盆炎凈膠囊的HPLC指紋圖譜及聚類、主成分分析

周 和 譚翔勻 馮 華 王奧

1.遵義市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 遵義 563000： 2.遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州 遵義 563000

盆炎凈膠囊處方由忍冬藤、川芎、狗脊、雞血藤、赤芍、車(chē)前草等八味中藥材組成[1]，具有和血通絡(luò)、清熱利濕、調(diào)經(jīng)止帶的功效，主要用于白帶過(guò)多、濕熱下注等癥狀[2]。盆炎凈膠囊作為中藥復(fù)方制劑，具有多藥味、多成分、多靶點(diǎn)協(xié)調(diào)作用的特點(diǎn)，常規(guī)檢測(cè)只能檢測(cè)其單個(gè)或幾個(gè)成分，不能全面、有效、準(zhǔn)確地說(shuō)明中藥復(fù)方制劑的整體質(zhì)量和確切療效[3-4]。因而，建立更科學(xué)有效、更系統(tǒng)完整的檢測(cè)方法，對(duì)控制盆炎凈膠囊質(zhì)量具有重要意義。中藥指紋圖譜具有整體性、相似性的特點(diǎn)，是一種能突出中藥及其制劑完整面貌的有效方法。結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、系統(tǒng)聚類分析與主成分分析，有助于中藥及其制劑中多種化學(xué)成分的綜合評(píng)價(jià)，從而控制其整體質(zhì)量。近年來(lái)，該技術(shù)已廣泛用于中藥及其制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)[5-12]。因此，本研究采用HPLC法中的梯度洗脫模式，建立了10批盆炎凈膠囊高效液相指紋圖譜。通過(guò)系統(tǒng)聚類分析與主成分分析，挖掘指紋圖譜中蘊(yùn)含的其他信息，對(duì)盆炎凈膠囊進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以期為盆炎凈膠囊的質(zhì)量控制提供一定的參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與試劑 Agilent高效液相系統(tǒng)(配有四元梯度泵，光電二極管陣列檢測(cè)器，柱溫箱，Agilent 1260工作站和處理軟件)，Waters XSelect HSS T3 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)柱；XPE56型十萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒)，KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥品 馬錢(qián)苷、芍藥苷、原兒茶酸對(duì)照品(購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別：111640-201808、110736-20184、211809-201205)，乙睛、磷酸為色譜純，水為娃娃哈純凈水，其余試劑為分析純，10批次盆炎凈膠囊(批號(hào)分別為：190601、190602、190603、190604、190605、190701、190702、190703、190704、190705)遵義華衛(wèi)制藥提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱waters XSelect HSS T3 (4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.5%醋酸溶液(B)，梯度洗脫(洗脫程序見(jiàn)表1)；檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm；流速：1.0 mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 稱取原兒茶酸、馬錢(qián)苷、芍藥苷對(duì)照品適量，分別用甲醇溶解制成含原兒茶酸0.10 mg/mL、馬錢(qián)苷0.31 mg/mL、芍藥苷0.52 mg/mL的單一對(duì)照品溶液，搖勻，用0.45μm 的微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.2 供試品溶液 取盆炎凈膠囊內(nèi)容物適量，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱重，超聲50 min，放至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，取續(xù)濾液，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取上述供試品溶液(批號(hào)：190701)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣檢測(cè)6次，記錄色譜圖。以芍藥苷峰(10號(hào)峰)為參照峰，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.63%(n=6)，相對(duì)峰面積的RSD均小于0.95%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取盆炎凈膠囊(批號(hào)：190701)內(nèi)容物適量，按“2.2.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，共6份，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，18個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.93%(n=6)，相對(duì)峰面積的RSD均小于1.56%(n=6)，表明重復(fù)性良好。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取(批號(hào)：190701)同一供試品溶液，分別在0,2,4,6,8,10,12,24 h進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖。以芍藥苷峰(10號(hào)峰)為參照峰，考察各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于1.87%，表明在室溫條件下，供試品溶液24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜

2.4.1 指紋圖譜的生成 取10批盆炎凈膠囊內(nèi)容物適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法，依次制備10批供試品溶液，再按“2.1”色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”，對(duì)10批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖。如圖1、圖2所示。

2.4.2 相似度分析 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(版本 2004 A)”，以樣品的HPLC對(duì)照指紋圖譜為參照，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)，詳見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，10批樣品相似度均大于0.95以上，表明各樣品間差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定性良好。

表2 相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.4.3 指認(rèn)共有峰 分別取“2.2.1”項(xiàng)下原兒茶酸(狗脊藥材所含成分)、馬錢(qián)苷(忍冬藤藥材所含成分)、芍藥苷(赤芍藥材所含成分)單一的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并與樣品的HPLC對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行對(duì)比指認(rèn)。結(jié)果，共有峰中3、7、10號(hào)色譜峰分別指認(rèn)為原兒茶酸、馬錢(qián)苷、芍藥苷。如圖3所示。

2.4.4 共有峰的相關(guān)分析 10批樣品共有18個(gè)共有峰，其峰面積總和占色譜峰總面積的92.96%。由圖3可知，10號(hào)峰芍藥苷峰面積較大，位置適中，與相鄰色譜峰分離度>2.26，在色譜中穩(wěn)定，故以其保留時(shí)間和峰面積為參照，計(jì)算其它共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表3、表4。

表3 共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表4 共有峰相對(duì)峰面積

續(xù)表4 表4 共有峰相對(duì)峰面積

2.5 聚類分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，變量為10批盆炎凈膠囊HPLC指紋圖譜中標(biāo)定的21個(gè)共有峰的絕對(duì)峰面積，先標(biāo)準(zhǔn)化原始數(shù)據(jù)，再依據(jù)歐氏距離依次進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果詳見(jiàn)圖4。由圖4可知，10批盆炎凈膠囊可分為2類，樣品S1、S2、S8可聚為一類，S3、S4、S5、S6、S7、S9、S10可聚為一類。

2.6 主成分分析

2.6.1 主成分因子特征值、方差貢獻(xiàn)率分析 以特征值>1為主成分因子的篩選標(biāo)準(zhǔn)，采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行主成分因子分析，并計(jì)算其特征值和方差貢獻(xiàn)率。由表5可知，共有4個(gè)主成分因子的特征值符合要求，分別為：8.857、3.792、2.252、2.144。4個(gè)主成分因子的累積方差貢獻(xiàn)率為94.696%，說(shuō)明前4個(gè)主成分可代表樣品大部分信息，適用于主成分分析。依據(jù)主因子載荷絕對(duì)值越大，對(duì)主成分貢獻(xiàn)越大，由表6可知，主成分因子1反映了峰1、2、4、5、7、8、9、10、14、15、16的信息，主成分因子2反映了峰3、6、13、17、18的信息，峰11、18在主成分因子3上有較高的載荷，峰12在主成分因子4上有較高的載荷。

表5 特征值和方差貢獻(xiàn)率

表6 旋轉(zhuǎn)后的主因子載荷矩陣表

2.6.2 綜合質(zhì)量評(píng)分 計(jì)算4個(gè)主成分因子的得分和綜合得分(綜合得分=主成分因子得分×)，對(duì)10批盆炎凈膠囊樣品質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)并排序，結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知，主成分因子綜合得分最高的為S5號(hào)樣品(批號(hào)：190605)，成分7、9、10、14在該批樣品中含量相對(duì)較高，整體質(zhì)量相對(duì)較好。

表7 主成分因子得分

3 討論

本研究成功建立了10批盆炎凈膠囊的指紋圖譜，確認(rèn)18個(gè)共有峰，并指認(rèn)出了3個(gè)已知成分，分別為原兒茶酸(3號(hào))、馬錢(qián)苷(7號(hào))、芍藥苷(14號(hào))。由圖譜可以看出芍藥苷峰面積較大，響應(yīng)高，位置適中，故選擇芍藥苷為參照峰。經(jīng)多次摸索，筆者對(duì)提取溶劑(乙醇、甲醇、水)，提取方法(超聲、加熱回流)，提取時(shí)間(40 min、50 min、60 min)對(duì)比考察發(fā)現(xiàn)，以甲醇為提取溶劑，超聲50 min的提取效果最簡(jiǎn)便高效，樣品濃度高，液相色譜出峰多。此外，在相同梯度洗脫模式下，采集55 min內(nèi)獲得的指紋圖譜，對(duì)比甲醇-水、乙睛-水、甲醇-醋酸溶液、乙睛-醋酸溶液4個(gè)系統(tǒng)的流動(dòng)相。結(jié)果以乙睛-0.5%醋酸溶液梯度洗脫效果最好，各色譜峰基本達(dá)到基線分離、保留時(shí)間適中、分離度符合要求，圖譜指紋性強(qiáng)，有利于分析。

盆炎凈膠囊中含有多味中藥材，測(cè)定1個(gè)或幾個(gè)指標(biāo)成分往往具有局限性，不能充分反映其整體質(zhì)量，因此建立系統(tǒng)的、全面的特征性指紋圖譜，結(jié)合聚類分析和主成分分析是評(píng)價(jià)和控制其質(zhì)量的有效方法。本研究所建立HPLC指紋圖譜方法簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性良好，可為盆炎凈膠囊的整體質(zhì)量控制提供一定的參考。