低滲溶液促進小麥種子萌發(fā)的生理機制

馮 岳，魏永勝，馮 浩

(1.西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西楊凌 712100；2.中國科學院 植物研究所光生物學重點實驗室 100093；3.中國科學院大學 生命科學學院，北京 100049；4.西北農(nóng)林科技大學 國家節(jié)水灌溉楊凌技術研究中心，陜西楊凌 712100)

種子引發(fā)(Seed priming)是一種基于種子萌發(fā)的生物學技術手段[1]，由Heydecker于1973年最早提出[2]，經(jīng)由特定預處理方法使種子緩慢吸水，確保種子萌發(fā)的代謝活動順利進行，進而提升種子活力，其目標是提高種子的萌發(fā)率，并且能增加萌發(fā)穩(wěn)定率和萌發(fā)整齊度，進而增加苗的抗性并改良營養(yǎng)狀況。近年來，種子引發(fā)相關技術對植物的大量研究成果已在農(nóng)業(yè)貿(mào)易生產(chǎn)上取得成功運用[3-4]。

常見的引發(fā)方法有水引發(fā)[5-6]，無機鹽引發(fā)如KCl和CaCl2[7]，有機物引發(fā)如PEG 6000[8]，甚至是納米材料如納米銀(Silver nanopaticale，AgNPs)[9]等，引發(fā)技術現(xiàn)已應用于小麥[7,10]、玉米[3]、水稻[8,11]、番茄[12]、豆類[13]及煙草[14]等作物。如，水引發(fā)處理水稻種子可以使萌發(fā)時間縮短26.8 h，苗高增加為對照的1.2倍，干質(zhì)量增加至對照的1.3倍[11]。盡管引發(fā)作為一項農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術已經(jīng)被廣泛使用，但機理研究并不深入。一般認為水引發(fā)或適度的滲透溶液引發(fā)可使種子通過了類似的“逆境鍛煉”[15]，給予種子更充分的機會修復細胞膜，提高種子的淀粉酶活力[9]，促進種子代謝，提高種子的保護酶活性[8]，促進DNA修復[16]，增加水孔蛋白表達[17]等。但上述研究未能解釋為什么適度的滲透溶液引發(fā)的效果優(yōu)于純水引發(fā)，是否在純水中引發(fā)時吸水過快會造成細胞原生質(zhì)膜的機械損傷，適度滲透溶液引發(fā)處理是促進膜修復還是減輕快速吸水造成的機械損傷等問題。

本研究切入點為確定小麥種子最佳的引發(fā)條件，從引發(fā)過程中小麥種子物理與生理生化兩個方面的變化去揭示引發(fā)的機制，以揭示為什么輕微滲透脅迫的引發(fā)處理優(yōu)于純水或高滲透溶液，進一步揭示引發(fā)的機制，為科學利用引發(fā)技術提高作物產(chǎn)量、改善品質(zhì)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以小麥品種‘小偃22’(TriticumaestivumL.)的陳種子(購于2015年)為材料，以NaCl(分析純，西安化學試劑廠)為引發(fā)劑。選用陳種子作為材料是因為其更能反映引發(fā)的效果[18]。經(jīng)TTC法測定，種子活力為(81.0± 3.35)%。

1.2 試驗設計

1.2.1 引發(fā)效應的確認 分別以純水(0 MPa)和水勢為-0.1、-0.3、-0.5、-0.7、-0.9、 -1.2 MPa NaCl溶液引發(fā)處理小麥種子，以證明引發(fā)現(xiàn)象存在并確定最佳的引發(fā)條件。小麥種子經(jīng)75%酒精消毒，置于室溫(15.5±2.0)℃下，在相應的NaCl溶液中避光浸泡12 h，取出后拭干水分并避光風干24 h作為引發(fā)處理，然后進行萌發(fā)試驗。萌發(fā)試驗取引發(fā)處理后的種子各50粒，置于鋪有2層濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，加無菌水5 mL，在(20.5±2.0)℃恒溫培養(yǎng)箱(KRC-100CL，上海齊欣科學儀器公司)中避光培養(yǎng)，每24 h補充無菌水5 mL并統(tǒng)計發(fā)芽粒數(shù)，以胚根突破種皮，長度為0.5 cm時為萌發(fā)，發(fā)芽種子移出培養(yǎng)皿。連續(xù)7 d無種子萌發(fā)時終止萌發(fā)試驗。每個處理5次重復(共250粒)。以經(jīng)過活力調(diào)整的萌發(fā)率為萌發(fā)指標：G=Ng/(Nt·Vi)×100%

式中：G為萌發(fā)率(%)；Ng為試驗期內(nèi)累計萌發(fā)種子數(shù)；Nt為每個培養(yǎng)皿中供試種子數(shù)；Vi為TTC法測定的小麥種子活力。

1.2.2 NaCl引發(fā)的生理機制 (1)建立吸水曲線：取未經(jīng)引發(fā)的干種子、經(jīng)純水(0 MPa)、-0.3及-0.7 MPa NaCl溶液引發(fā)處理的種子分別放入5個培養(yǎng)皿中，加5 mL純水(每皿50粒，每個處理5個重復共250)，置于(20.5±2.0)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在0、6、12、24、36、48、72和96 h稱量，記錄質(zhì)量，稱量前拭干水分，稱量后放回培養(yǎng)皿。以相對質(zhì)量(吸水后質(zhì)量÷吸水前的初始質(zhì)量)對吸水時間作圖。

(2)生理指標測定：種子細胞膜相對透性、MDA質(zhì)量摩爾濃度、可溶性蛋白、α-淀粉酶活性及總淀粉酶活性等生理指標測定參考高俊鳳[19]主編的《植物生理學實驗指導》。以未經(jīng)引發(fā)的種子作為對照，以0、-0.3和-0.7 MPa NaCl溶液引發(fā)的種子(風干24 h后)為處理測定相關生理指標。測定設5個重復，每個重復25粒。

(3)對比KCl引發(fā)：將經(jīng)純水(0 MPa)、-0.3及-0.7 MPa NaCl溶液引發(fā)處理的種子與經(jīng) -0.3及-0.7 MPa KCl溶液引發(fā)處理的種子分別放入5個培養(yǎng)皿中(每皿50粒，每個處理5個重復共250)，加5 mL純水，置于(20.5±2.0)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h補充無菌水5 mL并統(tǒng)計發(fā)芽粒數(shù)，記錄萌發(fā)進程，以初步探究K+、Na+對引發(fā)產(chǎn)生的不同效應。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel對數(shù)據(jù)分析并作圖，并利用Chapman 3-parameter模型對萌發(fā)曲線進行擬合，計算萌發(fā)率達到50%所需要的時間 t50，以及萌發(fā)率達到5%所需要時間 t5 (因為試驗每個重復為50粒，故以有2粒以上種子萌發(fā)時刻作為萌發(fā)的啟動時間)。利用R軟件進行統(tǒng)計分析，進行差異顯著性檢驗。文中數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示，插圖中的誤差棒均為標準誤。

2 結果與分析

2.1 低濃度NaCl引發(fā)處理下小麥種子萌發(fā)情況

不同水勢的NaCl溶液引發(fā)處理對小麥種子萌發(fā)率的影響有顯著差異(圖1)。最終萌發(fā)率(吸水192 h)在-0.3 MPa處理下最高，為 (89.2±3.9)%，0～-0.3 MPa之間隨著水勢下降而升高，而-0.3～-1.2 MPa則隨水勢降低而降低，在-0.7 MPa萌發(fā)率開始低于50%。因此，后續(xù)試驗中以純水，-0.3 MPa(最佳)和 -0.7 MPa(<50%)的NaCl溶液引發(fā)處理種子進行研究，以未引發(fā)的干種子為對照(CK)。

從萌發(fā)的進程看，純水引發(fā)處理的種子萌發(fā)啟動時間(萌發(fā)率5%)較-0.3和-0.7 MPa NaCl溶液處理的種子分別早2.47和22.67 h，萌發(fā)率達到50%所需時間比-0.3 MPa NaCl溶液處理早4.05 h，但萌發(fā)率在120 h后開始低于 -0.3 MPa引發(fā)處理的種子直至試驗結束。而 -0.7 MPa NaCl溶液引發(fā)處理的種子最終萌發(fā)率低于50%，且萌發(fā)啟動遲緩。

2.2 NaCl引發(fā)處理對小麥種子吸水過程的影響

試驗中種子吸水過程依據(jù)吸水速率可分為快、慢、快3個時期，第一個時期為0～24 h，吸水曲線平均斜率為(1.62±0.28)×10-2(表1)；第二個時期為24～72 h，斜率為(0.76±0.11) ×10-2；第三個時期為72～96 h，斜率為(1.21± 0.02) ×10-2。在吸水初期(0～24 h)，與未經(jīng)引發(fā)處理的種子相比，無論是純水還是-0.3和 -0.7 MPa NaCl溶液引發(fā)處理，其吸水速率均較低(圖2)。但24和48 h后，純水和-0.3 MPa引發(fā)處理的種子吸水速率先后超過未引發(fā)的種子，而-0.7 MPa NaCl溶液引發(fā)處理的種子吸水速率全程處于最低水平。與純水引發(fā)相比，-0.3 MPa引發(fā)處理的種子吸水初期吸水速率較低，但24 h后二者相近，但吸水量后者始終低于前者。經(jīng)純水、-0.3和-0.7 MPa引發(fā)處的種子到達相對質(zhì)量150%所用時間分別為23.6、37.6和53.8 h。

實線為不同水勢溶液中種子萌發(fā)過程的擬合曲線，不同的點為實測值

Solid line in the figure is the fitting curve of seed germination process in different water potential solutions.The different points are measured values

圖1 低濃度NaCl引發(fā)處理小麥種子的萌發(fā)率
Fig.1 Promotion of wheat seed germination under treatment of hypoosmotic NaCl priming

表1 不同引發(fā)條件小麥種子吸水速率(斜率)變化Table 1 Changes in water absorption (slope ) of wheat seeds during different germination periods under different priming conditions

注：數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05).Duncan’s法多重比較。下同。

Note：Different lowercase letters show significant difference in table(P<0.05).Duncan’s method multiple comparison.The same below.

虛線表示相對質(zhì)量為150%

Dotted line indicates relative mass of 150%

圖2 不同引發(fā)處理的小麥種子吸水過程
Fig.2 Water absorption process of wheat seeds under different priming treatments

2.3 適度NaCl引發(fā)處理對小麥種子膜完整性的影響

經(jīng)-0.3 MPa NaCl溶液處理的種子其MDA質(zhì)量摩爾濃度(圖3-A)和相對電導率(圖3-B)均顯著低于其他處理，而經(jīng)-0.7 MPa 處理的種子其MDA質(zhì)量摩爾濃度與未經(jīng)處理和純水引發(fā)的種子差異不顯著，但相對電導率顯增加，表明純水對萌發(fā)中的種子的傷害可能更多地來源于機械損傷，如膜撕裂，而不是化學因素造成的傷害。同理，與-0.3 MPa NaCl溶液處理相比，未引發(fā)種子和純水引發(fā)后的種子中MDA質(zhì)量摩爾濃度和相對電導率均上升，且未引發(fā)種子的細胞膜相對透性顯著高于-0.3 MPa NaCl溶液處理，同樣表明種子在純水中萌發(fā)會傷害細胞膜，且主要是機械傷害。

2.4 NaCl引發(fā)處理對小麥種子可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)的影響

與未經(jīng)引發(fā)的種子相比，經(jīng)過引發(fā)后的種子其可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)顯著增加(圖3-C)。經(jīng) -0.3 MPa NaCl溶液處理后其可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)顯著高于未經(jīng)引發(fā)的種子和純水引發(fā)的種子，高于-0.7 MPa處理，但差異不顯著。但同樣處理的種子由另一獨立小組測定的結果與本試驗中結果有相同變化趨勢(結果未公開)，因此，-0.3 MPa NaCl溶液處理后可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)高于-0.7 MPa處理的結果也是肯定的。分析萌發(fā)數(shù)據(jù)，可以推定這些增加的可溶性蛋白更多的是與萌發(fā)相關的功能性蛋白，而不是類似于 -0.7 MPa處理后脅迫蛋白。究竟是哪些相關蛋白增加，有待于通過蛋白組學研究來揭示。

圖中柱上不同小寫字母表示處理間差異達5%顯著水平

Different lower-case letters indicate statistically significant difference under different treatments (P<0.05)

圖3 不同引發(fā)條件下小麥種子的丙二醛質(zhì)量摩爾濃度(A)、相對電導率(B)、可溶性蛋白質(zhì)量分數(shù)(C)
Fig.3 Malondialdehyde molality，relative electrical conductivity and soluble protein fraction in wheat seeds under different priming conditions

2.5 NaCl引發(fā)處理對小麥種子淀粉酶活力的影響

萌發(fā)過程中，種子中的α-淀粉酶活性(圖4-A)和總淀粉酶活性(α-淀粉酶和β-淀粉酶活性之和)(圖4-B)均隨萌發(fā)時間的延續(xù)而增加。萌發(fā)率與同期α-淀粉酶和總淀粉酶活性的相關性分別為0.73和0.74，而與前24 h α-淀粉酶和總淀粉酶活性的相關性分別為0.75和0.77。表明萌發(fā)率與淀粉酶活性相關，但更多地受萌發(fā)前的淀粉酶活性影響，尤其是β-淀粉酶活性。成對t檢驗結果(表2)顯示，純水引發(fā)與未經(jīng)引發(fā)種子的α-淀粉酶活性差異不顯著，但總淀粉酶活性的差異達到極顯著水平。表明純水引發(fā)主要是提高了β-淀粉酶活性，而非α-淀粉酶活性。-0.3 MPa引發(fā)處理的種子的α-淀粉酶顯著高于其他處理，但總淀粉酶活性與純水處理間無差異。表明適當鹽脅迫處理可以提高α-淀粉酶活性，促進萌發(fā)。而-0.7 MPa引發(fā)處理的種子的α-淀粉酶和總淀粉酶活性均較低，這可能是萌發(fā)率低的原因之一。

圖4 引發(fā)后的小麥種子的淀粉酶活性在萌發(fā)過程中淀粉酶活性的變化Fig.4 Amylase activity of wheat seeds during germination of seeds after different priming conditions

2.6 NaCl和KCl分別引發(fā)處理對小麥種子萌發(fā)進程的影響

為進一步確認-0.3 MPa NaCl溶液處理可提高小麥種子萌發(fā)率的原因，對同為-0.3 MPa 的NaCl和KCl溶液的引發(fā)效果進行比較，結果(圖5)顯示，2種鹽溶液都在-0.3 MPa引發(fā)處理下最終萌發(fā)率最高，但是從整個萌發(fā)過程來看，-0.3 MPa KCl引發(fā)處理的種子在萌發(fā)初期即表現(xiàn)出相對較好的萌發(fā)活力，且最高萌發(fā)率大于純水處理，而-0.3 MPa NaCl引發(fā)處理的種子是在中后期萌發(fā)率超過純水處理，達到最高萌發(fā)率相對較晚。這表明引發(fā)處理不僅是水勢降低的效果(滲透脅迫)，也會受引發(fā)劑性質(zhì)的影響，本試驗中K+效果會優(yōu)于Na+。

表2 不同引發(fā)處理對淀粉酶活性影響的顯著性對比Table 2 Significant comparison of effects of different priming treatments on amylase activity

注：**：差異極顯著(P≤0.01)，*：差異顯著(0.01

Note：**:Extremely significant(P≤0.01), *:Significant(0.01

圖5 NaCl和KCl分別引發(fā)處理的小麥種子萌發(fā)進程Fig.5 Germination processes of wheat seeds primed by NaCl and KCl

3 討 論

本研究中，經(jīng)不同水勢NaCl溶液處理后的小麥種子最終萌發(fā)率存在顯著差異，適度的低水勢溶液(-0.3 MPa)處理的種子萌發(fā)率最高，確認了引發(fā)現(xiàn)象的存在。但與純水處理的種子相比，萌發(fā)啟動晚(圖1)。其他研究也表明這種適度的低水勢溶液處理種子萌發(fā)率高，而且后期出苗整齊，抗性增強[9,20]，這也正是種子引發(fā)技術在生產(chǎn)中得到廣泛應用的原因。但適度的低水勢溶液(-0.3 MPa)處理的種子萌發(fā)啟動晚，但后期萌發(fā)速率快的現(xiàn)象未見報道。

引發(fā)處理可以改善種子的吸水量進而影響種子的萌發(fā)率[21]，干種子內(nèi)部襯質(zhì)勢較高，吸脹速率過快，可能會對細胞膜產(chǎn)生傷害[6]，引發(fā)處理被認為可以緩解這種損傷，并有利于膜系統(tǒng)修復[22]。細胞膜脂質(zhì)過氧化可導致MDA質(zhì)量摩爾濃度的上升，并進一步傷害膜[23]，若膜損傷以機械撕裂為主，則透性增加會更為突出。本試驗結果顯示，與未經(jīng)引發(fā)處理的種子相比，純水和 -0.3 MPa NaCl溶液引發(fā)處理的種子吸水速率在24和48 h后分別超過未經(jīng)引發(fā)處理的種子，這可能與吸水初期較慢的吸水速率使得使膜受到較少傷害或得到一定修復，并增加水孔蛋白表達有關。由于純水和-0.3 MPa NaCl溶液引發(fā)的種子中MDA質(zhì)量摩爾濃度(圖3-A)和細胞膜相對透性(圖3-B)均低于未經(jīng)引發(fā)處理的種子。純水引發(fā)與-0.3 MPa NaCl溶液引發(fā)相比，后者吸水速率(表1)和吸水量均低于前者(圖2)，萌發(fā)啟動晚(圖1)，但最終萌發(fā)率最高。表明吸水多并不一定萌發(fā)率高。而且純水引發(fā)的種子不僅是細胞膜相對透性增加，且MDA產(chǎn)生量較 -0.3 MPa引發(fā)處理后的種子更高，說明-0.3 MPa NaCl溶液引發(fā)處理后種子的膜破壞性最小或修復得更好。這與部分學者的研究相吻合，肖雪峰等[24]的研究發(fā)現(xiàn)PEG能通過滲透作用有效改善植物細胞膜的滲透勢，控制種子萌發(fā)時水分的進入，有效降低或消除種子吸水過快的情況，使種子有足夠時間完成生物膜的修復。

α-淀粉酶是小麥中淀粉水解的關鍵酶，直接關系到幼苗的建成[25]。本研究也表明，經(jīng)過引發(fā)后種子中可溶性蛋白增加(圖3-C)，淀粉酶活性增強，萌發(fā)率與淀粉酶活性相關，但更多地受萌發(fā)前(引發(fā)后)的淀粉酶活性影響，尤其是β-淀粉酶活性，且-0.3 MPa引發(fā)處理可以提高α-淀粉酶活性并間接促進了β-淀粉酶在萌發(fā)過程中的生成，進而促進萌發(fā)。α-淀粉酶活性的增加，可能會增加更多的可溶性糖，進而增加種子內(nèi)外水勢差，增加吸水速率。但實際結果是-0.3 MPa NaCl引發(fā)與純水引發(fā)相比，吸水速率和吸水量均較低。因此，淀粉水解后的糖可能更多地被呼吸利用或轉化為其他物質(zhì)，而不是作為溶質(zhì)降低水勢來增加吸水動力。

鉀元素為小麥必需的大量礦質(zhì)元素，而鈉元素僅為有益元素，分別以同樣摩爾濃度的NaCl和KCl溶液處理小麥種子，檢測對萌發(fā)過程的影響，有利于區(qū)分Na+和K+的生理效應。盡管有關于不同引發(fā)劑效應的研究[22]顯示了不同化合物之間引發(fā)處理結果上的差異，但以往的研究沒有去區(qū)別不同離子的效應。本研究結果表明引發(fā)處理不僅是水勢降低的效果(滲透脅迫)，也會受離子差異的影響，本例中K+效果優(yōu)于Na+，即使是-0.7 MPa處理下，K+效果也優(yōu)于Na+，但原因尚不清楚。

綜上所述，NaCl適度脅迫引發(fā)(-0.3 MPa)和純水引發(fā)均可以提高小麥種子萌發(fā)率，未經(jīng)引發(fā)和純水引發(fā)的種子在吸水過程中快速吸水傷害細胞膜，而-0.3 MPa NaCl引發(fā)處理則減少了細胞膜所受的傷害，提高淀粉酶，尤其是α-淀粉酶活性促進萌發(fā)。這種萌發(fā)率的提高，不是通過增加吸水速率或吸水量實現(xiàn)的。未來研究中，應注意引發(fā)處理的種子在萌發(fā)過程中不同時刻的物質(zhì)變化。