NCAM在成年大鼠視神經(jīng)再生模型中的表達(dá)及分布與其再生作用研究

逄雨衡 楊家輝 劉稀羽

摘要：目的? 探討神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（NCAM）在成年大鼠視神經(jīng)再生模型中的表達(dá)、分布及其在視神經(jīng)再生中的作用。方法? 購(gòu)置健康、雄性SD大鼠32只，隨機(jī)取SD大鼠8只設(shè)為空白對(duì)照組;剩余24只大鼠采用Aβ25-35寡聚體致傷SD大鼠海馬CA1區(qū)，建立阿茲海默癥（AD）動(dòng)物模型，并構(gòu)建大鼠視神經(jīng)再生模型，建模成功后隨機(jī)分為模型對(duì)照組（n=8只）、NSCs移植組（n=8只）及NCAM1基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）移植組（n=8只）?？瞻讓?duì)照組和模型對(duì)照組注入等體積的生理鹽水，NSCs移植組植入NSCs細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量3×105/L;NCAM1基因修飾NSCs移植組注入NCAM1基因修飾NSCs的細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量3×105/L，各組均完成7 d干預(yù)，比較各組學(xué)習(xí)和記憶能力、組織學(xué)檢測(cè)、海馬CAI區(qū)神經(jīng)元形態(tài)、NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA表達(dá)。結(jié)果? NCAM1基因修飾NSCs移植組潛伏期短于NSCs移植組和模型對(duì)照組，原平臺(tái)象限內(nèi)停留時(shí)間、穿環(huán)次數(shù)均長(zhǎng)（多）于NSCs移植組和模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;HE染色結(jié)果表明，NCAM1基因修飾NSCs移植組、NSCs移植組視神經(jīng)損傷下對(duì)較輕，且NCAM1基因修飾NSCs移植組視神經(jīng)損傷不明顯;NCAM1基因修飾NSCs移植組NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA水平高于NSCs移植組和模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? NCAM在成年大鼠視神經(jīng)再生模型中呈低表達(dá)，經(jīng)NCAM基因修飾NSCs移植用于成年大鼠視神經(jīng)再生模型中可提高NCAM的表達(dá)，有助于促進(jìn)視神經(jīng)再生。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)細(xì)胞黏附分子;視神經(jīng)再生模型;視神經(jīng)再生;神經(jīng)干細(xì)胞;阿茲海默癥

Abstract：Objective? To investigate the expression and distribution of nerve cell adhesion molecule （NCAM） in the optic nerve regeneration model of adult rats and its role in optic nerve regeneration. Methods? 32 healthy and male SD rats were purchased， and 8 SD rats were randomly selected as a blank control group; the remaining 24 rats were injured by Aβ25-35 oligomers in hippocampal CA1 area of SD rats to establish Alzheimer's （AD） animal model， and build rat optic nerve regeneration model， after successful modeling， randomly divided into model control group （n=8）， NSCs transplantation group （n=8） and NCAM1 gene modified neural stem cells （NSCs） transplantation Group （n = 8）. The blank control group and the model control group were injected with equal volume of normal saline. The NSCs transplantation group was implanted with NSCs cells， the number of cells was 3×105/L; the NCAM1 genetically modified NSCs transplantation group was injected with NCAM1 genetically modified NSCs， and the number of cells was 3×105/L. Each group completed a 7 d intervention to compare the learning and memory abilities， histological examination， neuronal morphology of the hippocampal CAI area， NCAM， ERK1/2， JNK and P38 mRNA expressions in each group.Results? The latency of NCAM1 gene-modified NSCs transplantation group was shorter than that of NSCs transplantation group and model control group. The residence time and the number of looping times in the original platform quadrant were both longer （more） than those of NSCs transplantation group and model control group，the differences were statistically significant （P<0.05）; HE staining results showed that： NCAM1 gene-modified NSCs transplantation group， NSCs transplantation group had less optic nerve damage， and NCAM1 gene-modified NSCs transplantation group had less obvious optic nerve injury; NCAM1 gene-modified NSCs transplantation group NCAM， ERK1/2， JNK and P38 mRNA levels were higher than NSCs transplantation group and model control group， the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion? NCAM has a low expression in the model of optic nerve regeneration in adult rats. Transplantation of NSCs modified with NCAM gene for the model of optic nerve regeneration in adult rats can increase the expression of NCAM and help promote the regeneration of optic nerve.

阿茲海默癥（AD）是一種以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]。目前臨床上對(duì)于AD病因尚未闡明，世界各國(guó)缺乏AD發(fā)生、延緩或阻止的有效方法和藥物[2]。因此，有效的藥物干預(yù)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。研究表明[3]，中樞神經(jīng)系統(tǒng)在損傷和退行性變后自身修復(fù)能力有限，而神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）作為神經(jīng)組織發(fā)育和自我修復(fù)的功能性細(xì)胞成為該領(lǐng)域研究的焦點(diǎn)。NSCs是一種具有分裂、增殖及定向分化潛能的細(xì)胞，對(duì)疾病、損傷具有反應(yīng)能力[4]。同時(shí)，該細(xì)胞具有自我更新能力，能保證腦內(nèi)細(xì)胞數(shù)量。既往研究表明[5]，NSCs移植用于AD中能進(jìn)行激活、增殖與分化，從而形成具有功能的神經(jīng)元，能治療海馬區(qū)功能障礙。而NSCs移植效果很大程度上取決于宿主神經(jīng)元形成突觸連接并建立回路，且該方法難以克服局部致傷環(huán)境對(duì)移植細(xì)胞成功率的影響[6]。神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（NCAM）是一種細(xì)胞表面糖蛋白，廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，能直接參與海馬的突觸等神經(jīng)生理功能[7]?；诖?，本研究以健康、雄性SD大鼠為對(duì)象，探討NCAM在成年大鼠視神經(jīng)再生模型中的表達(dá)及分布及其在視神經(jīng)再生中的作用，報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物? 于2018年6月～2019年4月購(gòu)置健康、雄性SD大鼠32只作為對(duì)象（購(gòu)置于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司），動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005，體重180～220 g，平均體重（200.73±25.91）g。隨機(jī)取SD大鼠8只，設(shè)為空白對(duì)照組;剩余24只大鼠采用Aβ25-35寡聚體致傷SD大鼠海馬CA1區(qū)，建立AD動(dòng)物模型，并構(gòu)建大鼠視神經(jīng)再生模型，建模成功后隨機(jī)分為模型對(duì)照組（8只）、NSCs移植組（8只）及NCAM1基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）移植組（8只）。小鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，控制室內(nèi)濕度40%～60%，溫度20～24℃。

1.2 儀器與設(shè)備? Trizol Reagent（美國(guó)Incitrogen公司）、miRNA RT-PCR試劑盒（上海生工生物）、酶標(biāo)儀（芬蘭Thermo Labsystem公司）、臺(tái)式低溫離心機(jī)，型號(hào)：Eppendroff 5810R（德國(guó)）、ABIPRISM 7000HT熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）、GOS7500型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)UVP公司）、倒置顯微鏡（奧林巴斯公司）、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó) Bio-rad 公司）、PBS（北京中杉金橋公司）、水迷宮（淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司）。

1.3方法

1.3.1建模方法? 空白對(duì)照組建立后，取剩余24只大鼠，采用Aβ25-35寡聚體致傷SD大鼠海馬CA1區(qū)，建立AD動(dòng)物模型，并構(gòu)建大鼠視神經(jīng)再生模型。Aβ25-35寡聚體制備：將Aβ25-35和六氟異丙醇（HFIP）提前放在冰盒上預(yù)冷，每1 mg Aβ25-35加入220 μl HFIP，該步驟在冰上操作。蓋上管蓋在室溫放置60 min，使Aβ25-35充分溶解。將溶解好的Aβ25-35放回冰上10 min后置于通風(fēng)櫥內(nèi)揮發(fā)、過(guò)夜[8]。次日打開(kāi)通? 風(fēng)櫥排風(fēng)2 h。大體可見(jiàn)片狀沉淀。在超凈臺(tái)內(nèi)向? ? ?其離心管加入44 μl二甲基亞砜，吹打混勻后，每 管加9386 μl無(wú)酚紅DMEM/F12培養(yǎng)基。4℃孵? ? 育24 h。隔日低溫離心機(jī)4 ℃、12000 r/min離心? 10 min后，轉(zhuǎn)移上清液至新管，分裝放入-20 ℃冰 箱儲(chǔ)存，儲(chǔ)存濃度為100 μmol/L，原子力顯微鏡鑒 定Aβ25-35寡聚體。大鼠適應(yīng)1周后，10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉后，將大鼠固定在立體 定向儀上。采用BAS立體定向儀，海馬定位參照Giovannelli等的方法。頭部備皮，常規(guī)消毒海，馬定位前囟后3.0 mm，中縫旁開(kāi)2.0 mm，硬膜下2.9 mm。鉆開(kāi)顱骨后，用微量進(jìn)樣器5 min內(nèi)緩慢注入Aβ25-35寡聚體5 μl，注射完畢后，針在里面停留25 min，緩慢拔出，然后用同樣的方法再注射另一側(cè)，縫合皮膚，預(yù)防感染;完成AD動(dòng)物模型建立，并構(gòu)建大鼠視神經(jīng)再生模型[9]。

1.3.2動(dòng)物干預(yù)? 空白對(duì)照組和模型對(duì)照組注入等體積的生理鹽水，NSCs移植組植入NSCs細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量3×105/L;NCAM1基因修飾NSCs移植組注入NCAM1基因修飾NSCs的細(xì)胞（將NSC細(xì)胞以3×105/孔的密度鋪至6孔板，AdNcam1以及AdGFP對(duì)照腺病毒分別以Mol=50的感染培養(yǎng)的NSCs），細(xì)胞數(shù)量3×105/L，各組均完成7 d干預(yù)。

1.4 觀察指標(biāo)? ①學(xué)習(xí)和記憶能力：各組干預(yù)后7 d進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，首先進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，將大鼠從不同的象限置入水池中，記錄其游到水腫平臺(tái)上的時(shí)間（潛伏期）;對(duì)于60 s內(nèi)未達(dá)到平臺(tái)，則將其引導(dǎo)到平臺(tái)上并停留5 s，將潛伏期記錄60 s，連續(xù)進(jìn)行4 d實(shí)驗(yàn);第5 s撤走水中平臺(tái)，完成空間探索實(shí)驗(yàn)。固定入水點(diǎn)，記錄60 s內(nèi)在原平臺(tái)象限內(nèi)停留時(shí)間及大鼠經(jīng)原平臺(tái)位置的次數(shù)（穿環(huán)次數(shù)）[10];②組織學(xué)檢測(cè)：各組干預(yù)后7 d每組取大鼠4只，以斷頸方式處死，取各組視神經(jīng)組織，石蠟包埋后常規(guī)制備4 μm切片，行HE染色，倒置顯微鏡下觀察組織形態(tài)[11]。③海馬CAI區(qū)神經(jīng)元形態(tài)、NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA表達(dá)：各組干預(yù)后7 d每組取大鼠4只，以斷頸方式處死，取各組海馬CAI區(qū)神經(jīng)組織，采用實(shí)時(shí)熒光PCR法測(cè)定各組NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA表達(dá)水平[12]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 采用SPSS18.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料采用[n（%）]表示，行？字2檢驗(yàn);計(jì)量資料采用（x±s）表示，行t檢驗(yàn)， P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1四組學(xué)習(xí)和記憶能力比較? NCAM1基因修飾NSCs移植組潛伏期短于NSCs移植組和模型對(duì)照組，原平臺(tái)象限內(nèi)停留時(shí)間、穿環(huán)次數(shù)均多于NSCs移植組和模型對(duì)照組（P<0.05）;NSCs移植組潛伏期短于模型對(duì)照組，原平臺(tái)象限內(nèi)停留時(shí)間、穿環(huán)次數(shù)均多于模型對(duì)照組（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2四組HE染色比較? 空白對(duì)照組未參與建模，視神經(jīng)組織未見(jiàn)損傷;模型對(duì)照組建模后未給予有效處理，視神經(jīng)損傷較為明顯，伴有大量炎癥細(xì)胞;NCAM1基因修飾NSCs移植組、NSCs移植組視神經(jīng)損傷下對(duì)較輕，且NCAM1基因修飾NSCs移植組視神經(jīng)損傷不明顯，見(jiàn)圖1。

2.3四組NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA比較? NCAM1基因修飾NSCs移植組NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA水平高于NSCs移植組和模型對(duì)照組（P<0.05）;NSCs移植組NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA水平高于模型對(duì)照組（P<0.05），見(jiàn)表2。

3討論

阿爾茨海默病是一種發(fā)病相對(duì)隱匿的、進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，臨床上以記憶障礙、視空間技能損害及執(zhí)行功能障礙的為主，影響患者健康、生活。阿爾茨海默病病因復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制尚未完全常，主要具有神經(jīng)細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)、內(nèi)分泌失衡學(xué)說(shuō)及神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣超載學(xué)說(shuō)等，而神經(jīng)突觸可塑性改變對(duì)阿爾茨海默病發(fā)生、發(fā)展的影響受到臨床重視[13]。近年來(lái)，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，NSCs移植被認(rèn)為是其中最直接最有效的方法，該細(xì)胞從胚胎或成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)、脊髓中分離培養(yǎng)出來(lái)，能分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞，具備自我更新能力，能保證腦內(nèi)細(xì)胞數(shù)。

在本研究中，NCAM1基因修飾NSCs移植組潛伏期短于NSCs移植組和模型對(duì)照組（P<0.05）;原平臺(tái)象限內(nèi)停留時(shí)間、穿環(huán)次數(shù)均多于NSCs移植組和模型對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明NCAM1基因修飾NSCs移植能減輕AD大鼠視神經(jīng)損傷，能延緩病情發(fā)展，有望成為AD新的靶點(diǎn)。NCAM1屬于是一種細(xì)胞表明糖蛋白，為細(xì)胞粘附分子，且多數(shù)存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，能直接參與海馬突觸等神經(jīng)生理功能。既往研究表明，NCAM1能調(diào)節(jié)海馬突出的可塑性，能進(jìn)行突觸性與結(jié)構(gòu)維護(hù)，在發(fā)育期即可表達(dá)，對(duì)海馬神經(jīng)的形態(tài)、功能發(fā)育具有重要的作用。臨床研究表明，在突觸塑形與維持突觸結(jié)構(gòu)方面，NCAM1能發(fā)揮良好的促進(jìn)作用，其具有較強(qiáng)的粘附能力，能調(diào)節(jié)細(xì)胞相關(guān)功能。本研究中，HE染色結(jié)果表明：NCAM1基因修飾NSCs移植組、NSCs移植組視神經(jīng)損傷下對(duì)較輕，且NCAM1基因修飾NSCs移植組視神經(jīng)損傷不明顯，說(shuō)明NCAM基因修飾NSCs移植能減輕AD大鼠視神經(jīng)損傷，可能與NCAM基因修飾后能增強(qiáng)NSCs干預(yù)作用，能發(fā)揮不同方法優(yōu)勢(shì)。為了進(jìn)一步分析NCAM基因修飾NSCs移植在AD大鼠中的作用，本研究中通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)對(duì)其相關(guān)基因進(jìn)程測(cè)定，結(jié)果顯示，NCAM1基因修飾NSCs移植組NCAM、ERK1/2、JNK和P38 mRNA水平高于NSCs移植組和模型對(duì)照組（P<0.05），進(jìn)一步驗(yàn)證了NCAM基因修飾NSCs移植在AD大鼠中的作用，能改善AD大鼠視神經(jīng)損傷。

綜上所述，NCAM在成年大鼠視神經(jīng)再生模型中呈低表達(dá)，經(jīng)NCAM基因修飾NSCs移植用于成年大鼠視神經(jīng)再生模型中能提高NCAM表達(dá)，有助于促進(jìn)視神經(jīng)再生。

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收稿日期：2020-02-12;修回日期：2020-02-21

編輯/成森