TFCP2在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及對預(yù)后的影響

高艷飛，龔志平，李 玲，徐曉明，曹宇霏，桑梅香

(1.河北省承德市中心醫(yī)院檢驗科，河北 承德 067000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心，河北 石家莊 050011)

食管癌是一種具有高度侵襲性的惡性腫瘤，在組織學(xué)上可分為腺癌和鱗狀細(xì)胞癌，其中食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是主要病理類型，其病死率居惡性腫瘤的第7位[1]。然而，由于經(jīng)濟(jì)情況和飲食習(xí)慣，ESCC在中國惡性腫瘤病死率中居第4位[2]。由于ESCC與廣泛的淋巴轉(zhuǎn)移和血管浸潤密切相關(guān)，因此ESCC診斷時已為晚期，其5年生存率仍較低[3]。因此深入了解ESCC進(jìn)展的分子機(jī)制有利于早期診斷、確定治療策略和總體預(yù)后。轉(zhuǎn)錄因子CP2(transcriptional factor CP2,TFCP2)由位于染色體12q13(19，20)的TFCP2基因編碼[4]。TFCP2在許多細(xì)胞中表達(dá)，參與細(xì)胞周期、細(xì)胞生長發(fā)育等多種生物學(xué)過程[5]。TFCP2在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[6]。本課題組前期研究表明，TFCP2直接結(jié)合于MAGE-A11的啟動子區(qū)，并以甲基化依賴的方式調(diào)控MAGE-A11在ESCC的表達(dá)[7]。而TFCP2在ESCC中的表達(dá)情況及其與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系尚不明確。本研究采用免疫組織化學(xué)法檢測ESCC組織和癌旁組織中TFCP2蛋白的表達(dá)，并分析其與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2012年2月—2013年4月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院收治的食管癌患者80例，均為首次發(fā)病，手術(shù)前未行放療、化療和內(nèi)分泌治療。獲得手術(shù)切除的ESCC組織(原發(fā)腫瘤組織)和癌旁組織(距離癌組織5 cm以上經(jīng)病理檢測證實為正常的食管組織)。所有組織均包埋于石蠟中進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析。所有研究對象均為河北省及其周邊地區(qū)的漢族居民，獲取標(biāo)本均獲得病人或家屬的知情同意。一(或多個)一級或二級親屬患有食管癌/賁門癌/胃癌的被定義為具有上消化道腫瘤(upper gastrointestinal cancers, UGIC) 家族史。臨床病理特征的信息從醫(yī)院記錄和病理診斷中獲得。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果評價 4 μm石蠟包埋組織切片在二甲苯中脫蠟，通過分級酒精進(jìn)行水合。然后用磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.2)沖洗切片3次，每次5 min。將這些切片在微波爐中加熱5 min，在10 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH6.0)中修復(fù)抗原， PBS洗滌。將切片浸入0.3% H2O2中20 min，抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS沖洗后，切片置于正常山羊血清中常溫孵育45 min，防止非特異性免疫球蛋白結(jié)合。然后用小鼠抗TFCP2單克隆抗體(1∶200)(BD Biosciences，USA)4 ℃過夜。以正常IgG替代原抗體作為對照。試劑盒中的原液為生物素化的山羊抗鼠二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素，加DAB試劑顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，光鏡觀察。免疫組織化學(xué)染色以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，采用半定量積分法判斷結(jié)果，用Image J軟件對陽性細(xì)胞的表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行評分：陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分， 26%～50%為2分， 51%～75%為3分，≥76%為4分。染色強(qiáng)度分級如下:未染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分， 棕黃色為3分。將染色面積和染色強(qiáng)度得分進(jìn)行相乘， <4分為低表達(dá)，≥4分為高表達(dá)。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，采用Kaplan-Meier法分析ESCC患者的生存情況，Cox模型分析預(yù)后的影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1ESCC組織和癌旁組織中TFCP2蛋白高表達(dá)率比較 ESCC組織中的TFCP2蛋白高表達(dá)34例(圖1)，高表達(dá)率為42.5%，癌旁組織中的TFCP2蛋白高表達(dá)6例，高表達(dá)率為7.5%。ESCC組織中的TFCP2蛋白高表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=26.133,P<0.01)。

2.2不同臨床病理參數(shù)ESCC患者TFCP2蛋白高表達(dá)率比較 臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移ESCC患者TFCP2蛋白高表達(dá)率高于臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移ESCC患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；不同性別、年齡、上消化道腫瘤家族史、組織學(xué)分級和腫瘤大小ESCC患者TFCP2蛋白高表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測TFCP2蛋白在ESCC組織中的表達(dá)

A.×200;B.×400

Figure 1 Expressions of TFCP2 protein in ESCC tissues detected by immunohistochemistry

2.3TFCP2蛋白表達(dá)與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系 TFCP2蛋白高表達(dá)的ESCC患者總生存期顯著低于TFCP2蛋白低表達(dá)的患者(圖2)。以預(yù)后(存活=0，死亡=1)為因變量，以TFCP2蛋白表達(dá)(陰性=0，陽性=1)、臨床分期(Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無=0，有=1)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(無=0，有=1)為自變量進(jìn)行多因素Cox模型分析，結(jié)果顯示，TFCP2蛋白表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是ESCC患者預(yù)后的影響因素。見表2。

表1 不同臨床病理參數(shù)ESCC患者TFCP2 蛋白高表達(dá)率比較Table 1 Correlations of high expression of TFCP2 in ESCC tissuses with clinciopathological features (例數(shù)，%)

表2 ESCC患者5年生存率預(yù)后因素的多因素分析Table 2 Multivariate analysis of prognostic factors for 5 year survival in ESCC patients

圖2 ESCC患者總體生存率與TFCP2蛋白表達(dá)的Kaplan-Meier生存曲線

Figure 2 Kaplan-Meier survival curve of overall survival rate and TFCP2 expression in ESCC patients

3 討 論

長期以來，ESCC是世界上最常見的惡性腫瘤，中位生存時間<1年[8]。隨著早期診斷水平的提高和新技術(shù)的應(yīng)用，5年生存率顯著提高[9]。值得注意的是，內(nèi)鏡技術(shù)的應(yīng)用，包括內(nèi)鏡黏膜切除術(shù)、內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)和射頻消融術(shù)，改善了早期食管病變的預(yù)防和治療[10]。新輔助化療和放化療能提高ESCC患者的整體生存率。盡管有許多標(biāo)志物與ESCC的進(jìn)展有關(guān)，但臨床上尚無可靠的預(yù)后標(biāo)志物[11-16]。因此，尋找新的ESCC預(yù)后標(biāo)志物至關(guān)重要。

基因的表達(dá)受到嚴(yán)格且精細(xì)的調(diào)控，基因的激活或抑制在個體發(fā)育中起著重要作用。細(xì)胞的基因表達(dá)程序受表觀遺傳調(diào)控機(jī)制和序列特異性轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子通過與基因啟動子區(qū)的特定序列結(jié)合，促進(jìn)或抑制基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)異常影響細(xì)胞的多種生物學(xué)作用。在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中，轉(zhuǎn)錄因子異常表達(dá)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性。Chang等[17]報道，轉(zhuǎn)錄因子E2F8可通過CCND1/p21促進(jìn)ESCC增殖。Zhao等[18]研究表明，轉(zhuǎn)錄因子LEF1可促進(jìn)ESCC發(fā)展，并激活轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路。一些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。如KLF5過表達(dá)與胰腺癌的不良預(yù)后相關(guān)[19]。轉(zhuǎn)錄因子F2Fs過表達(dá)和肝癌患者的預(yù)后密切相關(guān)[20]。因此，調(diào)控或降解轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)是腫瘤靶向治療的策略之一。

TFCP2能調(diào)節(jié)多種細(xì)胞和病毒基因的啟動子，影響細(xì)胞周期進(jìn)程和細(xì)胞存活。TFCP2可以通過與Snail誘導(dǎo)的纖維連接蛋白啟動子結(jié)合參與上皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生發(fā)展[5]。研究表明，TFCP2通過轉(zhuǎn)錄上調(diào)骨橋蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶9和補(bǔ)體因子H和纖連蛋白1等來增強(qiáng)肝腫瘤血管生成，促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展[6]。宮頸癌人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)陽性細(xì)胞中高表達(dá)TFCP2，表明該蛋白可能參與TSG101基因啟動子的下調(diào)和HPV依賴性宮頸癌的發(fā)生[21]。TFCP2 在食管癌、肝癌、宮頸癌及結(jié)直腸癌等多種實體腫瘤中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，且其表達(dá)水平與腫瘤增殖水平呈正相關(guān)[6-7,21]。腫瘤中TFCP2高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[4-7,21]。

本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測TFCP2蛋白在ESCC組織的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TFCP2蛋白在ESCC組織中的高表達(dá)率為42.5%(34/80)，與TFCP2蛋白在其他腫瘤中的表達(dá)一致[22-23]。T臨床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移ESCC患者TFCP2蛋白高表達(dá)率高于臨床分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移ESCC患者(P<0.05或<0.01)；不同性別、年齡、上消化道腫瘤家族史、組織學(xué)分級和腫瘤大小ESCC患者TFCP2蛋白高表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。多因素Cox模型分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是ESCC患者預(yù)后的影響因素。這與一項研究結(jié)果相似，結(jié)直腸癌中TFCP2高表達(dá)與腫瘤大小、晚期AJCC分期和高Ki-67指數(shù)顯著相關(guān)[4]。

本研究結(jié)果提示，TFCP2蛋白陽性表達(dá)的ESCC患者總生存期顯著低于TFCP2蛋白陰性表達(dá)患者，提示TFCP2蛋白可作為ESCC預(yù)后不良的判斷指標(biāo)。將TFCP2蛋白表達(dá)、淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移納入Cox風(fēng)險回歸模型，結(jié)果顯示TFCP2表達(dá)是ESCC患者預(yù)后的影響因素。由此考慮TFCP2可能成為ESCC患者預(yù)測預(yù)后的理想標(biāo)志物。

綜上所述，TFCP2蛋白表達(dá)與ESCC發(fā)生發(fā)展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，TFCP2蛋白高表達(dá)與ESCC患者不良預(yù)后相關(guān)，可作為臨床評價ESCC預(yù)后的指標(biāo)。