肝豆靈對(duì)高銅負(fù)荷大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力及神經(jīng)干細(xì)胞ROS水平的影響

匡春俊 董 婷 周 萍 李秀英 田麗偉 黃 鵬

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病中心，安徽 合肥230031

Wilson病(Wilson’s disease,WD)，即肝豆?fàn)詈俗冃?hepatolenticular degeneration,HLD)，是ATP7B基因缺陷引起的銅代謝障礙疾病?；颊咭蚧蛉毕莶荒芮宄w內(nèi)多余的銅，使銅離子沉積于腦部、肝臟、腎臟、皮膚、眼部等臟器系統(tǒng)，使各組織臟器銅中毒受損而出現(xiàn)多樣的臨床表現(xiàn)。銅作為強(qiáng)氧化劑，可激活自由基，促進(jìn)ROS的產(chǎn)生[1]，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，使神經(jīng)細(xì)胞凋亡。銅沉積腦部，神經(jīng)系統(tǒng)受損，出現(xiàn)進(jìn)行性智力減退[2-3]、精神異常等癥狀。在祖國醫(yī)學(xué)研究中，將WD以認(rèn)知能力下降為主要臨床表現(xiàn)的辨病為“癡呆病”，其中“痰瘀互結(jié)型”易出現(xiàn)認(rèn)知障礙。安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病中心為WD患者研制的肝豆靈(Gan dou liang,GDL)具有化痰祛瘀作用，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)肝豆靈能夠明顯改善WD患者認(rèn)知障礙[4]，提高患者智力水平。課題組在WD病程研究過程中發(fā)現(xiàn)，NSC是高銅負(fù)荷的重要靶點(diǎn)，肝豆靈能抵抗高銅導(dǎo)致的NSC生長阻礙，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5]。因此，本研究從動(dòng)物、分子水平，利用課題組前期體外建立的高銅培養(yǎng)NSC模型[6]，予以藥物“肝豆靈”干預(yù)，觀察胎鼠海馬組織NSC中ROS水平的高低，為探討肝豆靈對(duì)高銅誘導(dǎo)的NSC損傷小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及其分子機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 體重200～220 g SD大鼠75只，SPF級(jí)，由安徽動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(皖)2014-002。大鼠于專用清潔實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)1周，溫度25℃，相對(duì)濕度50%～70%，模擬自然晝夜循環(huán)光照的非直射光線。孕14 d ICR小鼠3只，適應(yīng)性喂養(yǎng)后取胚胎海馬組織，分離并培養(yǎng)NSC。

1.2 分組 SD大鼠隨機(jī)分組為對(duì)照組，模型組，肝豆靈處理高、中、低劑量組，用藥劑量根據(jù)成人每日使用劑量按照體表面積換算法換算，0.2 mL/10g體重灌胃，每日1次。對(duì)照組、模型組以等體積生理鹽水灌胃，兩組均連續(xù)給藥7 d。肝豆靈劑量0.0075 g/10g體重，每0.3 g溶于8 mL溶液，低劑量組為0.48 g/(kg·d)，中劑量組為0.96 g/(kg·d)，高劑量組為1.92 g/(kg·d)。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料、儀器與試劑 顯微剪、顯微鑷、45度顯微剪、線栓、普通刀柄、手術(shù)刀片、組織沖洗球，均由上海金粒器械公司提供；空調(diào)，海爾公司；濕度計(jì)，上海生工；純水機(jī)，Millipore公司；T臂迷宮，友誠生物科技有限公司。胰蛋白酶、DMEM/F12 (1：1)液體培養(yǎng)基，HyClone 公司；胎牛血清、無血清培養(yǎng)添加劑N2，Gibco；重組人表皮生長因子，Peprotech；重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子，Peprotech；噻唑藍(lán)，Amresco；二甲基亞砜，Sigma；ROS檢測(cè)試劑盒，ThermoScientific；Trizol試劑，Invitrogen；核蛋白提取試劑盒，Sigma公司，DU800紫外可見分光光度計(jì)，美國貝克曼；細(xì)胞培養(yǎng)箱2306-2，美國Shellab；倒置顯微鏡DMLL，德國徠卡；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)，美國LI-COR。

1.4 藥物 肝豆靈片。安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院研制，0.3 g/片，150片/盒，批號(hào)20150522。由石菖蒲、丹參、姜黃、莪術(shù)、郁金、黃連、大黃、金錢草等組成。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 行為學(xué)觀察

2.1.1 原理 在動(dòng)物心理學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究中，迷宮是常用的一種儀器，迷宮任務(wù)具有明顯的空間特征。在記憶類研究中，常用的是放射迷宮。T迷宮是依靠覓食動(dòng)機(jī)誘導(dǎo)動(dòng)物完成任務(wù)的一種迷宮實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)操作將大鼠放入迷宮的中央?yún)^(qū)域，然后在每個(gè)臂盡頭的小洞放一小塊食物，允許大鼠探究迷宮直到它收集到所有食物。適應(yīng)迷宮后，在兩條目標(biāo)臂中隨機(jī)選擇一條臂末端放入食餌，關(guān)閉另一條臂。將動(dòng)物放入起始箱，使其進(jìn)入目標(biāo)臂獲取食餌，連續(xù)訓(xùn)練一段時(shí)間后進(jìn)入正式實(shí)驗(yàn)。先是強(qiáng)迫訓(xùn)練，選擇一條臂開放并放入食餌，另一條臂關(guān)閉，當(dāng)動(dòng)物進(jìn)入有食餌的臂獲得獎(jiǎng)勵(lì)后，將其馬上放回主干臂，而后讓其自由探索左右兩臂，動(dòng)物若進(jìn)入無食餌的臂，記為一次“錯(cuò)誤次數(shù)”，反之為“正確次數(shù)”，重復(fù)測(cè)試多次。統(tǒng)計(jì)總的正確率越高，潛伏期越短，表明動(dòng)物工作記憶越好[7]。完成此任務(wù)大鼠需要依靠參照記憶、工作記憶[8]學(xué)會(huì)任務(wù)的規(guī)則。

2.1.2 方法 將大鼠放入起始箱，封閉閘門。打開閘門，大鼠進(jìn)入主干臂，關(guān)掉一側(cè)目標(biāo)臂，強(qiáng)迫大鼠進(jìn)入另一側(cè)開放臂，成功獎(jiǎng)勵(lì)2粒食丸，5 s內(nèi)把大鼠放回主干臂，進(jìn)行二次訓(xùn)練。開放兩個(gè)目標(biāo)臂，大鼠把兩前肢和至少兩后肢一只放于一個(gè)目標(biāo)臂，則算作完成“一次選擇”。大鼠折返回訓(xùn)練時(shí)進(jìn)入過的臂則獲得獎(jiǎng)賞4粒食丸，記錄一次正確選擇，進(jìn)入另一臂，沒有獎(jiǎng)賞，且將其限制在該臂內(nèi)10 s，記錄一次錯(cuò)誤選擇。訓(xùn)練結(jié)束后，將大鼠放回籠內(nèi)5～10 min(同時(shí)試驗(yàn)其他大鼠)，重復(fù)訓(xùn)練，每天8次。連續(xù)兩天正確選擇達(dá)15/16，開始試驗(yàn)。30 d后不達(dá)標(biāo)，則淘汰。記錄大鼠進(jìn)入電刺激區(qū)的時(shí)間(s)。

2.2 NSC分離、培養(yǎng)，ROS檢測(cè) 無菌條件下取孕14d ICR小鼠胚胎海馬組織，以胰蛋白酶解消化，放入含有0.7 mg/mL卵蛋白的DMEM/F12(1∶1)，機(jī)械吹散。在低溫條件下于2000 r/min離心細(xì)胞懸液5 min，后洗滌沉淀；重懸細(xì)胞，濃度5000～10000/mL，予以懸浮培養(yǎng)。存活細(xì)胞予免疫細(xì)胞化學(xué)檢查，以驗(yàn)證其是否都為Abcg2+的NSC。體外培養(yǎng)的NSC模型分為對(duì)照組、高銅模型組和高、中、低劑量肝豆靈片處理組。對(duì)照組在DMEM中加入10%的SD大鼠空白血清，模型組用含10%的SD大鼠空白血清銅負(fù)荷培養(yǎng)基(200μmol/L工作濃度)予以培養(yǎng)；肝豆靈低、中、高劑量組予以3種不同劑量配制的10%的肝豆靈藥物血清銅負(fù)荷培養(yǎng)基培養(yǎng)。運(yùn)用CellROXTM Deep Red Flow Cytometry AssayKit分離、收集、流式分選Agcg2+的NSC。5×105個(gè)/mL為各試驗(yàn)組檢測(cè)用細(xì)胞濃度。將CellROX Deep Red reagent(終濃度為500～1000 nmol/L)加入至樣本中，于37℃的條件下避光孵育30～60 min。于孵育末15 min內(nèi)，在每1 mL樣本中加1 mmol/L SYTOX Blue Dead CellStain solution 1 μL，進(jìn)行流式分析。于激發(fā)光波長405 nm處檢測(cè)SYTOX Blue Dead Cell Stain，于635 nm處檢測(cè)Cell ROX Deep Red reagent，并分別于450/50BP和665/40BP的濾光片處收集熒光發(fā)射光。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 行為學(xué)結(jié)果 造模前，各組進(jìn)入電刺激區(qū)的時(shí)間(s)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。治療7 d后，模型組和小劑量治療組的進(jìn)入電刺激區(qū)的時(shí)間(s)明顯增加，經(jīng)過藥物治療后，中、高劑量組進(jìn)入電刺激區(qū)的時(shí)間(s)明顯降低。結(jié)果見圖1，表1。

組別鼠數(shù)劑量/g/(kg·d)造模前治療7d空白對(duì)照組1514.37±2.8214.93±3.23模型組1515.42±2.8228.90±5.29△低劑量組150.4815.56±3.1830.54±5.72△中劑量組150.9616.12±4.4124.55±3.74△?高劑量組151.9215.07±4.4118.23±3.51#

注：與造模前比較，△P<0.01；與對(duì)照組比較，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，#P<0.01。

4.2 NSC中ROS水平檢測(cè)結(jié)果 模型組高于對(duì)照組(P<0.01)，肝豆靈組高于對(duì)照組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)。結(jié)果可見圖2，表2。

組別鼠數(shù)劑量/g/(kg·d)ROS空白對(duì)照組3100.0±0.0模型組3284.2±12.3?低劑量組30.48279.9±13.9?中劑量組30.96209.8±9.7?高劑量組31.92136.9±4.5

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01，模型組與肝豆靈組比較，*P<0.05。

5 小結(jié)

WD是基因缺陷引起的銅代謝障礙性疾病，銅離子沉積腦部過多產(chǎn)生神經(jīng)毒性，使神經(jīng)細(xì)胞受損凋亡，發(fā)為WD。銅在腦部沉積以殼核最為顯著[9]。方向等[10]發(fā)現(xiàn)銅負(fù)荷大鼠學(xué)習(xí)定位能力下降，存在明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙。韓輝等[5]發(fā)現(xiàn)，高銅可降低小鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)目。在ATP7B基因缺陷小鼠中，研究人員發(fā)現(xiàn)肝臟和腦部的呼吸鏈復(fù)合物I活性增加，而復(fù)合物II，III和IV活性則減弱。其中，呼吸鏈復(fù)合物I是線粒體產(chǎn)生ROS的主要來源[11]。銅離子促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Altman等[12]證實(shí)大腦具有神經(jīng)再生能力，腦組織中存在著的NSC[13]，可很長時(shí)間保持靜止?fàn)顟B(tài)，在大腦受到損傷時(shí)NSC會(huì)大量增生并向受損區(qū)域轉(zhuǎn)移替代，而ROS是調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的重要因素[14]。

WD的臨床表現(xiàn)主要有精神障礙、認(rèn)知下降、言語含糊、口涎不止、肝脾腫大、腹部水脹、肢體扭轉(zhuǎn)、震顫等，祖國醫(yī)學(xué)根據(jù)這些癥狀特點(diǎn)將WD歸于“肝風(fēng)”“積聚”“水腫”“痙病”“癲癇”“癡呆”“癲狂”“黃疸”“鼓脹”“癥瘕”“震顫”“瘈疭”等范疇。在發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)方面，中醫(yī)認(rèn)為，肝豆?fàn)詈俗冃韵迪忍旆A賦不足，或先天脾胃失養(yǎng)，或情志所傷，肝郁脾虛，或外感邪毒，銅毒內(nèi)積，濕熱蘊(yùn)生，痰瘀相結(jié)，癥積成形。楊文明等[15]認(rèn)為“銅毒”是WD發(fā)展過程中獨(dú)特的病理基礎(chǔ)，決定其發(fā)展方向。韓輝等[16]研究得出，WD發(fā)病前的證型為肝氣郁結(jié)證、濕熱內(nèi)蘊(yùn)證、痰瘀互結(jié)證、脾腎陽虛證、肝腎陰虛證。其中認(rèn)知障礙易出現(xiàn)于痰瘀互結(jié)型。我院腦病中心研制的院內(nèi)制劑肝豆靈片，由石菖蒲、郁金、丹參、姜黃、莪術(shù)、雞血藤、黃連、大黃組成。有利膽排銅、清熱解毒、化瘀軟堅(jiān)之效，石菖蒲開竅豁痰、醒神益智；黃連清熱瀉火解毒；郁金可利膽退黃、清心涼血；大黃，清熱瀉下，解毒利濕；姜黃、莪術(shù)與雞血藤，活血行氣；丹參活血祛瘀、清心除煩。王艷昕等[17]發(fā)現(xiàn)肝豆靈可減少海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，保護(hù)腦神經(jīng)?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，石菖蒲可抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡[18]，保護(hù)腦神經(jīng)。丹參提取物丹參酮ⅡA可減少caspase-3得表達(dá)實(shí)現(xiàn)其抗凋亡的機(jī)能，而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[19]。大黃可清除離體大鼠腦中的超氧自由基，抑制超氧化物歧化酶的生成，改善學(xué)習(xí)記憶功能。雞血藤可提升腦組織ATP酶活性，改善腦細(xì)胞代謝障礙[20]。黃連可提高機(jī)體抗氧化能力[21]，降低ROS，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。郁金、莪術(shù)、姜黃的提取物姜黃素也有抗氧化效應(yīng)[22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，銅負(fù)荷使小鼠NSC中ROS水平明顯上升，大鼠進(jìn)入電刺激區(qū)的時(shí)間明顯上升，經(jīng)肝豆靈干預(yù)后，中、高劑量組小鼠NSC中ROS水平明顯下降，大鼠進(jìn)入電刺激區(qū)時(shí)間明顯減少?？赏茰y(cè)，不同劑量的肝豆靈可通過降低NSC中的ROS水平，對(duì)NSC高銅負(fù)荷模型有一定的修復(fù)作用。董婷[4]認(rèn)為，肝豆靈是干擾了NSC中Nrf2的水平，降低了ROS，進(jìn)一步闡述了肝豆靈作用于NSC的作用機(jī)制。