高效氯氟氰菊酯的微生物降解研究進(jìn)展

王曉慧，商文賢，徐宏英，張智清

(太原科技大學(xué)環(huán)境與安全學(xué)院，山西 太原030024)

擬除蟲(chóng)菊酯是天然除蟲(chóng)菊素的衍生化合物，因其較低的毒性、良好的穩(wěn)定性，殺蟲(chóng)譜廣，對(duì)哺乳動(dòng)物安全性高，被廣泛應(yīng)用于公共衛(wèi)生和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。擬除蟲(chóng)菊酯進(jìn)入環(huán)境后會(huì)在固相、液相、氣相中循環(huán)，過(guò)度使用會(huì)污染陸地和水生環(huán)境，也會(huì)對(duì)非目標(biāo)生物造成影響[1-2]。其中，高效氯氟氰菊酯是新一代Ⅱ型廣譜高效擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑，毒性更強(qiáng)，藥效更快。它具有神經(jīng)毒性，通過(guò)干擾鈉通道作用于昆蟲(chóng)的神經(jīng)系統(tǒng)，并破壞神經(jīng)元而達(dá)到除蟲(chóng)效果[3]。高效氯氟氰菊酯過(guò)去被認(rèn)為具有對(duì)非靶標(biāo)生物具有低毒、易被人體內(nèi)氧化酶系統(tǒng)降解、不積累、低毒等特點(diǎn)。但研究表明，高效氯氟氰菊脂具有脂溶性，含有α-氰基-3-苯氧基苯甲醇和含有鹵素基團(tuán)羧酸部分，吸入后很容易從呼吸道吸收，口服后也容易在胃腸道吸收[4]。頻繁過(guò)量地使用高效氯氟氰菊酯會(huì)增加非靶標(biāo)生物的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，會(huì)對(duì)生物的運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等造成損害[5-7]。高效氯氟氰菊酯在自然光照射下具有光穩(wěn)定性，并且對(duì)植物和微粒有很強(qiáng)的吸附親和力[8]，容易在環(huán)境中大量殘留。微生物降解效率高，成本低，生態(tài)恢復(fù)良好，環(huán)境友好，無(wú)二次污染，在農(nóng)藥降解方面有很好的前景和優(yōu)勢(shì)[9-10]，是修復(fù)高效氯氟氰菊酯殘留的主要方法[11]。作者綜述了高效氯氟氰菊酯在土壤和農(nóng)作物中的殘留現(xiàn)狀及其微生物降解的研究進(jìn)展。

1 高效氯氟氰菊酯的殘留現(xiàn)狀

1.1 高效氯氟氰菊酯在土壤中的殘留動(dòng)態(tài)

高效氯氟氰菊酯在土壤中的高疏水性和持久性，使其在土壤中遷移和大量殘留，會(huì)對(duì)土壤的生態(tài)功能、菌群結(jié)構(gòu)、生態(tài)平衡造成影響。鄭釗等[12]研究了功夫菊酯在海南沙土和壤土的殘留動(dòng)態(tài)：好氧條件下，在沙土中的半衰期(T1/2)為115.52 d，壤土中的T1/2為99.02 d；厭氧條件下，沙土中的T1/2為49.51 d，壤土中的T1/2為30.13 d，表明高效氯氟氰菊酯在壤土中的降解較好，且厭氧條件下降解速度比好氧條件下快。杜紅霞等[13]以濟(jì)南、太原及杭州三地為試驗(yàn)點(diǎn)，測(cè)定了高效氯氟氰菊酯在梨園土壤中的T1/2、安全施用劑量：在土壤中的T1/2為2.6～23.1 d，太原點(diǎn)和杭州點(diǎn)低于濟(jì)南點(diǎn)，且2.5%的高效氯氟氰菊酯的安全施用劑量為12.5 g a.i.·hm-2。李宏宇等[14]研究了杭州、烏魯木齊安寧渠的高效氯氟氰菊酯在大白菜土壤中的殘留動(dòng)態(tài)：T1/2為9.0～11.9 d，烏魯木齊安寧渠的土壤殘留量稍低于杭州。烏魯木齊安寧渠土壤偏堿性，試驗(yàn)時(shí)間在夏季；杭州的土壤偏酸性，試驗(yàn)時(shí)間在冬季；表明高效氯氟氰菊酯更易在堿性、溫度比較高的環(huán)境下降解。研究人員[15-17]同時(shí)測(cè)定了白菜、玉米和小麥土壤中高效氯氟氰菊酯的殘留，在玉米土壤中的T1/2為19.6～28.1 d，在小麥土壤中的T1/2為16.5～19.3 d，而在小白菜土壤中降解迅速，T1/2為8.3～13.4 d，發(fā)現(xiàn)高效氯氟氰菊酯在玉米土壤中降解較慢?？梢?jiàn)，土壤的類(lèi)型、酸堿度、通氣量、溫度、時(shí)間、農(nóng)作物種類(lèi)等均會(huì)影響高效氯氟氰菊酯在土壤中的降解。

1.2 高效氯氟氰菊酯在蔬菜、水果及農(nóng)作物中的殘留動(dòng)態(tài)

高效氯氟氰菊酯可有效防治蔬菜、水果及農(nóng)作物上多種害蟲(chóng)，但大量或不規(guī)范的施用，會(huì)造成農(nóng)藥在果蔬和農(nóng)作物中的殘留，最終通過(guò)食物鏈在人體內(nèi)累積，威脅人類(lèi)健康。山西韭菜農(nóng)殘檢測(cè)顯示，農(nóng)藥總檢出率為80%，其中高效氯氟氰菊酯檢出率為16.7%[18]；廣西荔枝主產(chǎn)區(qū)農(nóng)殘現(xiàn)狀的調(diào)查表明，高效氯氟氰菊酯的檢出率為20.4%，超標(biāo)率為0.02%[19]；北京市蔬菜農(nóng)殘狀況調(diào)查顯示，高效氯氟氰菊酯超標(biāo)率為0.2%，韭菜根部農(nóng)藥殘留明顯[20]；杭州市蔬菜農(nóng)殘現(xiàn)狀表明，擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥的總檢出率為12.6%，總超標(biāo)率為2.1%，高效氯氟氰菊酯的檢出率最高[21]；李琰等[22]對(duì)上海市閔行區(qū)市場(chǎng)果蔬農(nóng)殘情況作了分析，高效氯氟氰菊酯檢出率最高，其殘留量最高的蔬菜、水果分別為雞毛菜和蘋(píng)果；王冬群等[23]對(duì)蔬菜中擬除蟲(chóng)菊酯的殘留情況進(jìn)行了調(diào)查，其中豌豆中高效氯氟氰菊酯的超標(biāo)率為25%；徐晶等[24]抽檢了哈爾濱市的17家超市蔬菜樣品，發(fā)現(xiàn)菊酯類(lèi)農(nóng)藥總檢出率為12.67%，超標(biāo)率為2.98%，高效氯氟氰菊酯檢出率為12.5%，葉類(lèi)蔬菜問(wèn)題最多。郝寧等[25]調(diào)查了2010～2013年邯鄲市蔬菜中的擬除蟲(chóng)菊酯殘留，8種擬除蟲(chóng)菊酯的總檢出率為18.62%，高效氯氟氰菊酯的檢出率最高，農(nóng)藥主要集中在鱗莖類(lèi)、葉莖類(lèi)、豆類(lèi)蔬菜中。

綜上，我國(guó)高效氯氟氰菊酯的殘留和超標(biāo)現(xiàn)象較為普遍，由于其對(duì)光和熱的穩(wěn)定性，在環(huán)境中有很長(zhǎng)的半衰期，它引起的一些生物慢性毒性、致癌致突變性嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康[26-28]。

2 高效氯氟氰菊酯降解菌

我國(guó)是一個(gè)生物資源大國(guó)，微生物物種、代謝和生態(tài)類(lèi)型豐富多樣，自然環(huán)境中存在著大量的細(xì)菌、放線(xiàn)菌、真菌及藻類(lèi)等微生物，為菌株的篩選提供了充足的資源。從長(zhǎng)期高濃度農(nóng)藥污染土壤中篩選高效降解菌株，再與土著微生物群落共同作用降解農(nóng)藥殘留，是修復(fù)污染土壤的有效途徑[29]，微生物功能的生物修復(fù)是國(guó)際土壤修復(fù)科學(xué)中的熱點(diǎn)內(nèi)容[30]。

目前，研究人員已經(jīng)分離到大量的擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥降解菌株，見(jiàn)表1[31-39]。有關(guān)高效氯氟氰菊酯降解菌的研究也不少，見(jiàn)表2。

王彥輝等[40]篩選到一株高效降解真菌，經(jīng)鑒定為青霉菌(Penicilliumsp.)，菌株在pH=7.0、30 ℃、底物濃度為50 mg·L-1時(shí)降解效果最好，在此條件下培養(yǎng)7 d，功夫菊酯降解率可達(dá)到83.90%。劉珍[41]分離篩選到兩株真菌，為棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)和草酸青霉(Penicilliumoxalicum)，在28 ℃、接種量為5%的條件下培養(yǎng)5 d后，兩株真菌對(duì)100 mg·L-1功夫菊酯的降解率分別為69.89%和84.83%。張建等[42]分離到一株對(duì)功夫菊酯有高效降解作用的細(xì)菌，鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，它的最適生長(zhǎng)溫度、pH值分別為30 ℃、7，底物濃度為100 mg·L-1時(shí)，3 d對(duì)功夫菊酯的降解率為85%。徐蓮等[43]分離到一株三氟氯氰菊酯高效降解細(xì)菌，為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，該菌株最適生長(zhǎng)溫度、pH值分別為30 ℃、8～9，具有耐鹽性，底物濃度為100 mg·L-1時(shí)，1 d降解率可達(dá)到98.4%，且對(duì)三氟氯氰菊酯的耐受性極強(qiáng)，可以達(dá)到600 mg·L-1。翟逸[44]分離到一株人蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropi)，菌株在30 ℃、pH=7.0、2.0%接種量、高效氯氟氰菊酯濃度50 mg·L-1時(shí)，降解率為84%，耐受能力強(qiáng)，對(duì)高效氯氟氰菊酯耐受濃度可達(dá)到400 mg·L-1，且該菌株對(duì)其中間代謝產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸能有效降解，使殘留被徹底清除。王琨[49]篩選到3株高效氯氟氰菊酯降解菌，菌株BE-1降解率最高，在30 ℃、pH值7.0、初始濃度為100 mg·L-1時(shí)，降解率為49.6%。吳浩豪等[45]篩選到一株鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacteriumsp.)，對(duì)氯氟氰菊酯有降解作用，該菌株的最適溫度、pH值分別為30 ℃、7.0，菌株有很寬的pH值適用范圍，在pH值5～9的條件下，對(duì)氯氟氰菊酯的降解率都可以達(dá)到50%以上，底物濃度為200 mg·L-1時(shí)，7 d降解率可以達(dá)到77.2%。肖紅利[46]分離得到一株不動(dòng)桿菌(Acinetobactersp.)，最適溫度、pH值分別為28 ℃、7.0，具有廣譜性，能以擬除蟲(chóng)菊酯、有機(jī)磷等多種農(nóng)藥為碳源，且對(duì)農(nóng)藥的耐受濃度高達(dá)500 mg·L-1，菌株在28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)108 h，對(duì)200 mg·L-1三氟氯氰菊酯降解率為77.8%。虞云龍等[47]分離到一株產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)的一個(gè)未知種，該菌株最適溫度、pH值分別為30 ℃、7.0～7.5，該菌株具有廣譜性，對(duì)三氟氯氰菊酯有降解作用，50 mg·L-1的三氟氯氰菊酯降解速率為3.04 μmol·L-1·h-1。目前篩選到的能降解高效氯氟氰菊酯菌株降解能力強(qiáng)，有廣譜性，大多是細(xì)菌，少量為真菌，很少篩到放線(xiàn)菌。細(xì)菌對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，在高濃度農(nóng)藥的作用下，易發(fā)生突變，在農(nóng)藥的微生物降解中起主導(dǎo)作用[50]。

表1 降解擬除蟲(chóng)菊酯的微生物類(lèi)群

Tab.1 The microbe group for degrading pyrethriods

表2 降解高效氯氟氰菊酯的微生物類(lèi)群

Tab.2 The microbe group for degrading lambda-cyhalothrin

3 高效氯氟氰菊酯的降解酶和降解基因

農(nóng)藥降解酶主要來(lái)自于微生物。微生物的降解實(shí)質(zhì)是酶促反應(yīng)，是微生物通過(guò)物理或化學(xué)方法，產(chǎn)生水解酶和各類(lèi)氧化酶將農(nóng)藥分解轉(zhuǎn)化的過(guò)程。酯酶在擬除蟲(chóng)菊酯的降解中具有重要的調(diào)節(jié)作用[51]。降解酶通常比降解菌更能忍耐極端環(huán)境，不受溫度、pH值、土著微生物吞噬、農(nóng)藥濃度等外部環(huán)境的影響，環(huán)保安全，降解譜廣，降解效率高。當(dāng)前擬除蟲(chóng)菊酯降解酶的研究主要集中在提取、純化粗酶液以及酶學(xué)性質(zhì)方面。林淦[48，52]從陰溝腸桿菌W-1中提取的粗酶液，可以水解氯氟氰菊酯，反應(yīng)速率最大為63.93 nmol·mL-1·min-1，氯氟氰菊酯在濃度為20 mg·L-1、35 ℃、pH值7.5時(shí)，粗酶液在1 h的降解率可以達(dá)到83%，且該粗酶液的胞內(nèi)酶表現(xiàn)出降解底物的活性。解開(kāi)治等[53]從惡臭假單胞菌XP12中提取粗酶液，在pH值6.5～8.0、25～40 ℃時(shí)對(duì)高效氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯和溴氰菊酯的降解率均在70%左右，將粗酶液用于葉類(lèi)蔬菜上，其對(duì)高效氯氟氰菊酯降解率可達(dá)到83.5%，起催化降解作用的是胞內(nèi)酶。虞云龍等[54]從廣譜性產(chǎn)堿菌中提取了粗酶液，該粗酶液在pH值5.0～10.5范圍內(nèi)均有較好的降解活性，有廣譜性，能降解部分?jǐn)M除蟲(chóng)菊酯，降解三氟氯氰菊酯的最適pH值為7.5，米氏常數(shù)為8.67 mmol·L-1，最適溫度為32.5 ℃，胞內(nèi)酶對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥起降解作用。擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥酶促降解的研究表明，降解酶具有更高的降解率，且對(duì)溫度和pH值有更寬的適應(yīng)性，在實(shí)際應(yīng)用中有很好的前景，對(duì)農(nóng)藥降解起主要作用的是胞內(nèi)酶。也有研究人員發(fā)現(xiàn)，胞外酶對(duì)降解擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥起作用，徐蓮等[43]從能高效降解三氟氯氰菊酯的芽孢桿菌中提取能降解三氟氯氰菊酯的粗酶液，酶的定域試驗(yàn)和底物誘導(dǎo)試驗(yàn)表明，該降解酶為組成型胞外酶，粗酶液反應(yīng)溫度為30～60 ℃，在溫度和pH值分別為40 ℃、9.0時(shí)有最高降解活性，60 ℃時(shí)酶的活性保持在50%左右；且發(fā)現(xiàn)其降解基因在染色體的DNA上，不在質(zhì)粒上。郭鵬[55]對(duì)一株能高效降解甲氰菊酯的范氏鞘酯菌JZ-2進(jìn)行深入研究，并且通過(guò)硫酸銨沉淀、凝膠層切和切膠回收電洗脫等純化粗酶液，獲得了一個(gè)新的菊酯水解酶PytH，該酶屬組成型胞內(nèi)酶，在溫度為25～50 ℃、pH值為6.0～8.5時(shí)，均對(duì)酶的活性沒(méi)有影響，該酶的最大降解速率和米氏常數(shù)分別為7.536 nmol·min-1、0.05 nmol·mL-1，純化的水解酶有廣譜性，對(duì)其它擬除蟲(chóng)菊酯也有水解作用。

從篩選到的高效降解菌株中分離到的酶含量低，且酶的分離純化費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高。通過(guò)克隆酶的降解基因并進(jìn)行異源表達(dá)可以提高酶的產(chǎn)量。關(guān)于擬除蟲(chóng)菊酯克隆基因的報(bào)道還很少，僅克隆到幾個(gè)降解基因，即estP水解酶基因(克雷伯氏菌ZD112)、pytH水解酶基因(鞘酯菌JZ-1)、pye3水解酶基因[56-58]。肖紅利[46]從不動(dòng)桿菌屬菌中克隆了氯氰菊酯降解酶片段(約5 kb)，并在大腸桿菌E.coliBL21中進(jìn)行了表達(dá)，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建了4-D菌株基因組文庫(kù)，從中得到的重組質(zhì)粒對(duì)高效氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯有良好降解性，重組質(zhì)粒中可能有擬除蟲(chóng)菊酯降解基因，有待進(jìn)一步的研究。翟逸[44]構(gòu)建了人蒼白桿菌YZ-1的基因組文庫(kù)，從中克隆了一個(gè)新型的酯酶基因pytZ，它與已知的幾個(gè)擬除蟲(chóng)菊酯水解基因序列相似性極低，pytZ有一個(gè)606 bp的開(kāi)放閱讀框，用來(lái)編碼擬除蟲(chóng)菊酯水解羧酸酯酶；轉(zhuǎn)入大腸桿菌系統(tǒng)中誘導(dǎo)純化獲得的PytZ蛋白，在溫度20～45 ℃和pH值6.0～8.0范圍內(nèi)均可以降解高效氯氟氰菊酯，PytZ底物特異性廣泛、酶活性高、穩(wěn)定性好，為微生物降解擬除蟲(chóng)菊酯提供了有利資源。通過(guò)基因改良技術(shù)將降解酶基因轉(zhuǎn)入易于繁殖的宿主中獲得高表達(dá)，可增大酶產(chǎn)量，提高降解效率，也避免了直接使用微生物菌株存在的問(wèn)題。通過(guò)基因組文庫(kù)的成功構(gòu)建，為高效氯氟氰菊酯降解基因的提取提供了有利條件。

4 高效氯氟氰菊酯的降解機(jī)理和途徑

擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)農(nóng)藥種類(lèi)繁多，代謝途徑也較為復(fù)雜，這類(lèi)農(nóng)藥的化學(xué)式中都有酯鍵，其微生物降解失去神經(jīng)毒素的關(guān)鍵就是酯鍵的斷裂[59]。由菌株對(duì)高效氯氰菊酯、溴氰菊酯、聯(lián)苯菊酯降解途徑(圖1～3)發(fā)現(xiàn)，其降解的第一步就是酯鍵的斷裂。目前對(duì)高效氯氟氰菊酯的微生物降解機(jī)理研究較少。林淦等[48]研究了陰溝腸桿菌對(duì)高效氯氟氰菊酯的降解途徑，在粗酶液作用下，水解生成α-氰基-3-苯氧基芐醇和2,2-二甲基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-1-丙烯基)環(huán)丙烷羧酸(圖4)。Chen等[60]分析了蘇云金芽孢桿菌對(duì)氯氟氰菊酯的降解途徑，該菌株通過(guò)酯鍵和芳基鍵的斷裂，產(chǎn)生了6種代謝產(chǎn)物：α-羥基-3-苯氧基苯甲?；译?、3-苯氧基苯基乙腈、N-(2-異丙氧基苯基)-4-苯氧基苯甲酰胺、3-苯氧基苯甲醛、3-苯氧基苯甲酸酯和苯酚。Birolli等[61]分析了海洋真菌對(duì)(±)-氯氟氰菊酯的降解途徑，首先被羧酸酯酶水解，酯鍵斷裂，產(chǎn)生2-羥基-2-(3-苯氧基苯基)乙腈和2,2-二甲基-3-(2-氯-3,3,3-三氟-1-丙烯基)環(huán)丙烷羥酸，2-羥基-2-(3-苯氧苯基)乙腈可以通過(guò)一種氧化腈酶(將氰醇轉(zhuǎn)化為醛的酶)生成3-苯氧基苯甲醛，氰醛通過(guò)氧化生成3-苯氧基苯甲酸，最后生成3-(羥基苯氧基)苯甲酸(圖5)。作為擬除蟲(chóng)菊酯的主要中間代謝產(chǎn)物3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)比母體農(nóng)藥更具流動(dòng)性和持久性，毒性更強(qiáng)，它對(duì)環(huán)境及人體有潛在危害[62]。微生物對(duì)農(nóng)藥的降解過(guò)程中存在污染物的不完全降解，會(huì)帶來(lái)二次污染，造成被修復(fù)土壤的毒性作用增強(qiáng)，所以研究菌株對(duì)高效氯氟氰菊酯的降解途徑是很有必要的。

圖1 枯草芽孢桿菌對(duì)氯氰菊酯的降解途徑 Fig.1 Degradation pathway of beta-cypermethrin by Bacillus subtilis

圖2 無(wú)色桿菌對(duì)溴氰菊酯的降解途徑Fig.2 Degradation pathway of delta-methrin by Chromatic bacteria

圖3 醋酸鈣不動(dòng)桿菌對(duì)聯(lián)苯菊酯的降解途徑Fig.3 Degradation pathway of bifenthrin by Acinetobacter acetate

圖4 陰溝腸桿菌對(duì)高效氯氟氰菊酯的降解途徑Fig.4 Degradation pathway of lambda-cyhalothrin by Enterobacter cloacae

圖5 海洋真菌對(duì)(±)氯氟氰菊酯的降解途徑Fig.5 Degradation pathway of (±)lambda-cyhalothrin by marine-derived fungi

5 結(jié)語(yǔ)

目前對(duì)高效氯氟氰菊酯降解菌的篩選工作，僅限于實(shí)驗(yàn)室條件下單一菌株的培養(yǎng)和降解，而從實(shí)驗(yàn)室到自然環(huán)境中，受到各因素的制約，實(shí)際效果不太理想，同時(shí)菌株的安全性評(píng)價(jià)有待進(jìn)一步考察。篩選高效廣譜、適應(yīng)性強(qiáng)及環(huán)境友好的高效氯氟氰菊酯降解菌株，用分子生物學(xué)和基因工程等技術(shù)對(duì)降解酶基因資源進(jìn)行克隆，構(gòu)建高效工程降解菌，制備多菌株復(fù)合系，是解決上述問(wèn)題的根本方法。

很多情況下微生物并不能將農(nóng)藥完全降解礦化，某些中間代謝產(chǎn)物的毒性大于母體化合物毒性，通過(guò)質(zhì)譜等手段分析高效氯氟氰菊酯降解的中間代謝產(chǎn)物以推斷降解途徑，并深入研究菌株的降解途徑對(duì)提高微生物的修復(fù)有重要作用。

關(guān)于高效氯氟氰菊酯降解酶的分離純化和固定化研究相對(duì)較少。天然的分離菌株其產(chǎn)酶量較低，且酶在土壤中的活動(dòng)性較差，而純化的降解酶更能忍受異常環(huán)境，因此對(duì)降解酶進(jìn)行純化和固定化可以提高酶的穩(wěn)定性和適應(yīng)力，應(yīng)該大力加強(qiáng)這方面的研究。