不同RNA提取及反轉(zhuǎn)錄方法對(duì)環(huán)狀RNA聚合酶鏈反應(yīng)的影響

王建星，聶子元，董金輝，賈新菊

(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻喉一科，河北 石家莊 050000；2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院血液內(nèi)科，河北省血液病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050000；3.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北 石家莊 050000)

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)作為重要的非編碼RNA，在真核生物多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，參與包括腫瘤及心血管疾病在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展[1]。由于環(huán)狀RNA的閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)大大提高了其穩(wěn)定性，且其存在組織及疾病特異性，越來(lái)越多研究將環(huán)狀RNA作為疾病的潛在生物學(xué)標(biāo)志物[2-3]。前期研究發(fā)現(xiàn)circFLNA在喉鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)并且參與了癌細(xì)胞的遷移[4]。盡管環(huán)狀RNA普通存在真核生物中，但相對(duì)于線性RNA，如mRNA等，其在胞內(nèi)的豐度較低。此外，目前鑒定環(huán)狀RNA的方法主要是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)、Northernblot、原位雜交等，其中前兩種方法就必須基于完整且高質(zhì)量的總RNA[5]。且由于環(huán)狀RNA在細(xì)胞內(nèi)含量相對(duì)較低。因此有效提取高質(zhì)量的RNA成為研究環(huán)狀RNA先決條件。本研究通過(guò)不同總RNA提取方法及不同反轉(zhuǎn)錄引物得到的cDNA進(jìn)行環(huán)狀RNA擴(kuò)增，進(jìn)一步尋找可靠、省時(shí)、高效的環(huán)狀RNA擴(kuò)增手段，為基礎(chǔ)研究及臨床環(huán)狀RNA測(cè)定提供幫助。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng) 人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep2細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院耳鼻喉一科保存。Hep2細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的RIPM1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，放于溫度為37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。每1～2 d觀察細(xì)胞形態(tài)及密度，進(jìn)行傳代并放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2miRNeasy Mini試劑盒提取總RNA 根據(jù)miRNesay Mini Kits(Qiagen)操作手冊(cè)進(jìn)行。具體如下，向1×107個(gè)Hep2細(xì)胞中加入1 mL QIAzol裂解液，室溫放置5 min，加入200 μL氯仿劇烈震蕩15 s，室溫靜置2～3 min，4 ℃ 12 000 g離心15 min，將上層清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的EP管中，加入1.5倍體積的無(wú)水乙醇，混勻。吸取700 μL樣本轉(zhuǎn)移到miRNeasy Mini 柱內(nèi)，室溫8 000 g離心15 s，棄掉收集管中的液體。向離心柱內(nèi)加入700 μL的Buffer RWT，8 000 g離心，15 s，棄濾液。吸取500 μL的Buffer RPE于離心柱內(nèi)，8 000 g離心15 s，棄濾液。吸取500 μL的Buffer RPE于離心柱內(nèi)，8 000 g離心2 min，棄濾液。將miReasy Mini柱轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL EP管內(nèi)。于柱內(nèi)加入40 μL DEPC水，室溫12 000 g離心1 min，得到的RNA溶液用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3Trizol抽提法提取總RNA方法 向1×107個(gè)Hep2細(xì)胞中加入1 mL Trizol抽提裂解液，充分混勻，室溫靜置5 min，加入200 μL氯仿劇烈震蕩15 s，靜置2 min；4 ℃ 12 000 g離心15 min，取上清500 μL，并在上清中加入500 μL異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10 min。4 ℃ 12 000 g離心10 min，棄上清。加入1 mL 75%的DEPC-乙醇，洗滌沉淀。4 ℃ 8 000 g離心5 min，棄上清，可見白色RNA沉淀，濾紙吸干沉淀物，40 μL DEPC水溶解RNA沉淀，RNA溶液用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4RNA濃度及質(zhì)量檢測(cè) 使用Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度、RNA純度由OD260/280,OD260/230進(jìn)行判讀，具體如下：Nanodrop 2000用2 μL DEPC水調(diào)準(zhǔn)基線，取2 μL不同方法提取的總RNA溶液，讀取RNA濃度，OD260/280及260/230比值，比值在1.8～2.0范圍內(nèi)證明RNA純度高，達(dá)到下一步實(shí)驗(yàn)的要求。

1.5反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和過(guò)程 使用5 μg不同方法提取的Hep2細(xì)胞的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，依據(jù)M-MLV First Strand Kit操作手冊(cè)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系為20 μL。具體如下：0.2 mL微量離心管中加入總RNA 2 μg，通用引物1 μL或隨機(jī)引物1 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL，后用DEPC水將體系補(bǔ)足至12 μL；65 ℃變性5 min，迅速置于冰上冷卻;短暫離心后分別加入4 μL的5×第一鏈合成緩沖液、2 μL 0.1 mmol/L DTT和1 μL RNaseOUT核酸酶抑制劑，離心混勻，置于PCR反應(yīng)儀中37 ℃孵育2 min，隨后常溫下加入1 μL M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)，離心混勻。重新放回PCR儀中，預(yù)設(shè)程序37 ℃反應(yīng)50 min，接著70 ℃處理15 min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，最后4 ℃冷卻。制備的cDNA -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR) Realtime PCR反應(yīng)在QuantStudioTM7 Flex Realtime，PCR System(Applied Biosystems，美國(guó))上進(jìn)行，反應(yīng)體系為20 μL。cDNA按照1∶10稀釋，反應(yīng)體系如下：SYBR Green qPCR預(yù)混液10 μL，模板DNA 2 μL，上下游因?yàn)楦? μL，無(wú)RNA酶水7 μL，離心混勻后，按照如下反應(yīng)條件，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)：上游引物，下游引物，無(wú)RNA酶水7μL，離心混勻后，進(jìn)行PCR反應(yīng)。相對(duì)定量法采用比較Ct法，以線性GAPDH作為內(nèi)參，采用△Ct(Ct目的-Ct內(nèi)參)法進(jìn)行相對(duì)定量分析，用2-△Ct計(jì)算所得值作為目的RNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如下：circFLNA-F:CCAGCTGAGGCTCTACC-GTGCC; circFLNA-R:GAGGCGTCAGCATCCC-CAACAG；circHIPK3-F:TGGAGACTGGGGGA-AGATGA;circHIPK3-R:CACACTAACTGGCT-GAGGGG。

1.7瓊脂糖凝膠電泳 配置1.5%瓊脂糖凝膠，取上述PCR產(chǎn)物5 μL，120 V 30 min進(jìn)行電泳，用凝膠成像儀成像取圖，檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1miRNeasy Mini試劑盒法與Trizol抽提法提取細(xì)胞總RNA的濃度及總量比較 用miReasy Mini試劑盒法與Trizol抽提法分別提取1×107Hep2細(xì)胞中的總RNA，Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和計(jì)算RNA總質(zhì)量。Trizol抽提法提取的總RNA的濃度為總質(zhì)量均高于miRNeasy Mini試劑盒法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

2.2miRNeasy Mini試劑盒法與Trizol抽提法提取細(xì)胞總RNA的純度比較 用miReasy Mini試劑盒法與Trizol抽提法提取1×107個(gè)Hep2細(xì)胞總RNA，Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的A260/280及A260/A230。兩種提取試劑盒法提取的總RNA的A260/A280，A260/A230比值均在1.8～2.0，表明所得的RNA純度比較高，而miReasy Mini方法提取的總RNA的A260/A280，A260/A230更接近2.0，說(shuō)明RNA純度更高，所含雜質(zhì)含量較少。兩種方法提取的總RNA的純度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

方法 RNA濃度(mg/L)RNA總量(μg)Trizol抽提法 1 160.000±33.4604.772±0.042miRNeasy Mini試劑盒法 924.000±22.8703.696±0.091t值 10.08618.595P值 <0.001<0.001

方法 A260/A280A260/A230Trizol抽提法 1.893±0.0091.807±0.031miRNeasy Mini試劑盒法2.043±0.0262.010±0.006t值 6.3129.098P值 <0.001<0.001

2.3隨機(jī)引物及通用引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄對(duì)對(duì)環(huán)狀RNA擴(kuò)增的影響 miReasy Mini試劑盒法與Trizol抽提法提取總RNA，2 μg RNA分別利用隨機(jī)引物及通用引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，普通聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增circHIPK3及circFLNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，利用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，可順利擴(kuò)增出circHIPK3及cirFLNA，而通用引物反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA進(jìn)行PCR，circHIPK3及circFLNA均不能被擴(kuò)增，見圖1。

圖1 隨機(jī)引物及通用引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄對(duì)對(duì)環(huán)狀RNA擴(kuò)增的影響

A.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)circHIPK3的表達(dá)；B.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)circFLNA的表達(dá)

Figure 1 Effects of Random primers and oligodT primers on the amplification of circular RNA

2.4不同方法提取總RNA對(duì)環(huán)狀RNA實(shí)時(shí)定量PCR相對(duì)表達(dá)量的影響 利用miReasy Mini試劑盒法與Trizol抽提法提取總RNA，2 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄引物為隨機(jī)引物，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)circHIPK3及circFLNA在Hep2細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量，以線性GAPDH作為內(nèi)參，miReasy Mini試劑盒法提取總RNA后circHIPK3相對(duì)GAPDH的CT值為 -(9.717±0.166)，circFLNA相對(duì)GAPDH的CT值為 -(11.69±0.213)，Trizol抽提法提取總RNA circHIPK3相對(duì)GAPDH的CT值為 -(11.67 0.079)，circFLNA相對(duì)GAPDH的CT值為 -(12.5±0.249)，miReasy Mini試劑盒提取方法總RNA進(jìn)行PCR所得的circHIPK3及circFLNA相對(duì)表達(dá)明顯高于Trizol抽提法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

方法 circHIPK3circFLNATrizol抽提法 -(11.670±0.079)-(12.500±0.249)miRNeasy Mini試劑盒法-(9.717±0.166)-(11.690±0.213)t值 23.7168.798P值 <0.001<0.001

3 討 論

目前很多的研究指出，生命的本質(zhì)也可能由RNA所決定。除了經(jīng)典的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)，信使RNA(mRNA)和核糖體RNA(rRNA)之外，越來(lái)越多類型的RNA被發(fā)現(xiàn)，包括微小RNA(miRNAs)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)，小干擾RNA(siRNAs)和其他非編碼的RNA，而RNA多樣的生物學(xué)功能也逐漸被揭示[6]。環(huán)狀RNA是一類廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)具有多種生物學(xué)功能的內(nèi)源性非編碼RNA[7]。在20世紀(jì)70年代，環(huán)狀RNA首先被當(dāng)做類病毒的遺傳物質(zhì)在植物中被發(fā)現(xiàn)，隨后的研究表明環(huán)狀RNA可以存在于多種生物體內(nèi)，包括真核生物、酵母菌、病毒、四膜蟲等。但當(dāng)時(shí)觀點(diǎn)認(rèn)為，環(huán)狀RNA可能是由于前體mRNA錯(cuò)誤剪切形成的，含量較少，作為RNA垃圾，可能并沒(méi)有實(shí)際意義，因此未能引起足夠重視[8-9]。

隨著聚合酶鏈反應(yīng)及RNA測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，越來(lái)越多環(huán)狀RNA被鑒定并賦予新的意義。Barrett等[10]首先證實(shí)了前體mRNA的環(huán)化特征，指出環(huán)狀RNA是由mRNA前體經(jīng)反向剪接產(chǎn)生的環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本，并確定其在正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮相應(yīng)作用。目前研究證實(shí)，環(huán)狀RNA不同于其他非編碼RNA，主要來(lái)源于蛋白質(zhì)編碼的外顯子，通過(guò)剪接體作用減去前體mRNA中的內(nèi)含子，同時(shí)下游的5′剪接位點(diǎn)與上游的3′剪接位點(diǎn)含有互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，通過(guò)共價(jià)鍵連接形成外顯子環(huán)狀RNA[11]。此外，也有研究證實(shí)，內(nèi)含子，非編碼區(qū)及不連續(xù)的外顯子也可能通過(guò)其他形式形成環(huán)狀RNA[12]。另外，包括RNA結(jié)合蛋白驅(qū)動(dòng)及套索驅(qū)動(dòng)模式也被證實(shí)在環(huán)狀RNA環(huán)化中起了一定作用[13]。由于環(huán)狀RNA不含有5′端的帽子結(jié)構(gòu)及3′端的PolyA尾，不容易被RNA酶結(jié)合，因此其表達(dá)穩(wěn)定不易破壞。研究證實(shí)，環(huán)狀RNA的半衰期超過(guò)48 h，較其線性的mRNA明顯增長(zhǎng)。由于環(huán)狀RNA的特性及越來(lái)越多的功能被發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA也稱為多種疾病的分子標(biāo)志。通過(guò)高通量測(cè)序的方法，孔德沛等[3]在喉鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)302種環(huán)狀RNA上調(diào)，有396中環(huán)狀RNA下調(diào)，提示著環(huán)狀RNA可能參與了喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

此外，環(huán)狀RNA顧名思義是一個(gè)閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，與線性的mRNA不同，環(huán)狀RNA不存在5′端帽子和3′端的PolyA尾，因此RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA過(guò)程中的引物選擇過(guò)程中不能使用與PolyA互補(bǔ)結(jié)合通用引物，而是使隨機(jī)引物或特定基因的特異性引物。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)利用通用作為反轉(zhuǎn)錄引物時(shí)，不能擴(kuò)增出目的環(huán)狀RNA，原因是由于環(huán)狀RNA沒(méi)有3′ PolyA尾，通用引物不能識(shí)別環(huán)狀RNA，而將隨機(jī)引物作為反轉(zhuǎn)錄引物后能順利擴(kuò)增出所需要的環(huán)狀RNA。

雖然高通量測(cè)序是目前批量鑒定環(huán)狀RNA的理想方法，但該方法成本較高，周期長(zhǎng)。而且測(cè)序結(jié)果仍需要通過(guò)PCR進(jìn)一步驗(yàn)證。盡管環(huán)狀RNA普遍存在于真核生物中，但其在胞內(nèi)的豐度仍比較低。此外，目前最常用的鑒定方法仍然是PCR、Northern blot，這2種方法都必須基于完整RNA[14]。因此，有效提取高質(zhì)量的RNA成為研究環(huán)狀RNA先決條件。本研究通過(guò)對(duì)比Trizol抽提法和miReasy Mini試劑盒法2種總RNA，發(fā)現(xiàn)用傳統(tǒng)Trizol抽提提取的RNA濃度要高于miReasy Mini試劑盒提取的。原因之一是，Trizol抽提方法是利用核酸沉淀原理，基本上能將所有的RNA沉淀下來(lái)，因此其RNA濃度較高，但也因?yàn)樵摲椒?，除了RNA之外，還有部分其雜質(zhì)被沉淀下來(lái)，如蛋白質(zhì)或DNA等；而試劑盒是利用膜與RNA的結(jié)合方式進(jìn)行分離，該膜與RNA結(jié)合受到量的限制，當(dāng)RNA過(guò)量時(shí)，膜的結(jié)合能力有限達(dá)到飽和，所以該方法分離到的RNA濃度相對(duì)Trizol抽提方法的要低[15]。同樣，利用膜分離的方法可以排除其他雜質(zhì)的影響，在提取RNA過(guò)程中，不能與膜結(jié)合的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)和DNA就被洗掉，因?yàn)閙iRNeasy Mini試劑盒提取到的RNA純度較高。雖然環(huán)狀RNA較線性RNA穩(wěn)定，它不容易受RNA外切酶的消化，但仍然屬于RNA，易受無(wú)處不在的RNA酶消化而降解。因此，所提取出來(lái)的RNA純度對(duì)環(huán)狀RNA的穩(wěn)定性影響較大。Trizol抽提法提取的RNA濃度雖高，但雜質(zhì)較多，總RNA降解速度快，而miRNeasy Mini試劑盒提取的RNA純度高，降解較慢。此外，絕大部分環(huán)狀RNA均為長(zhǎng)鏈RNA，容易被膜結(jié)合方式分離，所以用相同量的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)，經(jīng)試劑盒提取的RNA，其中環(huán)狀RNA的比例相對(duì)高，間接地提高了環(huán)狀RNA的比例，因此，在低豐富的環(huán)狀RNA中，miRNeasy Mini試劑盒提取到的RNA更容易被鑒定出來(lái)。

但是本研究?jī)H局限于喉鱗狀細(xì)胞癌Hep2細(xì)胞株對(duì)不同RNA提取方法及不同反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR效果差異分析，可能存在一定局限性，應(yīng)該在更多不同類型細(xì)胞、不同細(xì)胞和不同組織樣本進(jìn)行更進(jìn)一步研究以尋找出環(huán)狀RNA擴(kuò)增最為有效、經(jīng)濟(jì)的方法。

綜上所述，應(yīng)用miRNeasy Mini試劑盒法提取總RNA純度更高，更有利于環(huán)狀RNA的擴(kuò)增，利用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而非通用引物，可順利擴(kuò)增出環(huán)狀RNA，為環(huán)狀RNA的進(jìn)一步研究提供了省時(shí)、高效、穩(wěn)定的擴(kuò)增方案。