高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法研究標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度范圍對(duì)蝦油中無(wú)機(jī)砷測(cè)量不確定度評(píng)定的影響

李建榮，張學(xué)玲，陳兵兵，舒士倡，康 建，解 鶴

(1.寧夏理工學(xué)院 理學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，寧夏 石嘴山 753000； 2.寧夏回族自治區(qū)食品檢測(cè)研究院,銀川 750000)

蝦油中含有豐富的不飽和脂肪酸、磷脂及蝦青素等[1-2]，具有降血脂、抗氧化、健腦益智、抗衰老等多種生理功能，在保健品、食品等多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用[3]。由于蝦油中無(wú)機(jī)砷含量較高，影響其在保健品、食品中的應(yīng)用[4-5]。為了檢測(cè)過(guò)程中測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確，更能反映食品中重金屬含量的真實(shí)值，可建立數(shù)學(xué)模型對(duì)測(cè)試過(guò)程系統(tǒng)產(chǎn)生的不確定度進(jìn)行計(jì)算、評(píng)定[6-8]。測(cè)量不確定度用來(lái)評(píng)定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度，測(cè)量結(jié)果的可靠性與其不確定度密切相關(guān), 不確定度越小, 測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性越高。目前，對(duì)于蝦油中無(wú)機(jī)砷含量測(cè)定的不確定度評(píng)定研究較少，本研究采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(HPLC-ICP-MS)對(duì)蝦油中無(wú)機(jī)砷含量進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)GB 5009.11—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》和 JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)蝦油中無(wú)機(jī)砷含量測(cè)定的不確定度進(jìn)行測(cè)量和評(píng)定[9-12]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不確定度的來(lái)源不同，在評(píng)定過(guò)程中對(duì)總體不確定度的影響不同。本文通過(guò)研究不同標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度對(duì)同一樣品含量測(cè)定的不確定度進(jìn)行研究，確定最合理的標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度范圍，以減小對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，以期為檢測(cè)工作者提供檢測(cè)過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)曲線選定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

三價(jià)砷(As(Ⅲ))和五價(jià)砷(As(Ⅴ))的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL)；蝦油，來(lái)自國(guó)家食品藥品檢測(cè)研究院。

無(wú)水乙酸鈉、硝酸鈉、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、氨水、無(wú)水乙醇為分析純；硝酸為優(yōu)級(jí)純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電導(dǎo)率為18.2 MΩ·cm)；氬氣(Ar)(純度≥99.999%)。

Agilent7700e電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，Agilent高效液相色譜儀，高速離心機(jī)，恒溫烘箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)曲線系列1配制過(guò)程：分別用1.0 mL單標(biāo)線吸管準(zhǔn)確吸取1.0 mL As(Ⅲ)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、1.0 mL As(Ⅴ)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，加水稀釋定容至刻度，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液質(zhì)量濃度為10.0 μg/mL。分別用0.5 mL分度吸管準(zhǔn)確吸取As(Ⅲ)、As(Ⅴ)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.025、0.050、0.10、0.50 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL。用1.0 mL單標(biāo)線吸管準(zhǔn)確吸取As(Ⅲ)、As(Ⅴ)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL。則標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的質(zhì)量濃度分別為0、2.5、5.0、10.0、50.0、100.0 ng/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線系列2配制過(guò)程：分別用0.1 mL分度吸管準(zhǔn)確吸取0.1 mL As(Ⅲ)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、0.1 mL As(Ⅴ)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，加水稀釋定容至刻度，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL。分別用0.5 mL分度吸管準(zhǔn)確吸取As(Ⅲ)、As(Ⅴ)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.05、0.10、0.50 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL。用1.0、2.0 mL單標(biāo)線吸管準(zhǔn)確吸取As(Ⅲ)、As(Ⅴ)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液1.0、2.0 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL。則標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的質(zhì)量濃度分別為0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 ng/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線系列3配制過(guò)程：分別用0.1 mL分度吸管準(zhǔn)確吸取0.1 mL As(Ⅲ)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、0.1 mL As(Ⅴ)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，加水稀釋定容至刻度，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL；用10.0 mL單標(biāo)線吸管準(zhǔn)確吸取10.0 mL As(Ⅲ)、As(Ⅴ)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液于100 mL容量瓶中，加水稀釋定容至刻度，As(Ⅲ)、As(Ⅴ)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液質(zhì)量濃度為100 ng/mL。分別用0.5 mL分度吸管準(zhǔn)確吸取As(Ⅲ)、As(Ⅴ)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.1、0.5 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL。用1.0 mL單標(biāo)線吸管準(zhǔn)確吸取As(Ⅲ)、As(Ⅴ)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液1.0 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL。用5.0 mL分度吸管準(zhǔn)確吸取As(Ⅲ)、As(Ⅴ)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液2.0、4.0 mL于100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL。則標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 ng/mL。

1.2.2 樣品處理

稱取蝦油1.000 g于50 mL塑料離心管中，加入0.15 mol/L硝酸溶液20 mL，放置過(guò)夜。于90℃恒溫烘箱中提取2.5 h，每0.5 h振搖1 min。提取完畢，取出，冷卻至室溫，以8 000 r/min離心15 min。取上清液5 mL置于離心管中，加入正己烷5 mL，振搖1 min后，以8 000 r/min離心15 min，棄去上層正己烷，重復(fù)操作1次，吸取下清液，經(jīng)C18小柱凈化及0.45 μm有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC-ICP-MS分析。同時(shí)作空白實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 HPLC-ICP-MS分析條件

HPLC：HM79433型陰離子交換色譜分析柱(250 mm×4.1 mm，10 μm)；流動(dòng)相A為含10 mmol/L無(wú)水乙酸鈉、3 mmol/L硝酸鈉、10 mmol/L磷酸二氫鈉、0.2 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉緩沖液的混合溶液(用氨水調(diào)節(jié)pH為10)，流動(dòng)相B為無(wú)水乙醇，混合流動(dòng)相為流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(體積比99∶1)；洗脫方式為等度洗脫；進(jìn)樣體積40 μL，流速1.0 mL/min。

ICP-MS：射頻功率1 550 W，射頻電壓1.80 V，同心霧化器，采樣深度8.0 mm, 采樣模式為TRA，采集時(shí)間720 s；等離子氣流量15 L/min，載氣為高純氬氣，載氣流量1.0 L/min，輔助氣流量1.0 L/min,泵速0.3 r/min; 檢測(cè)質(zhì)量數(shù)(m/z)75(As)。

1.2.4 蝦油中無(wú)機(jī)砷含量計(jì)算

蝦油中無(wú)機(jī)砷含量參照GB 5009.11—2014按公式(1)計(jì)算。

(1)

式中：X為試樣中無(wú)機(jī)砷含量，mg/kg；C為試樣消化液中無(wú)機(jī)砷的測(cè)定質(zhì)量濃度，ng/mL；C0為成樣空白消化液中無(wú)機(jī)砷的測(cè)定質(zhì)量濃度，ng/mL；V為試樣定容體積，mL；m為試樣質(zhì)量，g ；

總無(wú)機(jī)砷含量等于三價(jià)砷(As(Ⅲ))、五價(jià)砷(As(Ⅴ))含量的加和。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評(píng)定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度評(píng)定

2.1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)不確定度評(píng)定的影響

實(shí)驗(yàn)使用同一種標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)不確定度評(píng)定影響相同。

2.1.1.2 稀釋過(guò)程對(duì)不確定度評(píng)定的影響

表1 無(wú)機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)曲線系列1配制量具校準(zhǔn)引起的不確定度

表2 無(wú)機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)曲線系列2配制量具校準(zhǔn)引起的不確定度

續(xù)表2

玻璃量具最大允差/mL標(biāo)準(zhǔn)不確定度移取、定容體積/mL相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度100 mL單標(biāo)線A級(jí)±0.100.040 8100.0U5=4.1×10-40.5 mL分度吸管A級(jí)±0.0050.002 00.10U6=2.0×10-2100 mL單標(biāo)線A級(jí)±0.100.040 8100.0U7=4.1×10-40.5 mL分度吸管A級(jí)±0.0050.002 00.50U8=4.0×10-3100 mL單標(biāo)線A級(jí)±0.100.040 8100.0U9=4.1×10-41.0 mL單標(biāo)線吸管A級(jí)±0.0070.002 91.0U10=2.9×10-3100 mL單標(biāo)線A級(jí)±0.100.040 8100.0U11=4.1×10-42.0 mL單標(biāo)線吸管A級(jí)±0.0100.004 12.0U12=2.0×10-3100 mL單標(biāo)線A級(jí)±0.100.040 8100.0U13=4.1×10-4

表3 無(wú)機(jī)砷標(biāo)準(zhǔn)曲線系列3配制量具校準(zhǔn)引起的不確定度

由表1中數(shù)據(jù)合成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C1)：

由表2中數(shù)據(jù)合成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C2)：

由表3中數(shù)據(jù)合成的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(C3)：

溫度對(duì)容量瓶和溶液體積的影響：本實(shí)驗(yàn)是在20℃的條件下進(jìn)行的，因此容量瓶和溶液溫度與校準(zhǔn)時(shí)溫度不同引起的不確定度為零。當(dāng)溫度不為20℃時(shí)，則考慮溫度對(duì)體積的影響。

2.1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)生的不確定度

2.1.2 樣品制備過(guò)程對(duì)不確定度評(píng)定的影響

2.1.2.1 取樣

取樣時(shí)，將液體蝦油樣品充分超聲混勻后，得到均勻樣品，隨機(jī)取樣。取樣產(chǎn)生的不確定度忽略不計(jì)。

2.1.2.2 稱重

2.1.2.3 定容體積產(chǎn)生的不確定度

2.1.2.4 樣品制備過(guò)程產(chǎn)生的不確定度

由于是對(duì)同一蝦油樣品中的無(wú)機(jī)砷含量進(jìn)行測(cè)定，則樣品制備過(guò)程產(chǎn)生的不確定度相同。

2.1.3 樣品質(zhì)量濃度的不確定度

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用6個(gè)不同質(zhì)量濃度梯度的無(wú)機(jī)砷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法平行測(cè)定3次得到相應(yīng)的比率IR(離子強(qiáng)度(Cps)/內(nèi)標(biāo)強(qiáng)度)。采用最小二乘法擬合進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)，以IR為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)得到線性方程(y=aC+b)及相關(guān)系數(shù)(r)，見表4～表9。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列1最小二乘法擬合As(Ⅲ)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度-比率結(jié)果

注：y=17 141C+9 425.1，r=0.999 99。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列1最小二乘法擬合As(Ⅴ)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度-比率結(jié)果

注：y=17 488C+17 571，r=0.999 7。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品溶液進(jìn)行了10次重復(fù)測(cè)量，由As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的線性方程分別求得平均質(zhì)量濃度CAs(Ⅲ)= 0.00 ng/mL，CAs(Ⅴ)= 0.56 ng/mL；C0產(chǎn)生的不確定度按公式(2)計(jì)算。

(2)

由公式(2)計(jì)算C0的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u(CAs(Ⅲ))=0.368 ng/mL，u(CAs(Ⅴ))= 0.533 ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)溶液比率殘差的標(biāo)準(zhǔn)差按公式(3)計(jì)算。

(3)

式中：yj為比率。

則sAs(Ⅲ)(y)= 12 362.580，sAs(Ⅴ)(y)= 18 476.178。標(biāo)準(zhǔn)溶液平均質(zhì)量濃度按公式(4)計(jì)算。

(4)

式中：Cj為測(cè)定質(zhì)量濃度；n為測(cè)定次數(shù)，n=10。

(5)

則scc As(Ⅲ)=7 020，scc As(Ⅴ)=7 020。標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的相對(duì)不確定度按公式(6)計(jì)算。

(6)

表6 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列2最小二乘法擬合As(Ⅲ)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度-比率結(jié)果

注：y=17 116C+2 600.2，r=0.999 9。

表7 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列2最小二乘法擬合As(Ⅴ) 標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度-比率結(jié)果

注：y=17 458C+3 987.1，r=0.999 7。

本文對(duì)樣品溶液進(jìn)行了10次重復(fù)測(cè)量，由As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的線性方程分別求得平均質(zhì)量濃度CAs(Ⅲ)=0.00 ng/mL，CAs(Ⅴ)= 0.56 ng/mL；由公式(2)計(jì)算C0的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:u(CAs(Ⅲ))= 0.099 ng/mL；u(CAs(Ⅴ))= 0.112 ng/mL。

由公式(3)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)溶液比率的殘差的標(biāo)準(zhǔn)差：sAs(Ⅲ)(y)= 3 072.108，sAs(Ⅴ)(y)= 3 717.693。

由公式(5)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度殘差的平方和：scc As(Ⅲ)= 259.8，scc As(Ⅴ)= 259.8。

由公式(6)計(jì)算得到urel(CAs(Ⅲ))=0.00，urel(CAs(Ⅴ))=0.200。

表8 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列3最小二乘法擬合As(Ⅲ)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度-比率結(jié)果

注：y=17 090C+585.61，r=0.999 9。

本文對(duì)樣品溶液進(jìn)行了10次重復(fù)測(cè)量，由As(Ⅲ)、As(Ⅴ)的線性方程分別求得平均質(zhì)量濃度CAs(Ⅲ)= 0.00 ng/mL，CAs(Ⅴ)= 0.55 ng/mL；由公式(2)計(jì)算C0的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u(CAs(Ⅲ))= 0.023 ng/mL，u(CAs(Ⅴ))= 0.024 ng/mL。

表9 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列3最小二乘法擬合As(Ⅴ)標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度-比率結(jié)果

注：y=17 353C+1 145.6，r=0.999 5。

由公式(3)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)溶液比率的殘差的標(biāo)準(zhǔn)差：sAs(Ⅲ)(y)= 673.524，sAs(Ⅴ)(y)= 954.36。

由公式(5)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度的殘差的平方和：scc As(Ⅲ)= 9.708，scc As(Ⅴ)= 9.708。

根據(jù)公式(6)計(jì)算得到urel(CAs(Ⅲ))=0.00，urel(CAs(Ⅴ))=0.044。

2.1.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

在相同條件下，對(duì)蝦油中無(wú)機(jī)砷含量進(jìn)行了10次獨(dú)立性測(cè)試，結(jié)果見表10。

表10 蝦油中無(wú)機(jī)砷含量重復(fù)測(cè)定值 ng/mL

在相同條件下，不同標(biāo)準(zhǔn)系列重復(fù)10次測(cè)定蝦油中無(wú)機(jī)砷含量，算數(shù)平均值為：

2.2 不確定度分量

蝦油中無(wú)機(jī)砷各不確定度分量見表11。

表11 標(biāo)準(zhǔn)曲線系列無(wú)機(jī)砷不確定度分量

2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

蝦油中無(wú)機(jī)砷合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.4 擴(kuò)展不確定度

標(biāo)準(zhǔn)曲線系列1：取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U(Y)=k×uc(Y1)=2×0.536=1.072(ng/mL)；相對(duì)擴(kuò)展不確定Urel(Y)=U(Y)/0.56×100%=191.4%。

標(biāo)準(zhǔn)曲線系列2：取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U(Y)=k×uc(Y2)=2×0.115=0.23(ng/mL)；相對(duì)擴(kuò)展不確定度Urel(Y)=U(Y)/0.56×100%=41.1%。

標(biāo)準(zhǔn)曲線系列3：取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U(Y)=k×uc(Y3)=2×0.030=0.060(ng/mL)；相對(duì)擴(kuò)展不確定度Urel(Y)=U(Y)/0.55×100%=10.9%。

3 結(jié) 論

采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定蝦油中無(wú)機(jī)砷含量，對(duì)3種不同質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行曲線擬合，3種標(biāo)準(zhǔn)系列溶液測(cè)得的相同樣品的質(zhì)量濃度和無(wú)機(jī)砷測(cè)試過(guò)程中系統(tǒng)產(chǎn)生的不確定度分別為(0.56±0.536)ng/mL、(0.56±0.115)ng/mL和(0.55±0.030)ng/mL，包含因子k=2，相對(duì)擴(kuò)展不確定度分別為191.4%、41.1%和10.9%。

從研究結(jié)果可以看出，采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定蝦油中無(wú)機(jī)砷含量時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度最大。隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度范圍的擴(kuò)大，不確定度評(píng)定結(jié)果隨之增大，測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性降低。由朗博比爾定律可知：當(dāng)未知組分濃度落在標(biāo)準(zhǔn)曲線中間時(shí)，測(cè)試結(jié)果更準(zhǔn)確、更可靠，可降低誤判的風(fēng)險(xiǎn)。在檢驗(yàn)檢測(cè)工作中，建議先對(duì)未知樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)定，再根據(jù)未知樣品的質(zhì)量濃度選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，從而得到準(zhǔn)確、可靠的結(jié)果。