 nm有強吸收峰，藻藍蛋白在620 nm有強吸收峰，別藻藍蛋白在650 nm有強吸收峰。 通過對比測試樣品的吸收峰強度及位置變化，即可定性定量比較測試樣品的各組分濃度差異。 紫外-可見吸收光譜法成為藻膽蛋白提取純化過程中評價提取純化效果強有力的表征手段。 本研究以巢湖新鮮藍藻為實驗原料，以CellufineA-500與羥基磷灰石為柱層析填料，結合兩種填料對應的洗脫峰在洗脫曲線上的特點，在前人研究的基礎上，充分利用藻紅蛋白、藻藍蛋白、別藻藍蛋白與一般蛋白質的紫外-可見光譜特性的差別，研判洗脫峰組分的動態(tài)變化。 通過研究進一步掌握收集高純度藻膽蛋白的時機，深入揭示了兩種柱層析填料純化藻膽蛋白的機理，為藍藻高附加值資源化提供一定的理論支撐。 目前提取新鮮藍藻的生物質及相應理論的研究尚屬稀缺，因此開展的對藻膽蛋白純化實驗的光譜學分析將會為今后多維度深層次綜合利用藍藻以及研究其他提取生物質實驗的理論提供一定的思路和參考。

1 實驗部分

1.1 樣品采集

巢湖新鮮藻泥，采自于合肥市巢湖西湖區(qū)水體距表層15 cm處。 直接打撈，經(jīng)四層紗布過濾除去部分水分后，帶回實驗室-18 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

紫外-可見分光光度計(TU-1950)，北京普析通用公司； 高速冷凍離心機(KDC-160HR)，安徽中科中佳科學儀器有限公司； 電子天平(FA2004N)，上海民橋精密科學儀器有限公司； 恒溫磁力攪拌器(85-2A)，江蘇金城國勝儀器廠。

常用試劑： 磷酸鹽緩沖試劑(PBS)，NaCl，NaOH，鹽酸，(NH4)2SO4(以上試劑均為分析純)； CellufineA-500，GE公司； 羥基磷灰石(CHT-B)，Biocanal公司。

1.3 工藝流程

藍藻藻泥→反復凍融提取→過濾→離心分離制備粗提液→一步鹽析→離心收集上清液→二步鹽析→透析脫鹽→柱層析(CellufineA-500，羥基磷灰石)分離純化→收集洗脫組分→紫外-可見吸收光譜法分析。

1.4 表征方法

根據(jù)藻膽蛋白的紫外-可見吸收特性，使用紫外-可見吸收光譜法表征提取純化藻膽蛋白過程中物質含量相應變化。 藻膽蛋白在紫外-可見波段(200～700 nm)除了具有一般的蛋白吸收峰(280 nm)外，還各自具有相應的最大特征吸收峰。 對洗脫曲線在不同洗脫峰下根據(jù)峰的強度、面積大小選擇相應的取樣點，對取樣點對應的各溶液進行200～700 nm全波長掃描，得到各洗脫峰的光譜掃描變化圖，以此表征分析各組分隨著時間的動態(tài)變化。

2 結果與討論

2.1 CellufineA-500分離藻膽蛋白的紫外-可見光譜分析

圖1為使用CellufineA-500作為柱層析填料，用以分離藻膽蛋白的典型洗脫峰的信號圖。 在加入緩沖液之后，會分別出現(xiàn)對應的洗脫峰。 根據(jù)不同洗脫峰的強度、面積大小選擇相應的取樣點。 將取樣點相應的各溶液稀釋后進行200 nm～700 nm全波長掃描。 由于取樣點按照時間節(jié)點有序排列，故得到各洗脫峰的光譜掃描變化圖，以此分析各洗脫峰的組分及其含量動態(tài)變化，如圖2所示。

圖1 Cellufine A-500分離藻膽蛋白的典型洗脫峰圖

2.1.1 洗脫峰Ⅰ的紫外-可見光譜圖變化分析

圖2(a)為圖1中Peak 1中所選取的取樣點進行200～700 nm全波長掃描后所繪制的光譜圖。 如圖中所示，取樣點A，B和C在280及414 nm均有吸收峰，這表明Peak 1所對應的物質為雜蛋白及類胡蘿卜素[4]，且雜蛋白的濃度較高。 由于CellufineA-500是陰離子交換填料，Buffer 1為平衡緩沖液，故洗脫下來的雜蛋白和類胡蘿卜素與填料不發(fā)生吸附作用，應為陽離子或者電中性分子。 類胡蘿卜素的吸收峰為414 nm，則表明類胡蘿卜素的主要成分為鏈孢紅素。 類胡蘿卜素積累的前提之一是高強度的光線，對應著夏季巢湖藍藻的大量爆發(fā)。 此外，圖2(a)中濃度關系為： B>A>C，對應著圖1中Peak 1取樣點B的峰值。

2.1.2 洗脫峰Ⅱ的紫外-可見光譜圖變化分析

圖2(b)為圖1中Peak 2中所選取的取樣點進行200～700 nm全波長掃描后所繪制的光譜圖。 如圖中所示，取樣點A，B和C除了在268 nm有最大吸收峰外，在540及565 nm均有強吸收峰，這表明Peak 2所對應的物質為藻紅蛋白[5]、雜蛋白及部分核酸； 且由于核酸的存在，最大吸收峰波長由280 nm藍移至268 nm處。 藻紅蛋白濃度不高且難以大量富集，提取純化價值不大，應考慮作為雜蛋白去除。 Buffer 2為添加低濃度鹽的緩沖液，這表明此時去除的物質與填料發(fā)生弱吸附作用，應為帶少量負電荷的物質，如核酸、藻紅蛋白等，這也表明藻紅蛋白的等電點高于藻藍蛋白。 對比A，B和C三點變化趨勢，可看出268 nm處的峰強度降低后，導致565 nm處的峰強度超過268 nm處，藻紅蛋白的純度略有上升，這表明核酸比藻紅蛋白優(yōu)先被去除。

2.1.3 洗脫峰Ⅲ的紫外-可見光譜圖變化分析

圖2(c)為圖1中Peak 3中所選取的取樣點進行200～700 nm全波長掃描后所繪制的光譜圖。 如圖中所示，取樣點A，B，C，D和E除了在277 nm有強吸收峰外，在620 nm有最大吸收峰以及358 nm有副吸收峰，與圖3中藻藍蛋白標準光譜圖中典型的最大吸收峰(620 nm處)和蛋白質吸收峰(277 nm處)一致，表明Peak3所對應的物質為高純度藻藍蛋白； 對比A，B，C，D和E取樣點的變化趨勢，可看出620 nm處的峰強度先上升然后保持穩(wěn)定最后下降，這表明藻藍蛋白的濃度先上升后下降，且在C點處達到最大。 B，C和D點藻藍蛋白純度均超過4.0，這表明B點到D點為高純度藻藍蛋白的最佳收集段； 但B點純度最高，達到4.26，與濃度變化略有不同。 為了探究其中緣由，在Peak 3出峰時間(43～53 min)間隔半分鐘測藻藍蛋白與別藻藍蛋白相對含量，如圖4所示。

圖2 各洗脫峰取樣點的紫外-可見吸收光譜變化圖

圖4中藻藍蛋白的相對含量先上升后下降，最高達到95.2%，且相對集中分布于前半段，這表明藻藍蛋白與別藻藍蛋白未能完全分離，從而制約了藻藍蛋白純度的進一步提高。 由于Buffer 3的離子強度進一步提升，非吸附作用特別強的組分均會被洗脫下來，故藻藍蛋白與別藻藍蛋白應帶有較多負電荷，且數(shù)量接近。 由于藻藍蛋白與別藻藍蛋白的濃度比約為2∶1, 故藻藍蛋白會相對集中的被分離出，但不能完全排除別藻藍蛋白的干擾。

圖3 藻藍蛋白與別藻藍蛋白的標準光譜圖

圖4 Ⅲ峰藻藍蛋白與別藻藍蛋白相對含量變化圖

2.1.4 洗脫峰Ⅳ的紫外-可見光譜圖變化分析

圖2(d)為圖1中Peak 4中所選取的取樣點進行200～700 nm全波長掃描后所繪制的光譜掃描圖。 如圖中所示，取樣點A，B和C除了在276 nm有最大吸收峰外，還在615 nm有強吸收峰，這表明Peak4所對應的物質為雜蛋白及低純度藻藍蛋白。 由于Buffer 4的離子強度進一步升高，吸附作用強的組分一般也會被洗脫下來，此時洗脫的組分應帶有大量負電荷。 對比A，B和C取樣點的變化趨勢，可看出藻藍蛋白吸收峰波長由620 nm藍移至615 nm處，而276 nm處吸收峰的強度增加。 這表明低純度藻藍蛋白先于雜蛋白被洗脫，這可能是由于這部分雜蛋白等電點更低、帶有更多負電荷所導致。

2.2 羥基磷灰石分離藻膽蛋白的紫外-可見光譜分析

圖5為使用羥基磷灰石作為柱層析填料，用以分離藻膽蛋白的典型洗脫峰的信號圖。 如圖5在加入緩沖液之后，會分別出現(xiàn)對應的洗脫峰。 根據(jù)不同洗脫峰的強度、面積大小選擇相應的取樣點。 然后將取樣點相應的各溶液稀釋后進行200～700 nm全波長掃描。 由于取樣點按照時間節(jié)點有序排列，故得到各洗脫峰的光譜掃描變化圖，以此分析各洗脫峰的組分及其含量動態(tài)變化，如圖5所示。

圖5 羥基磷灰石分離藻膽蛋白的典型洗脫峰圖

2.2.1 洗脫峰Ⅰ的紫外-可見光譜圖變化分析

圖6(a)為圖5中Peak 1中所選取的取樣點進行200～700 nm全波長掃描光譜圖。 如圖中所示，取樣點A，B和C在260 nm(272 nm)處均有最大吸收峰，在414，540及565 nm均有吸收峰，表明Peak 1所對應的物質為雜蛋白、核酸、少量類胡蘿卜素和藻紅蛋白，且雜蛋白與核酸的含量較高。 由于羥基磷灰石是金屬螯合親和填料，Buffer 1為平衡緩沖液，故洗脫下來的雜蛋白、核酸、藻紅蛋白和類胡蘿卜素與填料不發(fā)生螯合反應，應為堿性蛋白質或正離子。 此外，圖6(a)中B點260，540與565 nm峰的強度均高于A與C點，這表明在B點處藻紅蛋白與核酸濃度高于兩邊，對應著圖5中Peak 1取樣點B峰值。

2.2.2 洗脫峰Ⅱ的紫外-可見光譜圖變化分析

圖6(b)為圖5中Peak 2中所選取的取樣點進行200～700 nm全波長掃描的光譜圖。 如圖中所示，取樣點A，B，C，D和E在620 nm(615 nm)處均有最大吸收峰，在278及358 nm均有吸收峰，與圖3中藻藍蛋白標準譜圖中典型的最大吸收峰和蛋白質吸收峰一致，這表明Peak 2所對應的物質為高純度藻藍蛋白。 由于Buffer 2增加了磷酸鹽緩沖液濃度，故會競爭性地置換結合蛋白質，使與鈣離子形成較弱配位鍵的組分發(fā)生解吸反應。 因此，藻藍蛋白應為酸性蛋白質，與鈣離子可發(fā)生較弱的螯合反應。 此外，圖6(b)中A和E兩點最大吸收峰為615 nm處，這可能是由于A和E兩點尚存在少量雜蛋白； 隨著純度的增加，最大吸收峰逐漸紅移至620 nm處。 到C點時純度最高，可達4.62，高于CellufineA-500柱純化的藻藍蛋白，為了探究其中緣由，在Peak 2出峰時間(44～55 min)間隔半分鐘測藻藍蛋白與別藻藍蛋白相對含量，如圖7所示。

圖6 各洗脫峰取樣點的紫外-可見吸收光譜變化圖

圖7 Ⅱ峰藻藍蛋白與別藻藍蛋白相對含量變化圖

圖7中藻藍蛋白的相對含量先上升后下降，最高達到100%，且于46～50 min內均可以保持，表明這段時間內藻藍蛋白與別藻藍蛋白能夠完全分離，從而較大程度上提高了藻藍蛋白的純度。 分析認為由于配位鍵的存在，使得金屬螯合親和色譜的特異性高于陰陽離子交換色譜，因此羥基磷灰石的純化分辨率大于CellufineA-500，故能完全分離藻藍蛋白和別藻藍蛋白。

2.2.3 洗脫峰Ⅲ的紫外-可見光譜圖變化分析

圖6(c)為圖5中Peak 3中所選取的取樣點進行200～700 nm全波長掃描后所繪制的光譜圖。 如圖中所示，取樣點A，B和C在650與620 nm處有顯著吸收峰，在276 nm處有相應蛋白吸收峰，與圖3中別藻藍蛋白標準譜圖中典型的最大吸收峰(650 nm處)和蛋白質吸收峰一致，這表明Peak 3所對應的物質為別藻藍蛋白與少量藻藍蛋白。 由于Buffer 3進一步增加了磷酸鹽緩沖液濃度，故會競爭性地置換結合蛋白質，顯著降低柱容量，使與鈣離子形成較強配位鍵的組分也發(fā)生解吸反應。 因此，別藻藍蛋白應為酸性蛋白質，與鈣離子可發(fā)生較強的螯合反應，配位鍵強度大于藻藍蛋白與鈣離子生成的配位鍵。 此外，圖6中A和C兩點在620 nm處均有強吸收峰，而非B點處的副吸收峰，這可能是由于藻藍蛋白與別藻藍蛋白的濃度比約為2∶1，故A和C處兩點尚存在少量藻藍蛋白，使得在620 nm處的吸收峰強度增加； 隨著純度的增加，620 nm處的吸收峰強度逐漸下降，而650 nm處的吸收峰強度逐漸上升。 到B點時純度最高，可達4.33，而CellufineA-500卻無法達到這種分離效果，這是由于二者純化機理不同所導致的。

3 結 論

CellufineA-500填料能夠有效地將藻紅蛋白、核酸、類胡蘿卜素與雜蛋白從藻膽蛋白初步純化液中去除，最終獲得純度為4.2的試劑級藻藍蛋白，但不能完全分離藻藍蛋白和別藻藍蛋白； 羥基磷灰石填料不僅能夠有效地將藻紅蛋白、核酸、類胡蘿卜素與雜蛋白從藻膽蛋白初步純化液中去除，還能夠有效分離藻藍蛋白和別藻藍蛋白，同時獲得試劑級藻藍蛋白和試劑級別藻藍蛋白。

運用紫外-可見吸收光譜變化圖逐一分析各洗脫峰，能夠有效鑒別各洗脫峰的組分和分離變化過程，動態(tài)演繹了兩種柱層析填料分離雜質、純化藻藍蛋白和別藻藍蛋白的過程，闡明了兩種柱層析填料的作用機理。 本工作對藻膽蛋白純化實驗的光譜學分析將會為今后多維度深層次綜合利用藍藻以及研究其他提取生物質實驗的理論提供一定的思路和參考。