中國(guó)漢族人泛醌NADH脫氫酶Fe-S蛋白1基因多態(tài)性與氯氮平所致代謝綜合征的關(guān)聯(lián)研究

陳艷，方新宇，汪也微，余玲芳，王丹丹，張毅，蔡軍，宋立升，張晨

第二代抗精神病藥(SGAs)以其良好的療效和較少的錐體外系反應(yīng)成為治療精神分裂癥的主要治療手段[1]。然而，大量證據(jù)[2-4]表明SGAs的使用可顯著增加患者罹患代謝綜合征(MS)的可能性。既往的家系研究[5]發(fā)現(xiàn)，抗精神病藥所致MS(AIMS)的遺傳度為60%～80%，遺傳因素在AIMS發(fā)生中起關(guān)鍵作用。氯氮平不僅是其他SGAs的原型藥，且更易造成MS[4,6]；故針對(duì)氯氮平相關(guān)MS的遺傳學(xué)研究可能更有利于研究AIMS機(jī)制。

線粒體作為細(xì)胞能量代謝的中樞，在有氧代謝中的作用無可或缺[7]。線粒體功能失調(diào)與冠狀動(dòng)脈硬化、糖尿病、肥胖等多種代謝相關(guān)疾病關(guān)聯(lián)[8-10]。 電子傳遞鏈又名氧化呼吸鏈，包含4種具有氧化還原功能的復(fù)合體，其與ATP合酶以及兩個(gè)游離的電子載體——泛素和細(xì)胞色素c共同組成氧化磷酸化系統(tǒng)(OXPHOS)，在線粒體能量產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用[11-12]。復(fù)合體I即NADH泛素氧化還原酶，作為氧化呼吸鏈中最大、最復(fù)雜的組成部分，具有45個(gè)亞基[13-14]，其中人泛醌NADH脫氫酶Fe-S蛋白(NDUFS1)由核基因NDUFS1編碼，為復(fù)合體I最大的亞基，且在其功能中起關(guān)鍵作用[15]。經(jīng)上海市精神衛(wèi)生中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，本研究以NDUFS1多態(tài)性為切入點(diǎn)，通過病例-對(duì)照研究探索線粒體復(fù)合體I相關(guān)核基因在AIMS中的可能作用。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

入組者為上海市精神衛(wèi)生中心閔行分院住院的漢族精神分裂癥患者388例；入組者均符合《美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》第4版(DSM-Ⅳ)診斷標(biāo)準(zhǔn)；病程≥5年且病情處于穩(wěn)定期>6個(gè)月；年齡18～60歲；單藥服用氯氮平≥24個(gè)月或合并使用第一代抗精神病藥；排除其他精神障礙。入組者或其監(jiān)護(hù)人均簽署書面知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料的采集及分組方法 收集入組患者一般臨床資料，包括性別、年齡、病程、服藥劑量、服藥時(shí)間等；測(cè)量腰圍、血壓、身高、體質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)(BMI)。入組次日清晨抽取空腹靜脈血檢測(cè)空腹血糖(FBG) 、三酰甘油(TG) 、高密度脂蛋白 (HDL)水平(由日立7170 型全自動(dòng)生化儀完成)。根據(jù)美國(guó)國(guó)家膽固醇教育項(xiàng)目成人治療組第3次報(bào)告(NCEP-ATP III)中MS診斷標(biāo)準(zhǔn)[16]，符合下列≥3項(xiàng)為患有MS:①腹部肥胖：腰圍≥90 cm(中國(guó)男性)或≥80 cm(中國(guó)女性); ②TG≥1.70 mmol/L; ③HDL<1.00 mmol/L (男) 或<1.30 mmol/L (女) ;④血壓異常:收縮壓(SBP)/舒張壓(DBP)≥130/85 mmHg，或此前已診斷為高血壓; ⑤FPG≥5.6 mmol/L，或已接受降糖治療。

1.2.2 NDUFS1多態(tài)性檢測(cè) ①位點(diǎn)選擇：根據(jù)HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)中國(guó)北京漢族人群數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性(SNP)選擇。設(shè)參數(shù)：決定系數(shù)(r2)>0.8，最小等位基因頻率(MAF)>0.10，經(jīng)檢索在NDUFS1中篩選出4個(gè)位點(diǎn)(rs13024804、rs1044120、rs6435330、rs4147713)；②DNA提取和基因型的檢測(cè)：抽取入組者外周靜脈血2 ml，保存于EDTA抗凝管，其中1 ml用于提取DNA，另外1 ml于-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩Ｆ渲刑崛NA過程通過使用天根生化科技(北京)有限公司的離心柱型血液基因組DNA提取試劑盒完成。應(yīng)用SNaPshot 單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型技術(shù)[17-18]對(duì)篩選出的4個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行分型；主要步驟包括應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件premier 3.0進(jìn)行SNP位點(diǎn)的上、下游引物的設(shè)計(jì)；使用9600型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，ABI)進(jìn)行4個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增；根據(jù)SNaPshot SNP分型技術(shù)進(jìn)行SNP分型。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件包及SHEsis 遺傳分析軟件；兩組計(jì)量資料比較用t檢驗(yàn)或方差分析；計(jì)數(shù)資料比較使用χ2檢驗(yàn)；不同基因型對(duì)代謝指標(biāo)的影響，則通過協(xié)方差分析；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 一般資料分析

388例入組者中，符合MS診斷者159例(MS組)，非MS組229例。兩組性別、年齡、病程、服用氯氮平時(shí)間、劑量及血藥濃度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MS組BMI、腰圍、FBG、TG、SBP、DBP 明顯高于非MS組，HDL明顯低于非MS組。見表1。

表1 兩組一般臨床資料比較

2.2 兩組間SNP各位點(diǎn)等位基因及基因型分布的比較

兩組SNP各位點(diǎn)的等位基因及基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 兩組SNP 4個(gè)位點(diǎn)基因型及等位基因的頻率分布比較(例數(shù))

2.3 不同性別及遺傳模式下兩組SNP中4個(gè)位點(diǎn)等位基因與基因型分布比較

兩組女性患者中，rs1044120、rs6435330、rs4147713位點(diǎn)等位基因與基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且經(jīng)Bonferroni 校正后差異仍存在。此外，顯性遺傳模式下，rs1044120(GT+TT vs GG,P=0.002,OR=0.25,95%CI：0.10～0.61)、rs6435330(GT+TT vs GG,P<0.001,OR=0.21,95%CI：0.09～0.50)、rs4147713(TG+GG vs TTP=0.002,OR=0.26,95%CI：0.11～0.61)組間基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，經(jīng)Bonferroni 校正后差異仍存在；而隱形遺傳模式下此3個(gè)位點(diǎn)基因型分布則差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 性別分層下各代謝指標(biāo)在不同個(gè)體與GG基因型個(gè)體之間的差異

協(xié)方差結(jié)果顯示，NECP-ATP III中判斷是否具有MS的各代謝相關(guān)指標(biāo)(BMI、腰圍、GLU、TG、HDL、SBP以及DBP)中，男性rs1044120位點(diǎn)T等位基因攜帶者血漿HDL水平顯著高于非攜帶者[(1.33±1.26) mmol/L vs (1.09±0.48)mmol/L,P=0.034]，而女性患者群體中未見此顯著差異[(1.80±1.24) mmol/L vs (1.89±1.72) mmol/L,P=0.787]；女性患者中rs6435330位點(diǎn)T等位基因攜帶者DBP顯著低于非攜帶者[(71.43±7.134)mmHg vs (74.47±6.419) mmHg,P=0.032]；而男性患者群體中未見此顯著差異[(73.13±7.142) mmol/L vs (74.76±6.81) mmol/L,P=0.056]。

3 討論

線粒體在糖脂代謝等過程中起至關(guān)重要作用?？咕癫∷幬锏氖褂每芍戮€粒體線功能異常；該過程可能參與AIMS的機(jī)制，而NDUFS1編碼的NDUFS1蛋白為復(fù)合體I親水臂的一部分，負(fù)責(zé)電子的轉(zhuǎn)移，是線粒體復(fù)合體I的關(guān)鍵亞基[15]。該基因突變可導(dǎo)致復(fù)合物I缺陷，并進(jìn)一步造成線粒體內(nèi)活性氧(ROS)增加[19]。研究[20-21]發(fā)現(xiàn)ROS在下丘腦弓狀核中食欲相關(guān)神經(jīng)元的激活中起重要作用，故ROS水平對(duì)下丘腦能量穩(wěn)態(tài)的維持產(chǎn)生影響。最近研究[22]也發(fā)現(xiàn)慢性精神分裂癥患者中氧化應(yīng)激水平升高，且其相關(guān)指標(biāo)如血漿丙二醛(MDA)水平與患者BMI存在正相關(guān)。因此有理由推測(cè)NDUFS1的突變可能通過影響氧化應(yīng)激水平而參與AIMS的機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，顯性遺傳模式下，rs1044120、rs6435330、rs4147713這3個(gè)位點(diǎn)的突變可顯著降低女性而非男性精神分裂癥患者服用氯氮平致MS風(fēng)險(xiǎn)。因性激素的影響，MS等相關(guān)代謝疾病的發(fā)生以及特點(diǎn)具有性別差異。相較于男性，女性的脂肪組織的合成以及存儲(chǔ)效率更高，男性與女性間不同的生活習(xí)慣以及壓力感受也可對(duì)代謝水平產(chǎn)生影響[23]；因此性別是AIMS的臨床異質(zhì)性因素之一。

協(xié)方差分析顯示，攜帶rs6435330位點(diǎn)T等位基因的女性患者DBP顯著較低；攜帶rs1044120位點(diǎn)T等位基因的男性患者HDL水平更高，HDL為MS的保護(hù)因素，其體內(nèi)水平的升高可降低罹患MS風(fēng)險(xiǎn)。相關(guān)報(bào)道[24]顯示，不同性別間HDL水平的差別更多的是來源于性染色體而非性激素，故攜帶更多X染色體的女性中HDL水平更高；其具體機(jī)制可能還需要基礎(chǔ)研究的進(jìn)一步探索。

有研究[17]認(rèn)為NDUFS1多態(tài)性與抗精神病藥所致體質(zhì)量增加(AIWG)顯著相關(guān)，其中rs6435326位點(diǎn)AA基因型的個(gè)體平均體質(zhì)量變化顯著高于AT和TT基因型個(gè)體；部分抗精神病藥臨床試驗(yàn)(CATIE)則顯示NDUFS1基因rs1801318 與AIWG有關(guān)。AIWG是AIMS的一個(gè)重要方面，雖該研究與本研究選擇了相同基因的不同位點(diǎn)作為標(biāo)簽SNP，但最終結(jié)果均指向陽(yáng)性，進(jìn)一步說明NDUFS1在抗精神病藥導(dǎo)致的代謝障礙中的重要作用。

此外，rs1044120位點(diǎn)位于NDUFS1的3'端非編碼區(qū)(3'-UTR)，rs6435330和rs4147713位于內(nèi)含子區(qū)域，其突變均不直接影響轉(zhuǎn)錄結(jié)果。然而現(xiàn)研究指出外顯子區(qū)域的突變并不能完全解釋遺傳疾病的發(fā)生，非外顯子區(qū)域突變位點(diǎn)的重要作用在人們的重視下逐漸顯現(xiàn)出來。雖3'-UTR對(duì)基因表達(dá)作用的具體機(jī)制并未完全闡明，但有證據(jù)顯示3'-UTR的突變位點(diǎn)可能對(duì)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控產(chǎn)生影響[25]。此外，內(nèi)含子通過增加轉(zhuǎn)錄率、核輸出和轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性來提高轉(zhuǎn)錄水平，并且還可以提高mRNA的翻譯效率[26]。而內(nèi)含子突變可能影響轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和非編碼RNA基因從而影響基因表達(dá)，且目前研究已發(fā)現(xiàn)大量?jī)?nèi)含子區(qū)域突變與多種疾病相關(guān)[27]。這可能是這3個(gè)SNP的突變能夠引起表型改變的重要機(jī)制之一。

本研究具有一定局限性。首先，本研究結(jié)果中具有顯著的性別差異，吸煙群體中以男性居多，而吸煙與體內(nèi)氧化應(yīng)激水平相關(guān)，但遺憾的是本研究在收集受試者數(shù)據(jù)時(shí)并未收集受試者的吸煙情況，故不能排除吸煙對(duì)結(jié)果的影響。其次，因長(zhǎng)期服用氯氮平的住院患者中性別分布不均勻；本研究女性患者明顯少于男性，性別分層后結(jié)果并不穩(wěn)固；故有必要在擴(kuò)大樣本量的基礎(chǔ)上開展更為深入的研究。